本發(fā)明屬于分子生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種結(jié)核分枝桿菌85bmrna的實(shí)時(shí)熒光rt-pcr檢測方法及試劑盒。
背景技術(shù)：
：結(jié)核病(tuberculosis，tb)是由結(jié)核分枝桿菌(mycobacteriumtuberculosis，mtb)引起的傳染性疾病。2015年，世界范圍內(nèi)估計(jì)有1040萬新發(fā)病例，約有150萬人死于結(jié)核病，我國2014年的新發(fā)肺結(jié)核人數(shù)為93萬，位居全球第三。結(jié)核病已成為全球因傳染而死亡的主要疾病之一。然而，現(xiàn)時(shí)關(guān)于tb疫苗的研究暫無突破性的進(jìn)展，因此，結(jié)核病的早期診斷、早期治療、阻斷結(jié)核分枝桿菌的傳染就顯得尤為重要。結(jié)核病要想取得有效防控，這就要求我們必須要有一個(gè)有效的診斷方法和有效的治愈評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)。痰涂片檢查、分枝桿菌培養(yǎng)以及結(jié)核菌素試驗(yàn)等方法是目前常用的結(jié)核桿菌檢測方法，但這些傳統(tǒng)檢測方法不利于快速準(zhǔn)確地診斷肺結(jié)核以及療效的評(píng)價(jià)，達(dá)不到早期診斷效果：痰涂片容易受到痰液標(biāo)本質(zhì)量影響，造成漏檢；培養(yǎng)法雖然是金標(biāo)準(zhǔn)，但其報(bào)告周期長達(dá)8周，難以滿足及時(shí)監(jiān)測的要求；結(jié)核菌素試驗(yàn)則會(huì)受到患者免疫狀態(tài)和接種卡介苗的影響，無法區(qū)分潛伏感染。因此，急需開發(fā)快速準(zhǔn)確的檢測方法。隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，相關(guān)的分子生物學(xué)技術(shù)也逐漸應(yīng)用于結(jié)核病的快速診斷。1989年，hance等最先將pcr技術(shù)應(yīng)用于tb的檢測，其突出特點(diǎn)是靈敏度高，與傳統(tǒng)方法相比，其敏感性得到了顯著的提高。此外，pcr檢測的報(bào)告周期短，最快可在一天內(nèi)完成，這在tb的早期診斷中有著獨(dú)到的優(yōu)勢。2000年，日本學(xué)者notomi開發(fā)了一項(xiàng)可取代pcr的新dna擴(kuò)增檢測技術(shù)——環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(lamp技術(shù))。中國專利申請(qǐng)201110246388公開了一種利用lamp技術(shù)快速鑒定結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌的方法。該方法根據(jù)結(jié)核分枝桿菌與非結(jié)核分枝桿菌16srna的特異性設(shè)計(jì)了4條特異性引物，采用四條特異性引物及一種具有鏈置換活性的dna聚合酶，在63～65℃對(duì)樣品dna模板進(jìn)行擴(kuò)增，通過加入sybrgreeni觀察顏色變化來判斷擴(kuò)增與否。但該方法檢測的仍然是結(jié)核分枝桿菌的特異性dna序列。這些基于dna的體外擴(kuò)增檢測方法存在同樣的問題：dna是穩(wěn)定的核酸分子，其半衰期長，基于dna的體外擴(kuò)增，其模板既可以來自于活菌也可來自死菌。因此不能作為結(jié)核分枝桿菌活菌的診斷。在細(xì)菌死亡降解的過程中，rna會(huì)伴隨細(xì)菌死亡而降解消失，在死菌中不易被檢測到。一般原核生物的信使rna(mrna)半衰期很短，僅存在于有代謝活性的菌中，它可以作為活動(dòng)性結(jié)核的重要判斷標(biāo)志。有文章指出，tbdna的靈敏度為96％，而tbrna的靈敏度可達(dá)100％。實(shí)時(shí)熒光pcr(rt-pcr)比普通pcr進(jìn)行定量分析時(shí)靈敏度更高，定量更精確，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)檢測。中國專利申請(qǐng)201410036985公開了一種用于檢測結(jié)核分枝桿菌的引物和探針及其應(yīng)用，提供了用于檢測結(jié)核分枝桿菌mrna的組合物，所述組合物由一個(gè)引物對(duì)和一個(gè)探針組成。實(shí)時(shí)熒光定量pcr相較于普通pcr具有更高的靈敏度，然而其特異性相對(duì)一般，且容易因樣本中抑制物的抑制作用，影響檢測結(jié)果的穩(wěn)定性。另外，因mrna不易提取，如采用trizol加玻璃珠的提取方法，利用該專利申請(qǐng)公布的方法，僅可檢測到每毫升15000細(xì)菌數(shù)的結(jié)核分枝桿菌標(biāo)本，其檢出限較高，難以適應(yīng)臨床需要。因此，亟待開發(fā)一種兼具靈敏度、特異性、穩(wěn)定性，檢出限更低的快速、高效檢測活性結(jié)核分枝桿菌的方法。85b蛋白是結(jié)核桿菌的主要分泌性蛋白抗原，其編碼的mrna分子在活性結(jié)核分枝桿菌中含量較大。開發(fā)一種以結(jié)核分枝桿菌特異的85bmrna為檢測靶標(biāo)，檢出率高、靈敏度高、特異性高、穩(wěn)定性好、檢出限更低、可分辨活菌和死菌的結(jié)核分枝桿菌rna檢測試劑盒具有重要意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種用于結(jié)核分枝桿菌檢測的試劑盒及方法，使其可識(shí)別活菌和死菌，且靈敏度、特異性、穩(wěn)定性更高、檢出限更低。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是提供一種結(jié)核分枝桿菌85bmrna的實(shí)時(shí)熒光rt-pcr檢測方法及試劑盒，實(shí)現(xiàn)對(duì)結(jié)核分枝桿菌85bmrna的快速檢測，應(yīng)用極為方便。一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種檢測結(jié)核分枝桿菌85bmrna的檢測引物組和檢測探針組；所述的檢測引物組和檢測探針組是：檢測引物組1和檢測探針組1；或檢測引物組2和檢測探針組2。所述的檢測引物組1包括以下4條結(jié)核分枝桿菌85bmrna特異性引物序列：引物tb85bmrna-f1，其核苷酸序列如seqidno：1所示：5’-ttcacagcggcacaacaatatgtc-3’；引物tb85bmrna-r1，其核苷酸序列如seqidno：2所示：5’-gactgtgcgttcctgatcgag-3’；引物tb85bmrna-f2，其核苷酸序列如seqidno：3所示：5’-cggtttatttcgacagcgaagac-3’；引物tb85bmrna-r2，其核苷酸序列如seqidno：4所示：5’-aactggtttcgcaccgtgtc-3’；所述的檢測探針組1選自探針tb85bmrna-p1和探針tb85bmrna-p2中的至少一種；所述的探針tb85bmrna-p1的序列為seqidno：5所示：5’-aaccatgcaatgatgctcgt-3’；所述的探針tb85bmrna-p2的核苷酸序列為seqidno：6所示：5’-caatgatgctcgtgcaacacct-3’；所述的探針tb85bmrna-p1和探針tb85bmrna-p2的核苷酸序列的5’端連接熒光基團(tuán)fam，3’端連接猝滅基團(tuán)bhq1。所述的檢測引物組2包括以下4條結(jié)核分枝桿菌85bmrna特異性引物序列：引物tb85bmrna-f1’，其核苷酸序列如seqidno：7所示：5’-cacagcggcacaacaatatgtcg-3’；引物tb85bmrna-r1’，其核苷酸序列如seqidno：8所示：5’-actgtgcgttcctgatcgagc-3’；引物tb85bmrna-f2’，其核苷酸序列如seqidno：9所示：5’-tttacagccaagcggtcgag-3’；引物tb85bmrna-r2’，其核苷酸序列如seqidno：10所示：5’-cgccgggaatttcgacacga-3’；所述的檢測探針組2選自探針tb85bmrna-p1’和探針tb85bmrna-p2’中的至少一種；所述的探針tb85bmrna-p1’的序列為seqidno：11所示：5’-atgatgctcgtgcaacacctgc-3’；所述的探針tb85bmrna–p2’的核苷酸序列為seqidno：12所示：5’-acgaaaccatgcaatgatgctcgtgc-3’；所述的探針tb85bmrna-p1’和探針tb85bmrna-p2’核苷酸序列的5’端連接熒光基團(tuán)fam，3’端連接猝滅基團(tuán)bhq1。另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種檢測結(jié)核分枝桿菌85bmrna的試劑盒。所述的試劑盒包括本發(fā)明所述的檢測引物組和檢測探針組。所述的試劑盒還包括酶系、pcr反應(yīng)試劑、陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品。所述的酶系包括tfldna聚合酶、mmlv逆轉(zhuǎn)錄酶和stoffel片段；所述的pcr反應(yīng)試劑包括：ph8.3～8.5的tris-h2so4，ph7.9的3-(n-嗎啉基)丙磺酸，檸檬酸鈉，(nh4)2so4，mgso4，聚氧乙烯月桂醚，乙?；Ｑ灏椎鞍缀蚫ntp；所述的陽性質(zhì)控品為：以結(jié)核分枝桿菌tb的基因組dna為pcr模板，利用檢測引物組1或檢測引物組2擴(kuò)增出的結(jié)核分枝桿菌tb的85bmrna基因組核酸片段，根據(jù)常規(guī)基因工程方法合成的ms2假病毒；所述的陰性質(zhì)控品為焦碳酸二乙酯(depc)處理h2o。再一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種檢測結(jié)核分枝桿菌的方法，所述的方法指利用本發(fā)明所述的結(jié)核分枝桿菌85bmrna的檢測引物組和檢測探針組，使用實(shí)時(shí)熒光rt-pcr技術(shù)，檢測結(jié)核分枝桿菌85bmrna；所述的檢測方法包括以下步驟：1、樣本采集：采集痰液樣品，取約1～2ml，置于50ml潔凈離心管中；2、從痰液樣品中提取rna：a、痰液樣品處理：在步驟1采集的痰液樣品中加入2～3倍體積4％的naoh溶液，渦旋振蕩至痰液呈液體狀(無明顯固狀物)；加入pbs至50ml，4000rpm離心20min；棄上清，加入2mlpbs洗滌沉淀，吸取1ml為待測樣品；b、提取rna：提取步驟2-a得到的待測樣品中的總rna；3、實(shí)時(shí)熒光rt-pcr反應(yīng)：以步驟(2)提取的待測痰液樣品的總rna為模板，利用本發(fā)明所述的一種檢測結(jié)核分枝桿菌85bmrna的檢測引物組和檢測探針組或檢測試劑盒，配置實(shí)時(shí)熒光rt-pcr反應(yīng)體系，設(shè)置實(shí)時(shí)熒光rt-pcr熱循環(huán)程序，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光rt-pcr擴(kuò)增；4、結(jié)果分析和判定：陽性：檢測樣本ct值小于等于38.0，且曲線有明顯的指數(shù)增長期；可疑：檢測樣本ct值大于38.0且小于40.0，重復(fù)一次實(shí)驗(yàn)，如果ct值小于40.0，且曲線有明顯的指數(shù)增長期，為陽性，否則為陰性；陰性：檢測不到樣本ct值或ct值為40。所述的檢測方法中，所述的實(shí)時(shí)熒光rt-pcr反應(yīng)體系包括：進(jìn)一步地，所述的實(shí)時(shí)熒光rt-pcr反應(yīng)體系的pcr反應(yīng)液包括：ph8.3～8.5的tris-h2so440～65mm、ph7.9的3-(n-嗎啉基)丙磺酸10～30mm、檸檬酸鈉2.2～3.8mm、(nh4)2so410～22mm、mgso44～9mm、質(zhì)量百分比為0.10％～0.5％的聚氧乙烯月桂醚、質(zhì)量體積比為0.01％～0.1％的乙?；Ｑ灏椎鞍?、dntp0.23～0.52mm、檢測引物組550～650nm和檢測探針組100～250nm；進(jìn)一步地，所述的實(shí)時(shí)熒光rt-pcr反應(yīng)體系的酶混合物包括：tfldna聚合酶、mmlvdna聚合酶和stoffel片段；其中，tfldna聚合酶和mmlvdna聚合酶的體積比為4：1～1：1，tfldna聚合酶和stoffel片段等體積加入。所述的檢測方法中，所述的實(shí)時(shí)熒光rt-pcr反應(yīng)熱循環(huán)程序?yàn)椋旱谝徊剑?5℃10～20分鐘，94～96℃8～12分鐘；第二步：94～95℃15～30秒，62～68℃15～75秒，68～72℃32～40秒，3～9個(gè)循環(huán)；第三步：93～95℃15～20秒，62℃15～30秒，68～72℃20秒，12個(gè)循環(huán)；第四步：93～95℃15秒，58～62℃30～60秒，40個(gè)循環(huán)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的實(shí)時(shí)熒光rt-pcr反應(yīng)體系的pcr反應(yīng)液包括：ph8.3的tris-h2so440mm、ph7.9的3-(n-嗎啉基)丙磺酸10mm、檸檬酸鈉2.2mm、(nh4)2so410mm、mgso44mm、質(zhì)量百分比為0.10％的聚氧乙烯月桂醚、質(zhì)量體積比為0.01％的乙?；Ｑ灏椎鞍?、dntp0.23mm、檢測引物組550nm和檢測探針組100nm；在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的實(shí)時(shí)熒光rt-pcr反應(yīng)體系的pcr反應(yīng)液包括：ph8.5的tris-h2so465mm、ph7.9的3-(n-嗎啉基)丙磺酸30mm、檸檬酸鈉3.8mm、(nh4)2so422mm、mgso49mm、質(zhì)量百分比為0.5％的聚氧乙烯月桂醚、質(zhì)量體積比為0.1％的乙?；Ｑ灏椎鞍住ntp0.52mm、檢測引物組650nm和檢測探針組250nm；在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的實(shí)時(shí)熒光rt-pcr反應(yīng)體系的pcr反應(yīng)液包括：ph8.5的tris-h2so448mm、ph7.9的3-(n-嗎啉基)丙磺酸18mm、檸檬酸鈉3mm、(nh4)2so420mm、mgso47mm、brij-35質(zhì)量百分比為0.10％、乙?；Ｑ灏椎鞍踪|(zhì)量體積百分比為0.01％、dntp0.35mm、檢測引物組600nm、檢測探針組200nm；在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的實(shí)時(shí)熒光rt-pcr反應(yīng)體系的酶混合物包括：0.4μl的tfldna聚合酶、0.1μl的mmlvdna聚合酶和0.4μl的stoffel片段；在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的實(shí)時(shí)熒光rt-pcr反應(yīng)體系的酶混合物包括：1μl的tfldna聚合酶、0.5μl的mmlvdna聚合酶和1μl的stoffel片段；在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的實(shí)時(shí)熒光rt-pcr反應(yīng)熱循環(huán)程序?yàn)椋旱谝徊剑?5℃10分鐘，94℃8分鐘；第二步：94℃15秒，62℃15秒，68℃32秒，3個(gè)循環(huán)；第三步：93℃15秒，62℃15秒，68℃20秒，12個(gè)循環(huán)；第四步：93℃15秒，58℃30秒，40個(gè)循環(huán)；在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的實(shí)時(shí)熒光rt-pcr反應(yīng)熱循環(huán)程序?yàn)椋旱谝徊剑?5℃20分鐘，96℃12分鐘；第二步：95℃30秒，68℃75秒，72℃40秒，9個(gè)循環(huán)；第三步：95℃20秒，62℃30秒，72℃20秒，12個(gè)循環(huán)；第四步：95℃15秒，62℃60秒，40個(gè)循環(huán)；在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的實(shí)時(shí)熒光rt-pcr反應(yīng)熱循環(huán)程序?yàn)椋旱谝徊剑?2℃15分鐘，95℃10分鐘；第二步：95℃15秒，64℃15秒，72℃32秒，循環(huán)5次；第三步：95℃15秒，62℃15秒，72℃20秒，循環(huán)12次；第四步：95℃15秒，60℃45秒，循環(huán)40次。本發(fā)明提供了一種結(jié)核分枝桿菌85bmrna的實(shí)時(shí)熒光rt-pcr檢測方法及試劑盒，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)結(jié)核分枝桿菌中的85bmrna的快速檢測，特異性強(qiáng)，靈敏度高，穩(wěn)定性好，應(yīng)用極為方便。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：1、本發(fā)明提供了高靈敏和高特異的rtpcr檢測引物組和檢測探針，用以特異性地?cái)U(kuò)增結(jié)核分枝桿菌中的85bmrna，而不會(huì)將結(jié)核分枝桿菌的其他轉(zhuǎn)錄本擴(kuò)增出來。與常規(guī)rt-pcr相比，本發(fā)明在rt-pcr擴(kuò)增時(shí)，使用了2對(duì)pcr特異引物，可同時(shí)完成巢氏擴(kuò)增和rt-pcr，克服了常規(guī)rt-pcr特異性不足的缺點(diǎn)，四條引物之間的擴(kuò)增競爭性小，擴(kuò)增平衡性比目前常用的引物高。2、本發(fā)明基于上述高靈敏和高特異的檢測引物組和檢測探針，建立了一套相匹配的高效pcr熱循環(huán)反應(yīng)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了逆轉(zhuǎn)錄pcr、巢氏擴(kuò)增和實(shí)時(shí)熒光定pcr在一管中同時(shí)進(jìn)行。操作更加簡便，避免了多步進(jìn)行時(shí)易造成污染的缺點(diǎn)，很大程度地提高結(jié)核分枝桿菌85bmrna的檢出率。3、本發(fā)明引入了更適合rna擴(kuò)增的tris-3-(n-嗎啉基)丙磺酸-檸檬酸鈉緩沖液替代常規(guī)的tris-hcl緩沖液，使得檢測的靈敏度和特異性得到很大程度的增強(qiáng)，避免了普通rt-pcr方法特異性不高，以及無法對(duì)低濃度模版進(jìn)行定量的缺點(diǎn)。4、本發(fā)明還引入了stoffel片段和tfldna聚合酶的雙聚合酶的擴(kuò)增方法，提高了檢測的特異性，同時(shí)抗樣本抑制物的抑制作用的能力增強(qiáng)，使得本試劑盒可耐受更多的模版，提高了檢測靈敏度及檢測結(jié)果的穩(wěn)定性。其中stoffel片段為去除5’-3’外切酶活性結(jié)構(gòu)域的taqdna聚合酶，去除5’-3’外切酶活性的同時(shí)，恢復(fù)了少量3’-5’外切酶的校正活性，彌補(bǔ)了tfldna聚合酶特異性不足的缺陷。而tfldna聚合酶則提供切除taqman探針的5’-3’外切酶活性。另一方面，stoffel片段和tfldna聚合酶耐抑制劑能力都較強(qiáng)，使得根據(jù)本發(fā)明構(gòu)建的熒光rt-pcr試劑盒中可以加入更多的模版，提升靈敏度。5、本發(fā)明可檢測到1×103個(gè)菌/ml標(biāo)準(zhǔn)品中的結(jié)核分枝桿菌85bmrna，靈敏度高，檢出限更低，適用于臨床。綜上所述，本發(fā)明提供了一種兼具靈敏度、特異性、穩(wěn)定性，且檢出限更低的結(jié)核分枝桿菌85bmrna實(shí)時(shí)熒光pcr檢測方法及試劑盒，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)結(jié)核分枝桿菌85bmrna的快速檢測，應(yīng)用極為方便。由于引入了特異性擴(kuò)增引物和熒光探針及與之相匹配的高效pcr熱循環(huán)反應(yīng)系統(tǒng)，使得檢測的靈敏度和特異性得到很大程度的增強(qiáng)，避免了其他檢測方法特異性不高的缺點(diǎn)。另外，由于引入了更適合rna擴(kuò)增的tris-3-(n-嗎啉基)丙磺酸-檸檬酸鈉緩沖液，從而避免了普通rt-pcr方法特異性不高、無法對(duì)低濃度模版進(jìn)行定量的缺點(diǎn)。另外，本發(fā)明還引入了stoffel片段和tfldna聚合酶的雙聚合酶的擴(kuò)增方法，提高檢測特異性的同時(shí)，抗樣本抑制物的抑制作用的能力增強(qiáng)，可耐受更多的模版，提高了檢測靈敏度及檢測結(jié)果的穩(wěn)定性?；谏鲜鰞?yōu)點(diǎn)，本發(fā)明的試劑盒適合在各級(jí)疾控單位和醫(yī)院進(jìn)行推廣，具有廣泛的應(yīng)用前景。附圖說明圖1為對(duì)比例1的實(shí)時(shí)熒光rt-pcr擴(kuò)增結(jié)果圖。擴(kuò)增曲線1～5分別代表第1～5組實(shí)時(shí)熒光rt-pcr的擴(kuò)增結(jié)果。圖2為實(shí)驗(yàn)例1的實(shí)時(shí)熒光rt-pcr擴(kuò)增結(jié)果圖。從左到右依次為1×107、1×106、1×105、1×104、1×103個(gè)菌/ml的痰液樣品的檢測結(jié)果。具體實(shí)施方式實(shí)施例1用于檢測結(jié)核分枝桿菌85bmrna的試劑盒該試劑盒包括：結(jié)核分枝桿菌85bmrna的檢測引物組和檢測探針；其中，檢測引物組包括：引物tb85bmrna-f1：5’-ttcacagcggcacaacaatatgtc-3’；引物tb85bmrna-r1：5’-gactgtgcgttcctgatcgag-3’；引物tb85bmrna-f2：5’-cggtttatttcgacagcgaagac-3’；引物tb85bmrna-r2：5’-aactggtttcgcaccgtgtc-3’。檢測探針組包括：探針tb85bmrna-p1：5’-aaccatgcaatgatgctcgt-3’；探針tb85bmrna-p2：5’-caatgatgctcgtgcaacacct-3’；探針tb85bmrna-p1和探針tb85bmrna-p2的核苷酸序列的5’端連接熒光基團(tuán)fam，3’端連接猝滅基團(tuán)bhq1。實(shí)施例2用于檢測結(jié)核分枝桿菌85bmrna的試劑盒該試劑盒包括：結(jié)核分枝桿菌85bmrna的檢測引物組和檢測探針；其中，檢測引物組包括：引物tb85bmrna-f1’：5’-cacagcggcacaacaatatgtcg-3’；引物tb85bmrna-r1’：5’-actgtgcgttcctgatcgagc-3’；引物tb85bmrna-f2’：5’-tttacagccaagcggtcgag-3’；引物tb85bmrna-r2’：5’-cgccgggaatttcgacacga-3’。檢測探針組包括：探針tb85bmrna-p1’：5’atgatgctcgtgcaacacctgc-3’；探針tb85bmrna-p2’：5’-acgaaaccatgcaatgatgctcgtgc-3’；探針tb85bmrna-p1’和探針tb85bmrna-p2’核苷酸序列的5’端連接熒光基團(tuán)fam，3’端連接猝滅基團(tuán)bhq1。實(shí)施例3用于檢測結(jié)核分枝桿菌85bmrna的試劑盒該試劑盒包括：(1)實(shí)施例1中的檢測引物組和檢測探針；(2)酶系：tfldna聚合酶、mmlvdna聚合酶和stoffel片段；(3)pcr反應(yīng)試劑：ph8.5的tris-h2so4，ph7.9的3-(n-嗎啉基)丙磺酸，檸檬酸鈉，(nh4)2so4，mgso4，brij-35，乙酰化牛血清白蛋白和dntp；(4)陽性質(zhì)控品：以結(jié)核分枝桿菌tb的基因組dna為pcr模板，利用檢測引物組1或檢測引物組2擴(kuò)增出的結(jié)核分枝桿菌tb的85bmrna基因組核酸片段，根據(jù)常規(guī)基因工程方法合成的ms2假病毒；(5)陰性質(zhì)控品：depc處理h2o。實(shí)施例4結(jié)核分枝桿菌85bmrna的實(shí)時(shí)熒光rt-pcr檢測方法1、樣本采集：采集痰液樣品，取約1～2ml，置于50ml潔凈離心管中；2、從痰液樣品中提取rna：a、痰液樣品處理：在步驟1采集的痰液樣品中加入2～3倍體積4％的naoh溶液，渦旋振蕩至痰液呈液體狀(無明顯固狀物)；加入pbs至50ml，4000rpm離心20min；棄上清，加入2mlpbs洗滌沉淀，吸取1ml為待測樣品；b、提取rna：采用rna提取試劑盒(購自天根生化公司的培養(yǎng)細(xì)胞/細(xì)菌總rna提取試劑盒，貨號(hào)dp430)提取步驟2a得到的待測樣品中的總rna；3、檢測試劑盒：采用實(shí)施例3提供的試劑盒。4、檢測方法：a、配制實(shí)時(shí)熒光rt-pcr反應(yīng)體系的pcr反應(yīng)液；pcr反應(yīng)液包括：ph8.5的tris-h2so448mm、ph7.9的3-(n-嗎啉基)丙磺酸18mm、檸檬酸鈉3mm、(nh4)2so420mm、mgso47mm、brij-35質(zhì)量百分比為0.10％、乙?；Ｑ灏椎鞍踪|(zhì)量體積百分比為0.01％、dntp0.35mm、引物tb85bmrna-f1200nm、引物tb85bmrna-r1200nm、引物tb85bmrna-f2100nm、引物tb85bmrna-r2100nm、探針tb85bmrna-p1100nm和探針tb85bmrna-p2100nm。b、配制實(shí)時(shí)熒光rt-pcr反應(yīng)體系：實(shí)時(shí)熒光rt-pcr反應(yīng)體系為：其中實(shí)時(shí)熒光rt-pcr反應(yīng)體系的酶混合物包括：1μl的tfldna聚合酶(美國abi公司，2u/μl)、0.5μl的mmlvdna聚合酶(深圳菲鵬生物，200u/μl)和1μl的stoffel片段(cetus公司，5u/μl)；實(shí)時(shí)熒光rt-pcr反應(yīng)體系的模板為：步驟2-b提取的總rna。c、實(shí)時(shí)熒光rt-pcr反應(yīng)：將各反應(yīng)管放入定量pcr儀器的反應(yīng)槽內(nèi)，設(shè)置各檢測的名稱和熒光基團(tuán)種類(設(shè)置85bmrna的報(bào)告基團(tuán)為fam，淬滅基團(tuán)選擇none)，設(shè)定循環(huán)條件：abi7500熒光pcr儀循環(huán)條件為：第一步：42℃15分鐘，95℃10分鐘；第二步：95℃15秒，64℃15秒，72℃32秒，循環(huán)5次；第三步：95℃15秒，62℃15秒，72℃20秒，循環(huán)12次；第四步：95℃15秒，60℃45秒，循環(huán)40次；60℃時(shí)收集熒光。d、結(jié)果分析和判定：結(jié)果分析條件設(shè)定：設(shè)置基線：使用abi7500熒光pcr儀軟件默認(rèn)設(shè)置，可根據(jù)具體情況對(duì)基線適當(dāng)調(diào)整；設(shè)置閾值：以閾值線剛超過陰性對(duì)照擴(kuò)增曲線(無規(guī)則的噪音線)的最高點(diǎn)。結(jié)果判斷：陽性：檢測樣本ct值小于等于38.0，且曲線有明顯的指數(shù)增長期；可疑：檢測樣本ct值大于38.0且小于40.0，重復(fù)一次實(shí)驗(yàn)，如果ct值小于40.0，且曲線有明顯的指數(shù)增長期，為陽性，否則為陰性；陰性：檢測不到樣本ct值或ct值為40。本實(shí)施例擴(kuò)增曲線良好，擴(kuò)增ct值為16.0，檢測靈敏度高，特異性強(qiáng)。對(duì)比例1結(jié)核分枝桿菌85bmrna的實(shí)時(shí)熒光rt-pcr檢測方法樣本采集、從痰液樣品中提取rna及檢測試劑盒同實(shí)施例4。檢測方法：1、分別配制實(shí)時(shí)熒光rt-pcr反應(yīng)體系的pcr反應(yīng)液的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組：實(shí)時(shí)熒光rt-pcr反應(yīng)體系的pcr反應(yīng)液的實(shí)驗(yàn)組包括：ph8.5的tris-h2so448mm、ph7.9的3-(n-嗎啉基)丙磺酸18mm、檸檬酸鈉3mm、(nh4)2so420mm、mgso47mm、brij-35質(zhì)量百分比為0.10％、乙酰化牛血清白蛋白質(zhì)量體積百分比為0.01％、dntp0.35mm、引物tb85bmrna-f1200nm、引物tb85bmrna-r1200nm、引物tb85bmrna-f2100nm、引物tb85bmrna-r2100nm、探針tb85bmrna-p1100nm和探針tb85bmrna-p2100nm；實(shí)時(shí)熒光rt-pcr反應(yīng)體系的pcr反應(yīng)液的對(duì)照組包括：ph8.5的tris-hcl66mm、(nh4)2so420mm、mgso45mm、brij-35質(zhì)量百分比為0.10％、乙?；Ｑ灏椎鞍踪|(zhì)量體積百分比為0.01％、dntp0.35mm、引物tb85bmrna-f1200nm、引物tb85bmrna-r1200nm、引物tb85bmrna-f2100nm、引物tb85bmrna-r2100nm、探針tb85bmrna-p1100nm和探針tb85bmrna-p2100nm；2、分別配制配制實(shí)時(shí)熒光rt-pcr反應(yīng)體系的酶混合物的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組：實(shí)時(shí)熒光rt-pcr反應(yīng)體系的酶混合物的實(shí)驗(yàn)組包括：1μl的tfldna聚合酶(美國abi公司，2u/μl)、0.5μl的mmlvdna聚合酶(深圳菲鵬生物，200u/μl)和1μl的stoffel片段(cetus公司，5u/μl)；實(shí)時(shí)熒光rt-pcr反應(yīng)體系的酶混合物的對(duì)照組包括：2μl的taqdna聚合酶(neb公司，5u/μl)和0.5μl的mmlvdna聚合酶(深圳菲鵬生物，200u/μl)。3、配制實(shí)時(shí)熒光rt-pcr反應(yīng)體系：利用步驟1配制的實(shí)時(shí)熒光rt-pcr反應(yīng)體系的pcr反應(yīng)液的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組、步驟2配制的實(shí)時(shí)熒光rt-pcr反應(yīng)體系的酶混合物的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，配制5組實(shí)時(shí)熒光rt-pcr反應(yīng)體系，分別為：所述的模板同實(shí)施例4。4、實(shí)時(shí)熒光rt-pcr反應(yīng)及結(jié)果分析和判定同實(shí)施例4，5組實(shí)時(shí)熒光rt-pcr反應(yīng)結(jié)果記錄如下：組號(hào)擴(kuò)增結(jié)果(ct值)116.402無擴(kuò)增319.354無擴(kuò)增520.23擴(kuò)增曲線如圖1所示，擴(kuò)增曲線1～5分別代表第1～5組實(shí)時(shí)熒光pcr反應(yīng)結(jié)果。由上表及圖1分析可知，當(dāng)樣本量5μl時(shí)，使用taqdna聚合酶和mmlvdna聚合酶即可以正常擴(kuò)增(第5組)；由第2組和第4組結(jié)果可知，當(dāng)樣本量增加到27.5μl時(shí)，僅使用taqdna聚合酶和mmlvdna聚合酶無法擴(kuò)增；而由第1組和第3組結(jié)果可知，當(dāng)樣本量增加到27.5μl時(shí)，使用stoffel片段、tfldna聚合酶以及mmlvdna聚合酶，可以正常擴(kuò)增。另外，由第1組和第3組結(jié)果可知，相比傳統(tǒng)的tris-hcl作為緩沖液的實(shí)時(shí)熒光rt-pcr反應(yīng)液，使用tris-h2so4、3-(n-嗎啉基)丙磺酸、檸檬酸鈉組成的緩沖液，靈敏度更高。說明利用本發(fā)明所述的結(jié)核分枝桿菌85bmrna的實(shí)時(shí)熒光rt-pcr檢測試劑盒進(jìn)行檢測，檢測特異性更高，可耐受的模板量更多，靈敏度更高，檢測結(jié)果更穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)例1用于檢測結(jié)核分枝桿菌85bmrna的實(shí)時(shí)熒光pcr試劑盒和檢測方法的敏感性分析采集自廣州市胸科醫(yī)院的痰液樣品，取痰液培養(yǎng)后，稀釋至107、106、105、104、103個(gè)菌/ml(使用麥?zhǔn)媳葷岱y定)。對(duì)測定好濃度的樣本，按照實(shí)施例4所述的方法提取rna，及進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光rt-pcr反應(yīng)。擴(kuò)增曲線見圖2，從左到右依次為1×107、1×106、1×105、1×104、1×103個(gè)菌/ml的痰液樣品的擴(kuò)增結(jié)果。結(jié)果分析可知，本發(fā)明所述檢測結(jié)核分枝桿菌85bmrna的實(shí)時(shí)熒光pcr試劑盒和檢測方法可檢測到低至1×103個(gè)菌/ml的痰液樣品中的結(jié)核分枝桿菌85bmrna，檢出限更低，靈敏度高，適用于臨床。sequencelisting<110>廣州海力特生物科技有限公司<120>結(jié)核分枝桿菌85bmrna的實(shí)時(shí)熒光rt-pcr檢測方法及試劑盒<130>20170413<160>12<170>patentinversion3.5<210>1<211>24<212>dna<213>人工序列<400>1ttcacagcggcacaacaatatgtc24<210>2<211>21<212>dna<213>人工序列<400>2gactgtgcgttcctgatcgag21<210>3<211>23<212>dna<213>人工序列<400>3cggtttatttcgacagcgaagac23<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列<400>4aactggtttcgcaccgtgtc20<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列<400>5aaccatgcaatgatgctcgt20<210>6<211>22<212>dna<213>人工序列<400>6caatgatgctcgtgcaacacct22<210>7<211>23<212>dna<213>人工序列<400>7cacagcggcacaacaatatgtcg23<210>8<211>21<212>dna<213>人工序列<400>8actgtgcgttcctgatcgagc21<210>9<211>20<212>dna<213>人工序列<400>9tttacagccaagcggtcgag20<210>10<211>20<212>dna<213>人工序列<400>10cgccgggaatttcgacacga20<210>11<211>22<212>dna<213>人工序列<400>11atgatgctcgtgcaacacctgc22<210>12<211>26<212>dna<213>人工序列<400>12acgaaaccatgcaatgatgctcgtgc26當(dāng)前第1頁12