本發(fā)明涉及一種用于快速鑒定陽性菌株的方法，尤其涉及一種用于快速鑒定纖維堆囊菌中埃博霉素基因簇陽性菌株的分子生物學(xué)方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

纖維堆囊菌(sorangiumcellulosum)是粘球菌3個(gè)亞目之一，類屬于堆囊菌亞目、多囊菌科、堆囊菌屬，是一類能夠以纖維素作為唯一碳源進(jìn)行生長繁殖的革蘭氏陰性滑動(dòng)細(xì)菌。其細(xì)胞形態(tài)一般呈現(xiàn)為長度3-8μm、直徑0.8-1.2μm的短桿狀(brenner等,2006)。纖維堆囊菌的子實(shí)體一般為橙紅色、褐色或者黑色。纖維堆囊菌的基因組十分龐大，約為大腸桿菌基因組的2倍，gc含量高達(dá)69～72％。纖維堆囊菌對多種抗生素具有抗性，例如氨芐青霉素、卡那霉素、頭孢菌素c等，因此通過向富集培養(yǎng)基中添加上述幾種抗生素以及放線菌酮、制霉菌素等真菌抑制劑可以在一定程度上抑制纖維堆囊菌富集過程中其他雜菌的生長。

纖維堆囊菌能夠產(chǎn)生多樣的次級(jí)代謝產(chǎn)物，例如芳香族類、醌類、多烯類、大環(huán)內(nèi)脂類等，是繼放線菌之后又一類重要的藥源菌類群(gerth等，2003；shimkets等，2006)。其中引起人們廣泛關(guān)注的是一類16元大環(huán)內(nèi)脂類化合物——埃博霉素。埃博霉素具有與抗腫瘤藥物紫杉醇類似的生物活性，能夠促微管的聚合，使細(xì)胞周期被阻礙在g2-m期，從而抑制腫瘤細(xì)胞的無限增殖(bollag等，1995；pronzato，2008)。埃博霉素除了具有抗腫瘤活性外，還具有化學(xué)結(jié)構(gòu)簡單、水溶性高、副作用小以及對具有抗藥性的腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的活性等優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是紫杉醇的更新替代品(service，1996)。目前，埃博霉素氮雜修飾物ixabepilone已作為一線抗癌藥物商品化上市(pronzato，2008)。然而，埃博霉素在產(chǎn)量上目前正遭受極大的挑戰(zhàn)，首先，并不是所有的纖維堆囊菌都能夠產(chǎn)生埃博霉素，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在篩選的1600株菌株中，只有2.5％的菌株能夠產(chǎn)生埃博霉素(gerth等，2003)；其次纖維堆囊菌代時(shí)長、生長過程中對于細(xì)胞密度的依賴性強(qiáng)、遺傳體系難以構(gòu)建等也嚴(yán)重限制了纖維堆囊菌的應(yīng)用。

目前，用于鑒定產(chǎn)埃博霉素的纖維堆囊菌主要依賴于發(fā)酵的傳統(tǒng)方法。由于纖維堆囊菌的代時(shí)較長(約16小時(shí))、生長緩慢，整個(gè)發(fā)酵周期長達(dá)數(shù)周，因此給鑒定工作帶來了巨大的時(shí)間成本。通過不依賴于傳統(tǒng)發(fā)酵的分子生物學(xué)手段快速鑒定產(chǎn)埃博霉素的纖維堆囊菌目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

參考文獻(xiàn)

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2.gerthk,pradellas,perlovao,etal.myxobacteria:proficientproducersofnovelnaturalproductswithvariousbiologicalactivities—pastandfuturebiotechnologicalaspectswiththefocusonthegenussorangium.journalofbiotechnology,2003,106(2–3):233-253.

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5.brennerd,kriegn&staleyj(2006)theproteobacteria(partc)：thealpha-,beta-,delta-,andepsilonproteobacteria.garritygm(ed),bergeysmanualofsystematicbacteriology2nded.newyork:springer,2005:1059-1144.

6.servicerf.tumor-killermade；howdoesitwork？science,1996,274(5295):2009.

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決的問題是提供一種不依賴于傳統(tǒng)發(fā)酵的、用于快速鑒定纖維堆囊菌中埃博霉素基因簇陽性菌株的分子生物學(xué)方法。

本發(fā)明所述用于快速鑒定纖維堆囊菌中埃博霉素基因簇陽性菌株的分子生物學(xué)方法是通過選擇性培養(yǎng)基對土壤中纖維堆囊菌進(jìn)行富集和分離純化、設(shè)計(jì)特異性點(diǎn)雜交分子探針并通過點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)檢測埃博霉素基因簇；設(shè)計(jì)特異性引物對檢測埃博霉素基因簇中關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄水平；根據(jù)如下標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定：當(dāng)點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)?zāi)軌驒z測到明顯的信號(hào)斑，同時(shí)熒光定量pcr實(shí)驗(yàn)檢測到的埃博霉素基因簇中關(guān)鍵功能基因的ct值低于32時(shí)，則表明被檢測菌株為埃博霉素基因簇陽性菌株，反之則為陰性菌株；其中，所述選擇性培養(yǎng)基為cnst濾紙片培養(yǎng)基，配方為：硝酸鉀0.5g/l，磷酸氫二鈉0.63g/l，硫酸鎂1.0g/l，氯化鐵1mg/l，微量元素液1ml/l，瓊脂粉15g/l，ph7.5±0.2，在cnst的固體平板上鋪加滅菌處理的濾紙片作為唯一碳源，用于從中挑選能夠降解濾紙片的菌株；其中，所述微量元素液配方為：mncl2·4h2o0.1g/l，cocl20.02g/l，cuso40.01g/l，na2moo4·2h2o0.01g/l，zncl20.02g/l，zncl20.02g/l，licl0.005g/l，sncl2·2h2o0.005g/l，h3bo30.01g/l，kbr0.02g/l，ki0.02g/l；

其特征在于：

所述特異性點(diǎn)雜交分子探針選用的是：埃博霉素基因簇中兩段保守區(qū)域，即：nonribosomalpeptidesynthetase模塊的peptidylcarrierprotein結(jié)構(gòu)域，簡稱“nrps-pcp”；module8模塊的te結(jié)構(gòu)域，簡稱為“m8-te”；其中“nrps-pcp”探針長度為305bp，其核苷酸序列如seqidno.1所示，其上游引物序列為cggcaaacccgtctcgtg，其下游引物序列為ggcagccattgctccgtg；m8-te”探針長度為551bp，其核苷酸序列如seqidno.2所示，其上游引物序列為gcaccgtttgcgttagtagg，其下游引物序列為ggaggctgccatcattttg；

所述特異性引物對，是根據(jù)埃博霉素基因簇中8個(gè)保守區(qū)段的堿基序列而設(shè)計(jì)的8個(gè)特異性引物對，編號(hào)為s1～8，用于熒光定量pcr實(shí)驗(yàn)檢測埃博霉素基因簇中關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄水平；其中：

所述s1引物對，上游引物序列為ggatccagcggctgctcgtg，下游引物序列為acgcgagatccgaaggtgtctga；

所述s2引物對，上游引物序列為gatcgcgcaagacctccggg，下游引物序列為gctggcaggggtcgaggcta；

所述s3引物對，上游引物序列為cggcaaacccgtctcgtg，下游引物序列為cttgcgagactccagcgcga；

所述s4引物對，上游引物序列為ttgctgctcgaccagacggc，下游引物序列為caccagctccccggcgctat；

所述s5引物對，上游引物序列為catccgctcctgcctgctcg，下游引物序列為caggcggctcctgctatgcc；

所述s6引物對，上游引物序列為ttcttcctccgcgggggctt，下游引物序列為agccatctgactgcgccgga；

所述s7引物對，上游引物序列為gcaccgtttgcgttagtagg，下游引物序列為tcggtctccatctccggggc；

所述s8引物對，上游引物序列為gctggataactcgcgggggc，下游引物序列為ggctcgccatcggggtcttc。

本發(fā)明公開了一種用于快速鑒定纖維堆囊菌中埃博霉素基因簇陽性菌株的分子生物學(xué)方法，相比于長達(dá)數(shù)周的傳統(tǒng)鑒定方法，本發(fā)明提供的鑒定方法無需發(fā)酵，即能夠?qū)崿F(xiàn)快速、敏感、準(zhǔn)確地鑒定纖維堆囊菌中埃博霉素基因簇陽性菌株，并且重復(fù)性好，大大降低了時(shí)間成本，應(yīng)用前景廣闊。

附圖說明

圖1.部分纖維堆囊菌形態(tài)照片。

其中：a6為分離自湖底泥樣品的6號(hào)菌株，b1為分離自土壤樣品的1號(hào)菌株，b4為分離自土壤樣品的4號(hào)菌株，b6為分離自土壤樣品的6號(hào)菌株。

圖2.埃博霉素基因簇點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)圖。

其中：a1-6為分離自湖底泥樣品的1-6號(hào)菌株，b1-6為分離自土壤樣品的1-6號(hào)菌株，mx為陰性對照組，h2o為空白對照組。

圖3.埃博霉素基因簇轉(zhuǎn)錄水平分析。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合本發(fā)明提供的用于快速鑒定纖維堆囊菌中埃博霉素基因簇陽性菌株的分子生物學(xué)方法，進(jìn)一步描述其在用于鑒定能夠代謝產(chǎn)生埃博霉素的纖維堆囊菌陽性菌株中的應(yīng)用。所述內(nèi)容是對本發(fā)明的解釋而不是限定。

實(shí)施例1：纖維堆囊菌的富集及分離純化

(1)稱取0.1g左右的風(fēng)干土壤樣品，用稱量紙包好后將樣品敲碎。

(2)取少量樣品粉末，將其均勻的灑在cnst濾紙片固體平板上(硝酸鉀0.5g/l，磷酸氫二鈉0.63g/l，硫酸鎂1.0g/l，氯化鐵1mg/l，微量元素液1ml/l，瓊脂粉15g/l，ph7.5±0.2，121℃滅菌30min。在cnst的固體平板上鋪加滅菌處理的濾紙片作為碳源)上，在不同溫度(25℃、30℃、37℃)下進(jìn)行培養(yǎng)，其中，微量元素液配方為：mncl2·4h2o0.1g/l，cocl20.02g/l，cuso40.01g/l，na2moo4·2h2o0.01g/l，zncl20.02g/l，zncl20.02g/l，licl0.005g/l，sncl2·2h2o0.005g/l，h3bo30.01g/l，kbr0.02g/l，ki0.02g/l。

(3)培養(yǎng)10-14天，當(dāng)出現(xiàn)纖維堆囊菌生長的跡象后，挑取被降解的濾紙纖維轉(zhuǎn)接到新的cnst濾紙片固體平板上。

(4)繼續(xù)培養(yǎng)7-10天，在體視鏡下觀察，當(dāng)觀察到子實(shí)體以及菌膜擴(kuò)展等現(xiàn)象后，用無菌接種針挑取菌膜部分轉(zhuǎn)接至新的cnst濾紙固體平板上進(jìn)行傳代。

(5)由于纖維堆囊菌無法在lb固體培養(yǎng)基上生長，因此可以將純化的纖維堆囊菌接種到lb固體平板上，30℃培養(yǎng)1-2天，若無雜菌生長則表明該菌株已純化好；若lb固體平板上有雜菌生長，則表明該菌株仍然需要進(jìn)一步純化。

(6)消除細(xì)菌污染：將帶有纖維堆囊菌的部分降解的濾紙片接入lb液體培養(yǎng)基中，200rpm、30℃培養(yǎng)過夜；取出濾紙用無菌水輕微沖洗2～3次，再將其放入含有氨芐青霉素(終濃度100ppm)的lb液體培養(yǎng)基中，200rpm、30℃培養(yǎng)過夜；最后取出濾紙轉(zhuǎn)接至新的cnst濾紙固體平板上。

(7)消除具有孢子的雜菌：將纖維堆囊菌培養(yǎng)至子實(shí)體階段，用無菌接種鏟刮取少量子實(shí)體至1.5ml無菌離心管中，加入500μl的無菌水重懸，60℃水浴處理10～20min，10,000rpm離心后選擇底部的菌體沉淀轉(zhuǎn)接至新的cnst濾紙固體平板上。

(8)將分離得到的纖維堆囊菌在體視鏡下觀察，記錄菌膜擴(kuò)展，子實(shí)體形態(tài)、顏色等特征。

纖維堆囊菌的子實(shí)體和菌膜擴(kuò)展形態(tài)在cnst濾紙固體平板上呈現(xiàn)出明顯的菌株特異性。部分纖維堆囊菌形態(tài)照片見圖1。

實(shí)施例2：點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)檢測埃博霉素基因簇

(1)利用細(xì)菌基因組提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取纖維堆囊菌的基因組dna。

(2)分子探針的獲取

在埃博霉素基因簇中選擇兩端保守區(qū)域作為探針識(shí)別區(qū)域，分別是：nonribosomalpeptidesynthetase模塊的peptidylcarrierprotein結(jié)構(gòu)域，簡稱“nrps-pcp”；module8模塊的te結(jié)構(gòu)域，簡稱為“m8-te”。擴(kuò)增探針的引物對序列信息如表1所示。

表1探針引物對序列信息

pcr擴(kuò)增體系如表2所示，擴(kuò)增條件如表3所示：

表2pcr擴(kuò)增體系

表3pcr擴(kuò)增條件

(3)pcr產(chǎn)物采用1.0％的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，并送往青島擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序驗(yàn)證?！皀rps-pcp”探針長度為305bp，其核苷酸序列如seqidno.1所示，“m8-te”探針長度為551bp，其核苷酸序列如seqidno.2。

(4)探針的標(biāo)記

取1μg探針加入pcr管中，用無菌去離子水補(bǔ)至16μl，將探針置于沸水浴中10min進(jìn)行變性，然后置于冰上備用。將dig-highprime混合均勻，取4μl加入變性后的探針中，37℃孵育過夜。用65℃孵育10min終止反應(yīng)。

(5)點(diǎn)雜交及顯色反應(yīng)

1)根據(jù)公式tm＝49.82+0.41×(％g+c)-(600/l)確定雜交的溫度，其中l(wèi)為能夠雜交上的片段長度。

2)取合適大小的雜交膜，在上面點(diǎn)上1μl基因組dna，用uvp組合型hl-2000hybridizer分子雜交儀紫外交聯(lián)30秒。

3)取適量digeasyhyb緩沖液(10ml/100cm²)置于雜交管中，預(yù)熱到雜交溫度，將已完成固定基因組的膜放入緩沖液中，溫和震蕩30秒。進(jìn)行雜交。

4)取地高辛標(biāo)記的探針放入沸水浴中5min，變性后立即置于冰上。

5)將變性的探針加入到預(yù)熱的digeasyhyb緩沖液中，充分混勻，避免產(chǎn)生氣泡。

6)棄去預(yù)雜交液，在膜上加入探針與digeasyhyb緩沖液混合物，震蕩孵育12h。

7)使用2×ssc、0.1％sds在室溫下連續(xù)震蕩洗膜兩次，每次5min。用預(yù)熱到68℃的0.5×ssc、0.1％sds震蕩洗膜兩次，每次15min。

8)用洗滌緩沖液洗膜5min。

9)在100ml封閉液中孵育30min。

10)在20ml抗體溶液中孵育30min。

11)用100ml洗滌緩沖液洗滌2次，每次15min。

12)在20ml檢測緩沖液中平衡5min。

13)在暗室里將膜避光置于底物顯色液中，靜置孵育至有明顯目的條帶出現(xiàn)，用去離子水洗膜5min停止反應(yīng)。

用探針“m8-te”和“nrps-pcp”對12株纖維堆囊菌分離株的基因組dna進(jìn)行dna點(diǎn)雜交分析。選用不含埃博霉素基因簇的黃色粘球菌作為陰性對照組，選用去離子h2o作為空白對照組。如果該菌株為埃博霉素基因簇陽性菌株，那么在雜交膜上能夠觀測到明顯的信號(hào)斑，反之則為陰性菌株(圖2)。

實(shí)施例3：埃博霉素基因簇轉(zhuǎn)錄水平檢測

(1)纖維堆囊菌rna的提取

將纖維堆囊菌菌液用8000rpm離心5min回收菌體細(xì)胞，先后用depc水、5×buffer(95％的乙醇和5％的酸酚，ph4.5)洗滌。取50mg洗滌后的菌體細(xì)胞，加入50μl溶菌酶溶液(3mg/ml)，37℃水浴10min，每隔2～3min振蕩混勻1次。后續(xù)按照svtotalrnaisolationsystem(promega)試劑盒提取纖維堆囊菌rna。

(2)引物設(shè)計(jì)

根據(jù)埃博霉素基因簇中8個(gè)保守區(qū)段的堿基序列而設(shè)計(jì)的8個(gè)特異性引物對，編號(hào)為s1～8，用于熒光定量pcr實(shí)驗(yàn)檢測埃博霉素基因簇中關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄水平。特異性引物對序列信息如表4所示。選用16srrna基因作為內(nèi)參基因。

表4引物序列信息

(3)反轉(zhuǎn)錄pcr

提取的rna用2％dnasei(fermentas)去除殘留的dna。采用primescripttmrt-pcrkit(takara)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，步驟如下：

1)配置混合液：dntpmixture(10mmeach)1μl；一端的特異引物(2μm)1μl；模板rna(100pg-1μg)+rnasefreeh2o，8μl。pcr儀中65℃反應(yīng)5min，置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

2)配置反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液：上述反應(yīng)液10μl；5×primescriptbuffer4μl；rnaseinhibitor(40u/μl)0.5μl；primescriptrtase(for2step)0.5μl；rnasefreeh2o5μl。在pcr儀中42℃反應(yīng)20min；95℃熱處理5min終止反應(yīng)。

(4)熒光定量pcr

采用takara公司的試劑盒sybr@premixextaqtmii進(jìn)行熒光定量pcr，利用羅氏熒光定量pcr儀(型號(hào)lightcycler480)計(jì)算ct值。選用不含埃博霉素基因簇的黃色粘球菌作為陰性對照組，選用去離子h2o作為空白對照組。熒光定量pcr反應(yīng)體系如表5所示，pcr擴(kuò)增條件如表6所示：

表5熒光定量pcr反應(yīng)體系

表6pcr擴(kuò)增條件

結(jié)果顯示，陰性對照組的ct值為33.8，空白對照組的ct值未檢測到。

上述s1～8區(qū)段的ct值分別為：s1＝20.15，s2＝22.11，s3＝21.55，s4＝21.73，s5＝20.55，s6＝20.27，s7＝19.03，s8＝18.75。如果埃博霉素基因簇中8個(gè)保守區(qū)段的關(guān)鍵功能基因的ct值低于32，則表明該菌株為埃博霉素基因簇陽性菌株，反之則為陰性菌株。利用2^-△△ct公式計(jì)算各個(gè)關(guān)鍵功能基因的轉(zhuǎn)錄差異，其中δδct＝實(shí)驗(yàn)組(目的基因ct-內(nèi)參基因ct)-對照組(目的基因ct-內(nèi)參基因ct)。結(jié)果如圖3所示。

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以制定如下判定標(biāo)準(zhǔn)：

當(dāng)點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)?zāi)軌驒z測到明顯的信號(hào)斑，同時(shí)熒光定量pcr實(shí)驗(yàn)檢測到的埃博霉素基因簇中關(guān)鍵功能基因的ct值低于32時(shí)，則表明被檢測菌株為埃博霉素基因簇陽性菌株，反之則為陰性菌株。

序列表

<110>山東大學(xué)

<120>一種快速鑒定埃博霉素基因簇陽性菌株的方法

<141>2017-04-26

<160>2

<210>1

<211>305

<212>dna

<213>人工序列

<221>nrps-pcp

<222>（1）…（305）

<400>1

ggcagccattgctccgtgtgccggaagcggatctccttcagggtagatggatcggccttc60

atcgggagcatcggcggaggtgggagctcggcgatgcgccgcttccagtaatccatcgat120

cgttgatgcgcctcagacttcttgcgagactccagcgcgagtacatagtcgcggtacgag180

agctccaggacagggagagaggtctcgggatcttcgtagaagctgagccagtccttgaag240

atgatggacaggctgcctaggtcaacgttaatgagatcgatgctgagcacgagacgggtt300

tgccg305

<210>2

<211>551

<212>dna

<213>人工序列

<221>m8-te

<222>（1）…（551）

<400>2

ggaggctgccatcattttgcctcgaacgccgggcctgacgacgtcgtcttcgcggcgagc60

agcggattgagatgcgagtcgacgatgtgcatgatctcgcgacttcgatcgacgagaaac120

tcgtgatctccgggaaggagatgcatatagaagcgctccgtggtgcgagattgtagatcc180

tgaacgtcgcttggaggcacgatcacatcgtccgagccggcgatggcgacgatagggacc240

gcgatcttcacgggcggctccttcgagtccccgggggccggagccatcatcgtgtctgtg300

atgaccttgtctgcgcgagcatcggcctgaacttgttgggtggatcgcacgaaacccgcg360

gcatttcggaagaagagcttggctattatgtcggtctccatctccggggtgatctctgaa420

gaagagatcaagctgccgcccaacgtgaaaacggccagcggagccggtgcgccggaacga480

ctggcgagctccacggctgtccccatgacgaaccggacacccaggctgaaccctactaac540

gcaaacggtgc551