本發(fā)明屬于微生物體外核酸檢測領(lǐng)域，具體涉及一種特異性檢測風(fēng)疹病毒核酸的熒光pcr方法及試劑盒，能夠?qū)︼L(fēng)疹病毒核酸進(jìn)行定性檢測，可以作為有效的檢測工具。
背景技術(shù)：
：風(fēng)疹病毒(rubellavirus，rv)，是披膜病毒科風(fēng)疹病毒屬的唯一成員，人是其唯一的自然宿主。感染風(fēng)疹對人體的危害并不大，但rv對公眾健康威脅最大的是它具有致畸性。孕婦感染rv后可對嬰兒產(chǎn)生先天性損害，病毒可通過垂直傳播侵犯胎兒，導(dǎo)致流產(chǎn)、死產(chǎn)或胎兒感染，從而引起嚴(yán)重的出生缺陷，包括白內(nèi)障、耳聾、心臟病或智力低下，即為先天性風(fēng)疹綜合征(congenitalrubellasyndromes，crs)。雖然風(fēng)疹病毒通過疫苗接種是可以預(yù)防的，但一旦感染，臨床上暫無特效治療，因此在臨床上對風(fēng)疹病毒的感染、實驗室診斷及其流行特征極為重視。風(fēng)疹病毒是單股，正鏈rna病毒，全長約9.7kbp。rv的基因組rna包括兩個長的開放讀碼框架(orf)，一個是5’-近端的orf，編碼兩種非結(jié)構(gòu)蛋白p150和p90，參與病毒的復(fù)制；另一個是3’-近端的orf，編碼結(jié)構(gòu)蛋白。其編碼的3種結(jié)構(gòu)蛋白為衣殼蛋白c和2種包膜糖蛋白e1、e2，其分子量分別為33、58、42～47kd，它們是rv的主要蛋白抗原?？乖砦恢饕嬖谟趀1膜蛋白上。目前，臨床實驗室檢測多采用血清學(xué)試驗，如elisa、ria和ifa等，檢測特異性抗體。血清風(fēng)疹病毒-igm陽性證明近期感染己持續(xù)2～4個月。血清風(fēng)疹病毒-igg陽性則提示既往感染。由于風(fēng)疹病毒抗原來源困難，血清學(xué)試驗尚難普及，而且某些人群感染病毒后抗體反應(yīng)很弱或不產(chǎn)生抗體，因此僅以抗體檢測結(jié)果不能準(zhǔn)確判定風(fēng)疹病毒感染情況，需輔以抗原或核酸檢測結(jié)果作為診斷和治療的依據(jù)。目前比較成熟的核酸檢測方法是用熒光pcr方法，該方法克服了常規(guī)pcr法特異性差、易污染、結(jié)果分析操作步驟多等缺點，采用taqman方法或稱雙標(biāo)探針法(熒光淬滅探針或稱fq探針)，即在其5’端和3’端分別標(biāo)記一個熒光報告基團(tuán)和一個淬滅基團(tuán)。靶序列的特異性探針和特異性的pcr引物同時使用，設(shè)計的該探針在上下游pcr引物的范圍內(nèi)退火，由三個寡核苷酸共同結(jié)合于目的基因片段，使其特異性大大增強。在pcr的延伸階段，taqdna聚合酶5’-3’的核酸外切酶活性將熒光報告基團(tuán)從探針上切割下來。隨著pcr循環(huán)數(shù)的增加，游離報告基團(tuán)的數(shù)量不斷的增加，實時檢測從游離熒光基團(tuán)上釋放的熒光信號，從而對靶序列進(jìn)行定性分析。該pcr反應(yīng)在封閉系統(tǒng)內(nèi)進(jìn)行，分析結(jié)果也無需開封，因此，避免了pcr產(chǎn)物污染的發(fā)生。目前，也有熒光pcr方法用于檢測風(fēng)疹病毒的報道，但是開發(fā)更多有效、快速、準(zhǔn)確、靈敏度高、特異性強的熒光pcr方法用的引物和探針，并將此引物和探針用于檢測試劑盒也是本領(lǐng)域追求的目標(biāo)。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種特異性檢測風(fēng)疹病毒核酸的熒光pcr試劑盒，該試劑盒具有靈敏、特異和高效率的特點，從而實現(xiàn)檢測樣本中風(fēng)疹病毒的核酸，實現(xiàn)定性檢測。為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一種特異性檢測風(fēng)疹病毒核酸的熒光pcr試劑盒，包括特異性引物對和熒光探針，所述特異性引物對和熒光探針如下：正向引物：5’-tgcaacgtcaccactgaaca-3’反向引物：5’-ggacctggacctcgagttgtc-3’熒光探針：5’-ccgttctgcaacacgccgca-3’。所述的熒光探針的兩端分別標(biāo)記報告熒光素或熒光染料、淬滅基團(tuán)。標(biāo)記的報告熒光素或熒光染料為fam或其它任何可以作為探針標(biāo)記的熒光素或熒光染料，例如hex、tet、joe、yakimayellow、cy3、cy3.5、cy5、ned、vic、pet、rox、liz、red、texasred；淬滅基團(tuán)為tamra或其它任何可以作為淬滅基團(tuán)的化學(xué)物質(zhì)，例如dabcyl、bhq1、bhq2。進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括pcr反應(yīng)液、陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品。更進(jìn)一步地，所述pcr反應(yīng)液包括taq酶、dntp、緩沖液等成分。更進(jìn)一步地，所述的陽性質(zhì)控品含人工合成序列，所述的人工合成序列為人工合成含所述風(fēng)疹病毒特異性引物對擴增產(chǎn)物片段的序列。該人工合成序列的內(nèi)容為：ttgcgcgcgcatctggaatggcacacagcgcgcgtgcaccttctgggctgtcaacgcctactcctctggcgggtacgcgcagctggcctcttacttcaaccctggcggcagctactacaagcagtaccaccctaccgcgtgcgaggttgaacctgccttcggacacagcgacgcggcctgctggggcttccccaccgacaccgtgatgagcgtgttcgcccttgctagctacgtccagcaccctcacaagaccgtccgggtcaagttccatacagagaccaggaccgtctggcaactctccgttgccggcgtgtcgtgcaacgtcaccactgaacacccgttctgcaacacgccgcacggacaactcgaggtccaggtcccgcccgaccccggggacctggttgagtacattatgaattacaccggcaatcagcagtcccggtggggcctcgggagcccgaattgccacggccccgattgggcctccccggtttgccaacgccattcccctgactgctcgcggcttgtgggggccacgccagagcgcccccggctgcgcctggtcgacgccgacgaccccctgctgcgcactgcccctggacccggcgaggtgtgggtcacgcctgtcataggctctcaggcgcgcaagtgcggactccacatacgcgctggaccgtacggccatgctaccgtcgaaatgcccgagtggatccacgcccacaccaccagcgacccctggcatccaccgggccccttggggctgaagttcaagacagttcgcccggtggccc。優(yōu)選地，所述的陽性質(zhì)控品是通過在puc57質(zhì)粒載體中插入所述人工合成含所述特異性引物對擴增產(chǎn)物片段的序列重組制得。具體地，所述陽性質(zhì)控品所含的重組puc57載體質(zhì)粒濃度為1ng/μl。更進(jìn)一步地，所述的陰性質(zhì)控品含人工合成的人類管家基因gapdh部分片段的序列。更進(jìn)一步地，所述的陰性質(zhì)控品是通過在ptg19-t質(zhì)粒載體中插入所述人工合成人類管家基因gapdh部分片段的序列重組制得。具體地，所述的陰性質(zhì)控品所含的重組ptg19-t載體質(zhì)粒濃度為1ng/μl。更進(jìn)一步地，用于擴增所述的人工合成人類管家基因gapdh部分片段的引物對如下：正向引物：5’-caaaggccaggctgtaaatg-3’反向引物：5’-agagacaagaggcaagaagg-3’。更進(jìn)一步地，所述的人工合成人類管家基因gapdh部分片段的序列為：caaaggccaggctgtaaatgtcaccgggaggattgggtgtctgggcgcctcggggaacctgcccttctccccattccgtcttccggaaaccagatctcccaccgcaccctggtctgaggttaaatatagctgctgacctttctgtagctgggggcctgggctggggctctctcccatcccttctccccacacacatgcacttacctgtgctcccactcctgatttctggaaaagagctaggaaggacaggcaacttggcaaatcaaagccctgggactagggggttaaaatacagcttcccctcttcccacccgccccagtctctgtcccttttgtaggagggacttagagaaggggtgggcttgccctgtccagttaatttctgacctttactcctgccctttgagtttgatgatgctgagtgtacaagcgttttctccctaaagggtgcagctgagctaggcagcagcaagcattcctggggtggcatagtggggtggtgaataccatgtacaaagcttgtgcccagactgtgggtggcagtgccccacatggccgcttctcctggaagggcttcgtatgactgggggtgttgggcagccctggagccttcagttgcagccatgccttaagccaggccagcctggcagggaagctcaagggagataaaattcaacctcttgggccctcctgggggtaaggagatgctgcattcgccctcttaatggggaggtggcctagggctgctcacatattctggaggagcctcccctcctcatgccttcttgcctcttgtctct。根據(jù)本發(fā)明，所述試劑盒的反應(yīng)體系為20μl-50μl，當(dāng)所述試劑盒的反應(yīng)體系為20μl體系，所述試劑盒包括：pcr反應(yīng)液(2x)10μl，正向引物0.5μl(10μmol/ml)，反向引物0.5μl(10μmol/ml)，熒光探針0.5μl(10μmol/ml)，被檢測物細(xì)胞、組織、體液(分泌物、痰液、尿液等等)的dna提取物4μl，滅菌超純水加至20μl；當(dāng)所述試劑盒的反應(yīng)體系為50μl體系，所述試劑盒包括：pcr反應(yīng)液(2x)25μl，正向引物1.25μl(10μmol/ml)，反向引物1.25μl(10μmol/ml)，熒光探針1.25μl(10μmol/ml)，被檢測物細(xì)胞、組織、體液(分泌物、痰液、尿液等等)的dna提取物4-10μl，滅菌超純水加至50μl。根據(jù)本發(fā)明，所述的試劑盒的熒光pcr擴增的反應(yīng)時間和溫度為：50℃，2min1個循環(huán)(如果pcr反應(yīng)液不含ung酶則省略)；95℃，2-10min(依據(jù)不同來源的pcr反應(yīng)液而定)1個循環(huán)；95℃，15s，60℃，1min，40個循環(huán)并收集熒光信號。本發(fā)明采取的另一技術(shù)方案是：一種特異性檢測風(fēng)疹病毒核酸的熒光pcr方法，采用上述試劑盒進(jìn)行檢測。由于上述技術(shù)方案的實施，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點：本發(fā)明試劑盒通過對大量臨床樣本進(jìn)行檢測，能夠有效檢測出風(fēng)疹病毒，大量臨床樣本的檢測也對試劑盒的有效性、大規(guī)模使用性提供了保障。本發(fā)明試劑盒，風(fēng)疹病毒熒光pcr檢測的反應(yīng)效率高達(dá)88.9％，具有較高的反應(yīng)效率。附圖說明圖1為風(fēng)疹病毒熒光pcr引物對的質(zhì)檢電泳圖；圖中，1：風(fēng)疹病毒熒光pcr反應(yīng)正向引物；2：風(fēng)疹病毒熒光pcr反應(yīng)反向引物；m：電泳marker，長度由上到下依次為20，24，36(單位：堿基)。圖2為風(fēng)疹病毒熒光pcr探針的質(zhì)檢hplc圖。圖3為puc57重組質(zhì)粒構(gòu)成示意圖。圖4為ptg19-t質(zhì)粒載體構(gòu)成示意圖。圖5為陽性質(zhì)控品熒光pcr的擴增反應(yīng)圖；圖中從左至右的曲線分別對應(yīng)陽性質(zhì)控品的濃度從高到低。圖6為圖5中擴增反應(yīng)對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。具體實施方式本發(fā)明的試劑盒采用自主設(shè)計的熒光pcr反應(yīng)特異性引物對和熒光探針、人工合成的陽性質(zhì)控品、人工合成的陰性質(zhì)控品，具有靈敏度高、特異性強、反應(yīng)效率高的特點，可以實現(xiàn)對風(fēng)疹病毒的定性檢測，能夠成為有效的輔助檢測工具。下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的說明，應(yīng)當(dāng)說明一點，實施例僅用于具體說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明。實施例1：特異性檢測風(fēng)疹病毒核酸的pcr試劑盒的制備1、特異性引物對和熒光探針的設(shè)計和合成使用primerexpress3.0軟件，用風(fēng)疹病毒e1基因的序列設(shè)計特異性引物對和其特異性的熒光探針，引物和探針均由上海捷瑞生物有限公司合成，在合成的探針上進(jìn)行了雙熒光和淬滅基團(tuán)標(biāo)記。其中，引物為page純化，探針為hplc純化。設(shè)計出的特異性引物對和探針如下：正向引物：5’-tgcaacgtcaccactgaaca-3’(seqidno.1)反向引物：5’-ggacctggacctcgagttgtc-3’(seqidno.2)熒光探針：5’-ccgttctgcaacacgccgca-3’(seqidno.3)。引物和探針合成后均制備成凍干粉狀，然后用1×tebuffer稀釋至100μm的濃度作為母液，-20℃保存。工作液為母液通過無菌水稀釋10倍制得，用于常規(guī)使用。對特異性引物對和熒光探針進(jìn)行質(zhì)檢分析，結(jié)果如圖1和圖2所示。2、陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品的制備陽性質(zhì)控品的制備：含本發(fā)明的特異性引物對擴增產(chǎn)物的特異性序列片段由南京金斯瑞生物有限公司合成，然后用重組dna基因工程方法人工裝入puc57質(zhì)粒載體中，再通過轉(zhuǎn)化大腸桿菌、質(zhì)粒擴增和質(zhì)粒提取等步驟獲得重組質(zhì)粒dna，此質(zhì)粒dna就是本發(fā)明試劑盒中所使用的陽性質(zhì)控品，該陽性質(zhì)控品所含的特異性序列如seqidno.4所示。puc57重組質(zhì)粒構(gòu)成示意圖如圖3所示。陰性質(zhì)控品的制備：是以人類管家基因gapdh基因為模板，設(shè)計常規(guī)pcr引物，從人類組織細(xì)胞提取的基因組dna中進(jìn)行pcr擴增，獲得擴增產(chǎn)物，然后用重組dna基因工程的方法將擴增產(chǎn)物人工裝配到ptg19-t質(zhì)粒載體中，再通過轉(zhuǎn)化大腸桿菌、質(zhì)粒擴增和質(zhì)粒提取等步驟獲得重組質(zhì)粒dna，此質(zhì)粒dna就是本發(fā)明試劑盒中所使用的陰性質(zhì)控品，該陰性質(zhì)控品所含的特異性序列如seqidno.7所示。ptg19-t質(zhì)粒載體構(gòu)成示意圖如圖4所示。其中，陰性質(zhì)控品制備中的設(shè)計的常規(guī)pcr引物如下：正向引物：5’-caaaggccaggctgtaaatg-3’(seqidno.5)；反向引物：5’-agagacaagaggcaagaagg-3’(seqidno.6)。3、pcr反應(yīng)液pcr反應(yīng)液包括taq酶、dntp、緩沖液等成分，可以使用購自abi公司的熒光pcr反應(yīng)混合液，名稱是universalmastermixii,withung。實施例2：樣本總rna的提取和逆轉(zhuǎn)錄1、樣本總rna的提取使用的是qiagen公司的minikit(貨號74104)rna提取試劑盒，具體步驟參照說明書。2、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)將提取完的樣本的rna進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄所用試劑購自invitrogen公司的m-mlv反轉(zhuǎn)錄酶(貨號28025-021)。反應(yīng)體系20μl。具體步驟為：1)65℃，5min，冰敷，短暫離心。2)加入4μl5xfirst-strandbuffer，2μl0.1mdtt，1μlrnaseouttm。3)輕微混勻，37℃孵育2min。4)加入1μlm-mlv逆轉(zhuǎn)錄酶，用移液槍輕輕吹打均勻，25℃，10min。5)37℃，50min。6)70℃，15min。7)反應(yīng)結(jié)束后，將產(chǎn)物放-20℃保存。實施例3：標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作選取陽性質(zhì)控品作為標(biāo)準(zhǔn)物，稀釋濃度至1μg/ml，然后繼續(xù)以10倍梯度稀釋五個濃度，一共是6個濃度梯度，即1μg/ml、10-1μg/ml、10-2μg/ml、10-3μg/ml、10-4μg/ml、10-5μg/ml。然后進(jìn)行熒光pcr擴增反應(yīng)，用與abi7500儀器配套的軟件生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果如圖5和圖6所示，且儀器的系統(tǒng)顯示，反應(yīng)效率達(dá)88.9％。實施例4：風(fēng)疹病毒熒光pcr擴增反應(yīng)和結(jié)果分析1、熒光pcr擴增反應(yīng)采用的反應(yīng)體系如表1所示，在熒光pcr專用八聯(lián)管中配置好每個體系后，放入abi7500熒光pcr儀器中(或其它類型的開放式熒光定量pcr儀器)，準(zhǔn)備進(jìn)行反應(yīng)。每次實驗都需要配置1個陽性質(zhì)控品的反應(yīng)管作為陽性對照和一個陰性質(zhì)控品的反應(yīng)管作為陰性對照。表1體系內(nèi)容體積(μl)pcr反應(yīng)液10正向引物0.5反向引物0.5熒光探針0.5無菌水4.5待測樣本4總計20表1中的待測樣本為通過實施例2的方式制備得到的待測樣本。2、熒光pcr擴增反應(yīng)采用的反應(yīng)條件表2所示。表23、結(jié)果分析1)反應(yīng)結(jié)束后，首先，基線的選取設(shè)置為“自動”。閾值(threshold)設(shè)定的原則是閾值線剛好超過陰性質(zhì)控品的擴增曲線的最高點，使其ct值＝40或“undetermined”。2)設(shè)置好閾值后，觀察陽性質(zhì)控品的擴增曲線是否為正常的s型對數(shù)增長曲線，且ct值≤37。滿足上述條件則說明本次實驗反應(yīng)正常，否則，需要重做。3)結(jié)果判定。ct值≤37，表示該樣本結(jié)果為陽性，ct值>37或“undetermined”，表示該樣本結(jié)果為陰性。應(yīng)用實施例使用本發(fā)明試劑盒對收集到的124例組織樣本進(jìn)行了檢測。124例樣本為臨床收集的胎兒組織，分兩組：正常引產(chǎn)組(對照組)41例，自發(fā)性流產(chǎn)組(患病組)83例。按照上述實施例2：樣本總rna的提取和逆轉(zhuǎn)錄的程序進(jìn)行操作，分別提取所有樣本的rna并逆轉(zhuǎn)錄成cdna。隨后按照上述實施例4：風(fēng)疹病毒熒光pcr擴增反應(yīng)和結(jié)果分析，使用本發(fā)明試劑盒在abi7500熒光pcr儀進(jìn)行熒光pcr檢測，結(jié)果如下表3所示。表3從表中的結(jié)果可以得出，本發(fā)明試劑盒能夠成功檢測出風(fēng)疹病毒，并且從正常組和患病組的陽性率結(jié)果來看，本發(fā)明試劑盒可以很好地區(qū)分正常對照組和患病組,兩者陽性率的比率是1比8.89,也就是說患病組風(fēng)疹病毒的感染率是正常對照組的接近9倍,結(jié)果顯示本發(fā)明試劑盒具有很好的靈敏度和特異性，能夠作為檢測風(fēng)疹病毒的有效工具。大量臨床樣本的檢測對試劑盒的有效性、大規(guī)模使用性提供了保障。本發(fā)明試劑盒，風(fēng)疹病毒的反應(yīng)效率高達(dá)88.9％，具有較高的反應(yīng)效率。以上對本發(fā)明做了詳盡的描述，其目的在于讓熟悉此領(lǐng)域技術(shù)的人士能夠了解本發(fā)明的內(nèi)容并加以實施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，且本發(fā)明不限于上述的實施例，凡根據(jù)本發(fā)明的精神實質(zhì)所作的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。序列表<110>張家港藍(lán)蘇生物工程有限公司<120>一種特異性檢測風(fēng)疹病毒核酸的熒光pcr方法及試劑盒<130><160>7<170>patentinversion3.3<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>檢測風(fēng)疹病毒的正向引物<400>1tgcaacgtcaccactgaaca20<210>2<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>檢測風(fēng)疹病毒的反向引物<400>2ggacctggacctcgagttgtc21<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>檢測風(fēng)疹病毒的熒光探針<400>3ccgttctgcaacacgccgca20<210>4<211>791<212>dna<213>人工序列<220><223>試劑盒陽性質(zhì)控品所含的特異性序列<400>4ttgcgcgcgcatctggaatggcacacagcgcgcgtgcaccttctgggctgtcaacgccta60ctcctctggcgggtacgcgcagctggcctcttacttcaaccctggcggcagctactacaa120gcagtaccaccctaccgcgtgcgaggttgaacctgccttcggacacagcgacgcggcctg180ctggggcttccccaccgacaccgtgatgagcgtgttcgcccttgctagctacgtccagca240ccctcacaagaccgtccgggtcaagttccatacagagaccaggaccgtctggcaactctc300cgttgccggcgtgtcgtgcaacgtcaccactgaacacccgttctgcaacacgccgcacgg360acaactcgaggtccaggtcccgcccgaccccggggacctggttgagtacattatgaatta420caccggcaatcagcagtcccggtggggcctcgggagcccgaattgccacggccccgattg480ggcctccccggtttgccaacgccattcccctgactgctcgcggcttgtgggggccacgcc540agagcgcccccggctgcgcctggtcgacgccgacgaccccctgctgcgcactgcccctgg600acccggcgaggtgtgggtcacgcctgtcataggctctcaggcgcgcaagtgcggactcca660catacgcgctggaccgtacggccatgctaccgtcgaaatgcccgagtggatccacgccca720caccaccagcgacccctggcatccaccgggccccttggggctgaagttcaagacagttcg780cccggtggccc791<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>擴增陰性質(zhì)控品人工合成片段的正向引物<400>5caaaggccaggctgtaaatg20<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列<220><223>擴增陰性質(zhì)控品人工合成片段的反向引物<400>6agagacaagaggcaagaagg20<210>7<211>800<212>dna<213>人工序列<220><223>試劑盒陰性質(zhì)控品所含的特異性序列<400>7caaaggccaggctgtaaatgtcaccgggaggattgggtgtctgggcgcctcggggaacct60gcccttctccccattccgtcttccggaaaccagatctcccaccgcaccctggtctgaggt120taaatatagctgctgacctttctgtagctgggggcctgggctggggctctctcccatccc180ttctccccacacacatgcacttacctgtgctcccactcctgatttctggaaaagagctag240gaaggacaggcaacttggcaaatcaaagccctgggactagggggttaaaatacagcttcc300cctcttcccacccgccccagtctctgtcccttttgtaggagggacttagagaaggggtgg360gcttgccctgtccagttaatttctgacctttactcctgccctttgagtttgatgatgctg420agtgtacaagcgttttctccctaaagggtgcagctgagctaggcagcagcaagcattcct480ggggtggcatagtggggtggtgaataccatgtacaaagcttgtgcccagactgtgggtgg540cagtgccccacatggccgcttctcctggaagggcttcgtatgactgggggtgttgggcag600ccctggagccttcagttgcagccatgccttaagccaggccagcctggcagggaagctcaa660gggagataaaattcaacctcttgggccctcctgggggtaaggagatgctgcattcgccct720cttaatggggaggtggcctagggctgctcacatattctggaggagcctcccctcctcatg780ccttcttgcctcttgtctct800當(dāng)前第1頁12