本發(fā)明屬于生物檢測技術領域中的獸醫(yī)動物病原檢測，特別是涉及一種能夠特異性鑒別豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(i型和ii型)的普通pcr檢測試劑盒及其專用引物。

背景技術：

瘟病毒屬

瘟病毒屬包括粘膜病病毒群的病毒以及豬瘟病毒和羊邊界病病毒。病毒粒子呈圓形，有脂蛋白的囊膜，在細胞漿內(nèi)增殖和發(fā)育成熟，是最小的有囊膜的rna病毒(直徑約40nm)，內(nèi)含非螺旋狀的、有可能是二十面體對稱的核衣殼?；蚪M為單分子的單股rna，本身就可作為信息rna(mrna)。瘟病毒不能在無脊椎動物體內(nèi)增殖。血清學上與本屬內(nèi)的病毒呈現(xiàn)交叉反應，但與黃病毒科其它屬的病毒成員沒有交叉關系。

豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(i型和ii型)

豬瘟(classicalswinefever,csf)又稱豬霍亂(hogcholera，hc),是由豬瘟病毒(classicalswinefevervirus，csfv)引起的一種高度接觸性傳染病，世界動物衛(wèi)生組織(oie)將其列為必須通報的動物傳染病。豬瘟的臨床癥狀由急性、亞急性逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槁詼睾托?，臨床癥狀不典型，在豬瘟高發(fā)地區(qū)，主要采用常規(guī)的免疫接種進行豬瘟的預防。疫苗的品質(zhì)則直接決定豬群抵抗豬瘟病毒的能力，現(xiàn)常用的豬瘟疫苗有傳代細胞源、兔源等不同廠家的豬瘟疫苗，因豬瘟疫苗生產(chǎn)離不開細胞培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)最重要的原材料之一為血清，血清主要來源于牛血清。隨著牛群的進口引進，目前，牛病毒性腹瀉-粘膜病(bvd-md)分布于世界各地，從20世紀八、九十年代以來，在北美州，美國、加拿大bvd-md的感染率達到50％-85％；在歐洲、法國、德國，經(jīng)血清學調(diào)查結(jié)果顯示bvd-md的感染率為76％，瑞典的發(fā)病率在10％-80％之間，芬蘭肉牛的感染率不小于50％，希臘陽性率為1.3％-14％，立陶宛陽性率為70％-100％，瑞士和波蘭的平均陽性率分別為12.5％和86％；在南美洲，巴西、委內(nèi)瑞拉、秘魯、新西蘭及澳大利亞bvd-md的陽性率分別為15.1％-56％、36％-37％、50％-96％和89％。因牛病毒性腹瀉-粘膜病(bvd-md)病毒(bvdv)的廣泛存在，生產(chǎn)豬瘟疫苗等疫苗類產(chǎn)品時為避免原材料血清被bvdv污染，需要建立一種快速、簡單的對牛血清中的bvdv進行檢測的方法。

csfv和bvdv的檢測

由于csfv和bvdv是同一個屬的成員，同源性高，具有很強的血清學交叉反應，生產(chǎn)豬瘟細胞苗常利用牛睪丸細胞和胎牛血清來擴大培養(yǎng)豬瘟病毒，若牛睪丸細胞或胎牛血清被bvdv污染，會直接導致豬瘟細胞苗污染bvdv病毒，導致csfv疫苗不純凈，并且，用含有bvdv抗體的血清進行cfsv病毒的體外培養(yǎng)對cfsv病毒具有抑制作用，因此為保證豬瘟細胞源疫苗的安全性及有效性，bvdv病毒和csfv病毒的鑒別尤為重要。常規(guī)的鑒別是對bvdv病毒和csfv病毒分別檢測，常用的csfv和bvdv檢測方法有瓊脂擴散試驗、免疫熒光技術、酶聯(lián)免疫吸附試驗、動物接種試驗、病毒中和試驗、常規(guī)pcr試驗和rt-pcr試驗等，因瓊脂擴散試驗、免疫熒光技術、酶聯(lián)免疫吸附試驗、動物接種試驗和病毒中和試驗費時、費力，并且成本較高，現(xiàn)常用的檢測方法為pcr技術，由于實時熒光定量pcr技術的儀器昂貴、成本高，因此普通pcr檢測技術為首選的csfv和bvdv的檢測技術。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個目的是提供用于對i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(bvdv)進行普通pcr檢測的引物，并實現(xiàn)牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(bvdv)與豬瘟病毒(csfv)的鑒別。

本發(fā)明所提供的用于對i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒進行普通pcr檢測的引物為：上游引物(pu-bvdv-f)的核苷酸序列如序列表中sedidno：1所示，下游引物(pu-bvdv-r)的核苷酸序列如序列表中seqidno：2所示。

由上述引物衍生的引物序列也屬于本發(fā)明內(nèi)容。所述衍生序列是指在seqidno：1和/或seqidno：2的基礎上經(jīng)過一至十個堿基的取代、缺失或添加得到的引物序列。

本發(fā)明的第二個目的是提供用于對i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(bvdv)進行普通pcr檢測的試劑盒。

本發(fā)明所提供的普通pcr檢測試劑盒，包括上述用于對i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒進行普通pcr檢測的引物。

具體來講，所述試劑盒還包括以下用于25μl普通pcr反應體系的試劑：一步法pcr反應液2×onesteprt-pcrbufferiii12.5μl(購于takara公司)，takaraextaqhs0.5μl(購于takara公司)，primescriptrtenzymemixii0.5μl(購于takara公司)，pu-bvdv-f(20μm)0.5μl，pu-bvdv-r(20μm)0.5μl，rna-freeh2o8.5μl，核酸模板2μl。該體系中引物稀釋至20μm，反應體系中最終加量為0.4μmol/l。

為方便檢測，所述試劑盒中還包括陽性對照和陰性對照，所述陽性對照為牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒i型和ii型基因組rna，所述陰性對照為不含i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒的反應體系，如h2o(雙蒸水、無菌去離子水等)。

本發(fā)明的第三個目的是提供所述引物或試劑盒在對i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(bvdv)進行非疾病診斷目的的檢測、或在對牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(bvdv)與豬瘟病毒(csfv)進行非疾病診斷目的的鑒別的應用。

該應用之一為一種用上述普通pcr檢測試劑盒及普通pcr技術對i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(bvdv)進行非疾病診斷目的的定性檢測的方法，該普通pcr檢測方法包括以下步驟：

1)提取待測樣品的基因組rna，以提取的基因組rna為模板，在上述引物引導下進行普通pcr擴增檢測；

2)用得到的pcr擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，實現(xiàn)對i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(bvdv)的定性檢測，出現(xiàn)預期目的條帶“233bp”表明待測樣品中含有i型和/或ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(bvdv)，若無預期目的條帶則表明待測樣品中無i型和/或ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(bvdv)。

應用之二為一種非疾病診斷目的的鑒別i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(bvdv)與豬瘟病毒(csfv)的方法，在上述步驟后還包括：

3)結(jié)果判定：

本發(fā)明的普通pcr檢測方法只對bvdv樣品有擴增條帶而對csfv樣品無擴增條帶，本發(fā)明充分利用兩者基因序列的差異，在pu-bvdv-f序列上篩選出較好的8個位點(自5’端148、152、155、156、160、164、166、170位點)，在pu-bvdv-r序列上篩選出較好的1個位點(自5’端355位點)，用pu-bvdv-f和pu-bvdv-r可同時擴增i型和ii型bvdv，pcr擴增若出現(xiàn)預期擴增條帶“233bp”可以確認其為i型和/或ii型bvdv病毒，因與csfv序列具有8個堿基的差異無法擴增csfv序列(未出現(xiàn)預期條帶)，從而實現(xiàn)鑒別i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(bvdv)與豬瘟病毒(csfv)的目的。

具體判定方法：pcr擴增若出現(xiàn)預期擴增條帶“233bp”，則確認為bvdv陽性(樣品中含有i型和/或ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒)，無預期擴增條帶出現(xiàn)，則確認為bvdv陰性(樣品中不含有i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒)。

在上述方法中，所述步驟1)中的待測樣品可以為采自犢牛用于疫苗生產(chǎn)的血清，也可以為犢牛睪丸分離的原代細胞，對其檢測用于非診斷目的。通過對此類待測樣品中bvdv病毒的定性檢測以實現(xiàn)對基于犢牛的產(chǎn)品及原料的監(jiān)控，并為后續(xù)原料處置提供客觀數(shù)據(jù)。

所述步驟1)和步驟2)中的25μl普通pcr反應體系可包括：模板2μl，一步法pcr反應液2×onesteprt-pcrbufferiii12.5μl(購于takara公司)，takaraextaqhs0.5μl(購于takara公司)，primescriptrtenzymemixii0.5μl(購于takara公司)，pu-bvdv-f(20μm)0.5μl，pu-bvdv-r(20μm)0.5μl，rna-freeh2o8.5μl。引物稀釋為20μm，反應體系中最終加量為0.4μmol/l。

所述步驟1)和步驟2)中的普通pcr反應條件可為：先52℃15min，95℃5s；然后94℃5s，56℃30s，72℃45s，35個循環(huán)；最后終延伸72℃7min。

本發(fā)明提供了一種可特異性鑒別豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(i型和ii型)的普通pcr檢測試劑盒及其專用引物。本發(fā)明能對i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒實施快速檢測，可為豬瘟病毒疫苗生產(chǎn)過程中的質(zhì)量監(jiān)控提供有力依據(jù)，確保疫苗接種的安全性和純凈性，對豬瘟病毒疫苗的生產(chǎn)具有指導作用；還可以對犢牛來源原材料的質(zhì)量進行監(jiān)控，并為后續(xù)處置提供客觀數(shù)據(jù)，以保證犢牛血清、細胞及其制品的安全性。本發(fā)明的試劑盒和檢測方法操作簡便、特異性強、靈敏度高、重復性好，不僅可用于i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒的檢測，更可以實現(xiàn)牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(bvdv)和豬瘟病毒(csfv)的鑒別，將在i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒的檢測(包括臨床診斷中臨床病料或培養(yǎng)物中i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒的準確檢測)及疫苗生產(chǎn)和犢牛制品生產(chǎn)(非診斷目的的應用)中發(fā)揮重要作用，應用前景廣闊。

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。

附圖說明

圖1為本發(fā)明用普通pcr技術對i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(bvdv)進行定性檢測的技術路線

圖2為16份臨床疑似血清病料i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(bvdv)的檢測結(jié)果

圖3為i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(bvdv)的普通pcr檢測方法的特異性檢測結(jié)果

圖4為i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(bvdv)的普通pcr檢測方法的靈敏度檢測結(jié)果

圖5為i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(bvdv)的普通pcr檢測方法的重復性檢測結(jié)果

圖6為10份csfv疫苗半成品中外源病毒i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(bvdv)的檢測結(jié)果

具體實施方式

下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，具體步驟可參見：《molecularcloning:alaboratorymanual》(sambrook，j.，russell，davidw.，molecularcloning:alaboratorymanual，3rdedition，2001，ny，coldspringharbor)。

所述百分比濃度如無特別說明均為質(zhì)量/質(zhì)量(w/w，單位g/100g)百分比濃度、質(zhì)量/體積(w/v，單位g/100ml)百分比濃度或體積/體積(v/v，單位ml/100ml)百分比濃度。

實施例中描述到的各種生物材料的取得途徑僅是提供一種實驗獲取的途徑以達到具體公開的目的，不應成為對本發(fā)明生物材料來源的限制。事實上，所用到的生物材料的來源是廣泛的，任何不違反法律和道德倫理能夠獲取的生物材料都可以按照實施例中的提示替換使用。

所用引物由北京華大基因有限公司合成。

實施例在以本發(fā)明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，實施例將有助于理解本發(fā)明，但是本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施例。

生物基因組是直接反應生物基本信息的一個最客觀的指標，不同的病毒所含有的基因組信息不同，通過基因組信息可將不同的病毒分類至不同的族群，利用基因組堿基互補配對的原則，可實現(xiàn)特異位點基因序列的大量擴增，從而通過一定的方法使得肉眼可見。

如圖1所示，本發(fā)明基于以上基本原理設計了1對特異性引物，利用堿基互補配對的原理，建立了一種特異性檢測i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(bvdv)的普通pcr檢測方法。

實施例1、設計用普通pcr技術檢測i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(bvdv)的引物

檢測序列的選?。号２《拘愿篂a-粘膜病病毒(bvdv)的常規(guī)pcr檢測，有文獻介紹其檢測序列為5’utr，然而，由于csfv和bvdv的5’utr基因區(qū)域的高相似性原因，導致已有文獻報道的檢測序列存在無法鑒別csfv和bvdv的問題。本發(fā)明首先從檢測序列上進行突破，從ncbi的核酸數(shù)據(jù)庫genbank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)對bvdv不同毒株基因進行大量檢索，獲得i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(bvdv)的5’utr區(qū)域基因(bvdvi型genbank號：kc963967，序列表中sedidno：3；bvdvii型genbank號：kc176779.1，序列表中sedidno：4)的序列，用dnaman軟件進行比對后，根據(jù)引物設計原則，通過分析研究，篩選、比較、確定在bvdv不同毒株之間相對保守的一段基因作為檢測序列。最終，選取i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒的5’utr區(qū)域基因的特異性保守序列(自5’端第147-379位堿基，序列表中sedidno：5)作為檢測序列。

引物設計：基于確定的檢測序列，用primerexpress6.0軟件設計對i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒進行普通pcr檢測的引物，獲得4組引物，經(jīng)分析、比較、實驗，最終確定的引物序列如下：

pu-bvdv-f(上游引物)：5’-gtgagttcg/a/tttggatggcc/tgaag/tc-3’(序列表中sedidno：1)

pu-bvdv-r(下游引物)：5’-gtgccatgtacagcagagattttta-3’(序列表中sedidno：2)。

以上檢測引物確定過程中，本發(fā)明還充分考慮了利用該引物檢測中對bvdv和csfv的鑒別，因此，還充分考慮了兩者基因序列的差異，在pu-bvdv-f序列上篩選出較好的8個位點(自5’端148、152、155、156、160、164、166、170位點)，在pu-bvdv-r序列上篩選出較好的1個位點(自5’端355位點)，用pu-bvdv-f和pu-bvdv-r可同時擴增i型和ii型bvdv，pcr擴增若出現(xiàn)預期擴增條帶“233bp”可以確認其為i型和/或ii型bvdv病毒，因與csfv序列具有8個堿基的差異無法擴增csfv序列(未出現(xiàn)預期條帶)，從而實現(xiàn)鑒別i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(bvdv)與豬瘟病毒(csfv)的目的。

實施例2、用本發(fā)明的引物對i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(bvdv)進行普通pcr檢測

一、提取待測樣品的基因組rna

分別對滅活的i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒的細胞培養(yǎng)物(陽性對照)以及待測樣品提取基因組rna，具體方法包括以下步驟(axyprep^tmbodyfluidviraldna/rnaminiprepkit，axygen公司)：

(1)axygen試劑盒準備：按試劑盒說明書，預先配制含1％冰乙酸的異丙醇和在試劑bufferw1a和bufferw2中添加指定濃度的無水乙醇。

(2)在1.5ml離心管中加入200ul的待檢樣品，并加入200μlbufferv-l，漩渦振蕩混勻后，靜置5min.

(3)在步驟(2)的1.5ml樣品及試劑混合離心管中加75μlbufferv-n，漩渦振蕩混勻，12000g離心5min。

(4)將上清轉(zhuǎn)移至2ml離心管(試劑盒內(nèi)提供)中，加300μl異丙醇(1％冰乙酸)，上下倒置6-8次，混合均勻。

(5)將制備管置于2ml離心管中(試劑盒內(nèi)提供)中，取步驟(4)的混合液移入制備管中，6000g離心1min。

(6)棄濾液，將制備管置回至2ml離心管中，加500μlbufferw1a，室溫靜置1min。12000g離心1min。

(7)棄濾液，將制備管置回至2ml離心管中，加800μlbufferw2，12000g離心1min。

(8)將制備管置回到2ml離心管中，12000g離心1min。

(9)將制備管置于潔凈的1.5ml離心管(試劑盒內(nèi)提供)中，在制備管膜中央加40ul無酶水，室溫靜置1min，12000g離心1min洗脫rna。

二、待測樣品中i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(bvdv)的普通pcr檢測

1、待測樣品和陰性和陽性對照pcr擴增

對步驟一提取的來自i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒的基因組rna、陰性對照和待測樣品rna進行pcr擴增，25μl反應體系如下：

表1i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒5’utr區(qū)域基因的pcr擴增體系

反應體系中引物最終加量為0.4μmol/l。

pcr反應循環(huán)條件如下：

表2i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒5’utr區(qū)域基因的pcr循環(huán)條件

2、待測樣品和陰性和陽性對照pcr產(chǎn)物電泳檢測

將pcr擴增產(chǎn)物進行2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，電壓為110v，電泳40min。

3、對i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(bvdv)血清樣品的普通pcr檢測

本實施例用本發(fā)明建立的牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒i型和ii型的普通pcr檢測方法對所收集的16份臨床疑似血清病料(待測樣品)提取的rna進行檢測，以滅活的i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒細胞培養(yǎng)物提取的rna為陽性對照，以無酶水為陰性對照，根據(jù)普通pcr檢測結(jié)果，以是否出現(xiàn)“233bp”擴增條帶為標準對臨床樣本是否感染i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒進行判定(出現(xiàn)判定為陽性，未出現(xiàn)判定為陰性)。

結(jié)果如圖2(m1：2000bpmarker；m2：100bpdnaladder；1：0627-1(結(jié)果：陰性)；2：0627-2(結(jié)果：陽性)；3：0627-3(結(jié)果：陽性)；4：0627-4(結(jié)果：陽性)；5：0627-5(結(jié)果：陽性)；6：0627-6(結(jié)果：陰性)；7：0627-7(結(jié)果：陰性)；8：0627-8(結(jié)果：陰性)；9：0627-9(結(jié)果：陰性)；10：0627-10(結(jié)果：陰性)；11：0627-11(結(jié)果：陰性)；12：0627-12(結(jié)果：陰性)；13：0627-13(結(jié)果：陰性)；14：0627-14(結(jié)果：陰性)；15：0627-15(結(jié)果：陰性)；16：0627-16(結(jié)果：陽性)；ntc：空白對照(結(jié)果：成立)；—：陰性對照(結(jié)果：成立)；+：陽性對照(結(jié)果：成立))所示，所檢測的16份疑似血清中有5份血清判定為陽性(說明感染了i型和/或ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒)，11份血清判定為陰性(說明未感染i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒)。

實施例3、本發(fā)明檢測方法的特異性實驗

按照實施例2所述方法用dna/rna同時提取的axygen試劑盒(購自康寧生命科學(吳江)有限公司)對i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(bvdv)、牛鼻氣管炎病毒(ibrv)、豬瘟病毒(csfv)和口蹄疫病毒(fmdv)提取rna，對偽狂犬病毒(prv)、羊口瘡病毒(orfv)、羊痘病毒和布魯氏菌病細菌提取dna，同時以滅活的i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒細胞培養(yǎng)物提取的rna為陽性對照，以無酶水為陰性對照，在本發(fā)明引物的引導下進行普通pcr檢測，pcr反應體系及反應條件參照實施例2，以驗證該方法的特異性。

檢測結(jié)果如圖3(m：2000bpmarker；1：ibrv病毒；2：csfv病毒；3：bvdv病毒；4：fmdv病毒；5：羊口瘡病毒；6：羊痘病毒；7：布病細菌；8：偽狂犬病毒；9：ntc(空白對照))所示，僅有bvdv出現(xiàn)預期的擴增條帶“233bp”，結(jié)果陽性，其它樣品未出現(xiàn)預期擴增條帶，結(jié)果陰性。檢測結(jié)果表明用本發(fā)明的方法可特異性地檢測出i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒。

實施例4、本發(fā)明檢測方法的靈敏度實驗

按照實施例2所述，將攜帶牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒的陽性核酸樣品，采用nanodrop儀器測定濃度后，按照10倍梯度依次進行稀釋，分別稀釋至濃度為1.5ng/μl、0.15ng/μl、0.015ng/μl、1.5pg/μl、0.15pg/μl、0.015pg/μl、1.5fg/μl、0.15fg/μl、0.015fg/μl、0.0015fg/μl，以不同濃度的核酸樣品作為模板，在本發(fā)明引物的引導下進行普通pcr檢測，pcr反應體系及反應條件參照實施例2，以驗證該方法的靈敏度。

檢測結(jié)果如圖4(m：2000bpmarker；1：1.5ng/μl；2：0.15ng/μl；3：0.015ng/μl；4：1.5pg/μl；5：0.15pg/μl；6：0.015pg/μl；7：1.5fg/μl；8：0.15fg/μl；9：0.015fg/μl；10：0.0015fg/μl；11：陰性對照；12：ntc(空白對照))所示，顯示本發(fā)明i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒的普通pcr檢測方法的檢測敏感度為1.5pg/μl。

實施例5、本發(fā)明檢測方法的重復性實驗

按照實施例2所述，將10倍梯度稀釋的1.5ng/μl、0.15ng/μl、0.015ng/μl、1.5pg/μl共4個梯度的核酸樣品，每個樣品進行3個重復，在本發(fā)明引物的指導下進行普通pcr檢測，pcr反應體系及反應條件參照實施例2，以驗證該方法的重復性。

檢測結(jié)果如圖5(m：2000bpmarker；1、5、9：1.5ng/μl；2、6、10：0.15ng/μl；3、7、11：0.015ng/μl；4、8、12：1.5pg/μl)所示，從圖中可見每一個濃度梯度的3個重復樣，檢測結(jié)果一致，表明本發(fā)明i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒的普通pcr檢測方法的重復性較好。

實施例6、檢測i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(bvdv)的普通pcr檢測試劑盒

基于實施例1和2，本發(fā)明所提供的普通pcr檢測試劑盒，包括用于對i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒進行普通pcr檢測的引物(pu-bvdv-f和pu-bvdv-r)。使用中引物稀釋為20μm，反應體系中引物最終加量為0.4μmol/l。

具體來講，該試劑盒包括以下用于25μl普通pcr反應體系的試劑：一步法pcr反應液2×onesteprt-pcrbufferiii12.5μl(購于takara公司)，takaraextaqhs0.5μl(購于takara公司)，primescriptrtenzymemixii0.5μl(購于takara公司)，pu-bvdv-f(20μm)0.5μl，pu-bvdv-r(20μm)0.5μl，rna-freeh2o8.5μl和模板2μl。

為方便檢測，試劑盒中還可包括陽性對照和陰性對照，所述陽性對照為牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒i型和ii型基因組rna，所述陰性對照為不含牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒i型和ii型的反應體系，如h2o(雙蒸水、無菌去離子水等)。

試劑盒中各試劑的使用可參考實施例2的內(nèi)容。

實施例7、csfv疫苗生產(chǎn)過程中對i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病外源病毒的普通pcr檢測

本實施例對csfv疫苗生產(chǎn)(csfv疫苗生產(chǎn)方法可參考文獻《豬瘟活疫苗生產(chǎn)工藝改進現(xiàn)狀》，廣東畜牧獸醫(yī)科技，2012-08-18，謝文強，金宇保靈生物藥品有限公司)中半成品樣品中的i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病外源病毒進行檢測，檢測方法與實施例2相同，待檢樣品為csfv疫苗半成品1-10號

檢測結(jié)果如圖6(m：100bpdnaladder；1：01#疫苗(結(jié)果：陰性)；2：02#疫苗(結(jié)果：陰性)；3：03#疫苗(結(jié)果：陰性)；4：04#疫苗(結(jié)果：陰性)；5：05#疫苗(結(jié)果：陰性)；6：06#疫苗(結(jié)果：陰性)；7：07#疫苗(結(jié)果：陽性)；8：08#疫苗(結(jié)果：陽性)；9：09#疫苗(結(jié)果：陰性)；10：10#疫苗(結(jié)果：陰性)；11：陰性對照(結(jié)果：成立)；12：陽性對照(結(jié)果：成立))所示，從圖中可見在10份csfv疫苗半成品中，2份有外源病毒bvdv的污染，8份無外源病毒bvdv的污染，可見csfv疫苗生產(chǎn)過程中監(jiān)控外源病毒bvdv非常有必要，也顯示本發(fā)明能夠特異性鑒別豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒(i型和ii型)，可為豬瘟病毒疫苗生產(chǎn)過程中的質(zhì)量監(jiān)控提供有力依據(jù)，確保疫苗接種的安全性和純凈性。

序列表

<110>金宇保靈生物藥品有限公司

<120>鑒別豬瘟病毒和牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒的pcr檢測試劑盒及其專用引物

<130>cgcnb175056w

<160>5

<210>1

<211>24

<212>dna

<213>pu-bvdv-f（上游引物）,d為g或a或t，y為c或t，k為g或t

<220>

<223>

<400>1

gtgagttcdttggatggcygaakc24

<210>2

<211>25

<212>dna

<213>pu-bvdv-r（下游引物）

<400>2

gtgccatgtacagcagagattttta25

<210>3

<211>12301

<212>dna

<213>i型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒：kc963967全基因

<400>3

gtatacgagaatttgcctaacctcgtatacgtattggacactctaaaaaataattaggtc60

tagggaaaatcctccttagcgaaggccgaaaagaggctagccatgcccttagtaggacta120

gcaacataaggggggtagcaacagtggtgagttcgttggatggctgaagccctgagtaca180

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taaaaggtggatacaatgcatcctcagcttagtagctggggtgttccttattcggagcct4080

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tgtcaagactgacgtggaaaagagttggcttggggggttagactacaaaacaattgactc4380

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tatagtgacaggccttaaaagaatggctgtcactgtgggtgaacaagctcagcggagagg6660

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gttgtctgaactagttgattacaaggggactttcttggacagggaagccttggaagctct9660

cagtctggggcggccaaagcccaagcaggtgaccacagccacagttagggagttattaga9720

gcaggaggcgcaagtcgagatccccagttggtttggcgcagatgatccagtcttcttgga9780

agtggctctgaagggcgacaaatatcacttagtaggagatgtagacaaagtgaaagatca9840

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ttataccatgaagctgtctagttggttccttcaggcatcaaataagcagatgagtttgac9960

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cggtgccagcagctgaaacaaaatgtatatattgtaaataaatcaatccatgtacatatt12120

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c12301

<210>4

<211>260

<212>dna

<213>ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒：kc176779.1（其5’端基因）

<400>4

catgcccatagtaggactagcaaagagaggggactagcggtagcagtgagttcattggat60

ggccgaatccctgagtacagggaagtcgtcaatggttcgacgctctggcaacaaagagcc120

tcgagatgccatgtggacgagggcatgcccacggcacatcttaacctatgcgggggttgc180

gtaggtgaaagcatcatcttgagatgttatggacacagcctgatagggtgtagcagagac240

ctgctattccgctagtataa260

<210>5

<211>233

<212>dna

<213>i型和ii型牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒的5’utr區(qū)域基因的特異性保守序列（自5’端第147-379位堿基）

<400>5

gtgagttcgttggatggctgaagccctgagtacagggtagtcgtcagtggttcgacgctt60

tggaggacaagcctcgagatgccacgtggacgagggcatgcccacagcacatcttaacat120

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gtgctgcagaggcccactgtattgctactgaaaatctctgctgtacatggcac233