本發(fā)明屬于細菌檢測領(lǐng)域，具體涉及細菌性傳染病的檢測方法，特別是涉及產(chǎn)氣莢膜梭菌的檢測方法及應(yīng)用領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

產(chǎn)氣莢膜梭菌(clostridiumperfringens)，在自然界分布極廣，在一定條件下可引起多種嚴重疾病。該菌能產(chǎn)生多種外毒素，但起主要致病作用有α、β、ε、ι4種毒素，根據(jù)細菌產(chǎn)毒素的不同，將此菌分為a、b、c、d、e5個型。a型菌主要產(chǎn)生α毒素，引起人和動物氣性壞疽和食物中毒，還可引起牛、羔羊、山羊、馴鹿、仔豬和家兔等的腸毒血癥;b型菌主要產(chǎn)生α、β、ε毒素，引起羔羊痢疾，還可引起駒、犢牛、羔羊、綿羊和山羊的腸毒血癥或壞死性腸炎;c型菌主要產(chǎn)生α、β毒素，是綿羊猝狙的病原，也能引起羔羊、犢牛、仔豬和綿羊的腸毒血癥，壞死性腸炎以及人的壞死性腸炎;d型菌主要產(chǎn)生α、ε毒素，引起羔羊、綿羊、山羊、牛以及灰鼠的腸毒血癥;e型菌主要產(chǎn)生α、ι毒素，可致犢牛、羔羊腸毒血癥，但很少發(fā)生。

本研究以產(chǎn)氣莢膜梭菌α、β、ε毒素的cap、cpb、etx基因為靶序列，建立了檢測產(chǎn)氣莢膜梭菌的多重pcr方法。為產(chǎn)氣莢膜梭菌的檢測和分型提供切實有效的方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

根據(jù)genbank中登錄的產(chǎn)氣莢膜梭菌α、β、ε毒素的基因序列，設(shè)計3對特異性引物。建立了檢測和分型產(chǎn)氣莢膜梭菌的多重pcr方法，從而實現(xiàn)對產(chǎn)氣莢膜梭菌的靈敏、高效、快速、準確檢測和分型。

本發(fā)明的目的在于通過多重pcr方法對動物體內(nèi)的產(chǎn)氣莢膜梭菌進行分型鑒定。

本發(fā)明的目的在于提供一組多重pcr檢測產(chǎn)氣莢膜梭菌的引物，所述引物如seqidno:1和seqidno:2所示。

本發(fā)明的目的在于提供產(chǎn)氣莢膜梭菌多重pcr分型的試劑盒，所述試劑盒包括檢測檢測產(chǎn)氣莢膜梭菌α、β、ε毒素的引物。

本發(fā)明具體提供了一種多重pcr檢測和分型產(chǎn)氣莢膜梭菌的方法，具體步驟如下：

1.引物的設(shè)計與合成：

根據(jù)genbank中發(fā)表的產(chǎn)氣莢膜梭菌編碼α、β、ε3種毒素的基因序列（cap、cpb、etx）保守區(qū)設(shè)計3對引物，并由華大基因公司合成。

2.目標dna模板的制備

取菌液1.0ml，根據(jù)天根細菌基因組dna提取試劑盒的說明書提取。

50μl體系中加入25.0μlmix，11.0μlddh2o，模板，上下游引物各2μl。循環(huán)參數(shù)為：94℃預(yù)變性5min；94℃45s，55℃45s，72℃30s，共30個循環(huán)，最后72℃延伸2min；目的片段長度分別為288bp、151bp、678bp。

本發(fā)明中，參照基因庫（genbank）中登錄號為x17300的α毒素基因序列，登錄號為l13198的β毒素基因序列，登錄號為x60694的ε毒素設(shè)計引物，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以通過公眾的渠道獲知。

本發(fā)明進一步對產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測方法的特異性和敏感性進行了確證。

用本發(fā)明提供的擴增體系分別擴增了腐敗梭菌、巴氏桿菌、牛、羊布魯氏菌、大腸桿菌等核酸樣品，被測樣品均沒有陽性擴增條帶，表明該方法具有較好的特異性。

選取稀釋度為1×10⁵copies/μl的dna模板，進行4次10倍倍比稀釋，建立組內(nèi)敏感性試驗。結(jié)果顯示敏感性在1×10²copies/μl，表明該方法具有良好的敏感性。

通過實施本發(fā)明具體的發(fā)明內(nèi)容，可以達到以下有益效果。

本方法檢測時間短，傳統(tǒng)的毒素中和實驗法對產(chǎn)氣莢膜梭菌的分型時間至少要在7天以上，該發(fā)明檢測時間包括樣品前處理到獲得檢測結(jié)果在3天之內(nèi)，比傳統(tǒng)的中和實驗方法至少也要縮短4天左右。檢測靈敏度高，該方法可檢測到1×10²copies/μl個拷貝的dna，。特異性好，通過對產(chǎn)氣莢膜梭菌、腐敗梭菌、巴氏桿菌等dna樣品檢測，只有產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測為陽性。本方法流程簡單，操作性強，易于掌握，只要具備分子生物學(xué)基礎(chǔ)知識，無需良特別的訓(xùn)練便能很好完成。通過該方法的使用可實現(xiàn)對試驗過程實施監(jiān)測，有效的解決了傳統(tǒng)檢測方法中存在的假陰性結(jié)果，可以對實驗室進行質(zhì)量監(jiān)控，確保檢測結(jié)果的準確性。用該發(fā)明方法對11株分離的產(chǎn)氣莢膜梭菌進行分型，均得到預(yù)期結(jié)果。

本方法能同時鑒別檢測產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)生的α、β、ε3種毒素基因或進行單基因鑒定。該方法的建立為相關(guān)細菌檢驗檢疫技術(shù)的研究提供了較好的借鑒意義，并為規(guī)范檢測試劑向標準化水平的發(fā)展具有指導(dǎo)借鑒意義。該方法能夠廣泛應(yīng)用于出入境檢驗檢疫部門、畜牧獸醫(yī)部門和養(yǎng)殖單位，為疫病的有效防控具有重要意義。

附圖說明

圖1：產(chǎn)氣莢膜梭菌參考株多重pcr擴增α、β、ε結(jié)果：其中1、2、3、4分別為產(chǎn)氣莢膜梭菌a型（α毒素）擴增產(chǎn)物，產(chǎn)氣莢膜梭菌b型（α、β、ε毒素）擴增產(chǎn)物，產(chǎn)氣莢膜梭菌c型（α、β毒素）擴增產(chǎn)物，產(chǎn)氣莢膜梭菌d型（α、ε毒素）擴增產(chǎn)物，m為dl2000marker，5為空白對照。

圖2：產(chǎn)氣莢膜梭菌b型參考菌毒素基因pcr敏感性擴增結(jié)果：其中1～6泳道分別為1×10⁵～1×10⁰copies/μl為模板的進行的多重pcr擴增，7為空白對照，m為dl2000marker。

圖3：產(chǎn)氣莢膜梭菌參考菌a、b、c、d型多重pcr特異性擴增結(jié)果：其中1為a型參考菌2為b型參考菌，3為c型參考菌，4為d型參考菌，5為腐敗梭菌，6為大腸桿菌，7為巴氏桿菌，m為dl2000marker。

圖4：多重pcr擴增臨床分離到的產(chǎn)氣莢膜梭菌結(jié)果：其中m為dl2000maker，1為a型參考菌，2為b型參考菌，3為c型參考菌，4為d型參考菌，5~15為臨床分離的產(chǎn)氣莢膜梭菌，16為空白對照，m為dl2000marker。

具體實施方式

實施例一．引物設(shè)計與合成

根據(jù)genbank中發(fā)表的產(chǎn)氣莢膜梭菌編碼α、β、ε3種毒素的基因序列（cap、cpb、etx）保守區(qū)設(shè)計3對引物，并由華大基因公司合成。

本發(fā)明中的引物代號序列見表1

實施例二：目標模板的獲得

無菌條件下取牛、羊腸道內(nèi)容和其他組織，用接種環(huán)蘸取，劃線接種于經(jīng)胰蛋白胨-亞硫酸鹽-環(huán)絲氨酸瓊脂（tsc）上，37℃厭氧培養(yǎng)18h。挑取tsc平板上的黑色菌落，接種到厭氣肉肝湯中培養(yǎng)18h，用天根細菌基因組試劑盒提取dna作為模版。

實施例三：多重pcr擴增體系的建立

pcr反應(yīng)體系為50μl，取pcr管依次加入premixextap25μl、3對引物(10pmol/μl)各2μl、dna模版2μl、ddh2o11μl。于pcr儀進行如下反應(yīng)：95℃預(yù)變性5min，95℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min進行30個循環(huán)，然后再72℃延伸10min。pcr完成后取7μlpcr產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中以110v的電壓電泳30min，用凝膠成像儀觀察并拍照。

多重pcr擴增參考菌毒素基因圖參見附圖1

實施例四：敏感性試驗和特異性試驗

用260nm分光光度計測定b型參考菌dna模版的濃度，并用公式計算拷貝數(shù)，取1×10⁵~1×10⁰copies/μl共6個稀釋度，每個稀釋度分別取2μl作為多重pcr反應(yīng)模板，進行多重pcr擴增以檢測其敏感性。

敏感性pcr圖參見附圖2

用腐敗梭菌dna、巴氏桿菌dna和大腸桿菌dna按反應(yīng)體系和反應(yīng)參數(shù)，進行pcr特異性試驗。取產(chǎn)氣梭菌a、b、c、d型參考菌株dna作為陽性對照，同時設(shè)立陰性對照。

特異性pcr圖參見附圖3

實施例五：對樣品的檢測與分型

對11份牛、羊小腸分離的產(chǎn)氣莢膜梭菌進行檢測。由圖可知，陽性對照出現(xiàn)相應(yīng)擴增條帶，陰性對照未出現(xiàn)擴增條帶。其中有3份為產(chǎn)氣莢膜梭菌a型，3份為產(chǎn)氣莢膜梭菌c型，5份為產(chǎn)氣莢膜梭菌d型。

樣品檢測分型pcr圖參見附圖4

以上實施例進一步說明了本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所做的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范疇。