本發(fā)明涉及微生物，具體是一種香灰菌黑色素發(fā)酵制備方法。
背景技術(shù)：
黑色素是目前應(yīng)用最多最廣的生物天然色素之一，是一類由酚和（或）吲哚化合物聚合氧化而成的高分子聚合物，其廣泛存在于動物、植物中，從烏賊、核桃皮等中提得的黑色素均被報道具有較強(qiáng)的抗氧化、清除自由基等功效且具有延緩衰老、烏發(fā)潤膚、舒氣止脹、清熱解毒、壯陽補(bǔ)腎、軟化血管、下淤血、消浮腫、抗肥胖、制風(fēng)熱、添精神等功效，還可防治各種中老年疾病，如高血壓、心臟病、糖尿病、腎炎、血管硬化、癌癥及肝臟疾病等。傳統(tǒng)的黑色素合成主要釆用酶法和化學(xué)法，但是由于原料以及酪氨酸酶價格昂貴，合成流程復(fù)雜，成本較高，不利于大規(guī)模工廠化生產(chǎn)。如今已有許多學(xué)者利用細(xì)菌、霉菌或者真菌生產(chǎn)黑色素，考慮到菌種安全性，大多數(shù)菌株（如：大腸桿菌、蘇云金芽孢桿菌等）生產(chǎn)的黑色素難以在食品加工中使用。香灰菌作為銀耳菌株的伴生菌其菌絲體和發(fā)酵液中都含有黑色素經(jīng)研究表明，該黑色素結(jié)構(gòu)與黑木耳中黑色素、合成黑色素的結(jié)構(gòu)基本一致，且其抗氧化活性強(qiáng)于合成黑色素。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種香灰菌黑色素發(fā)酵制備方法。
通過從銀耳菌包中分離出的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)黑色素的香灰菌株，通過搖瓶發(fā)酵可產(chǎn)黑色素。提取發(fā)酵液中的黑色素并測定其含量。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
一種香灰菌黑色素發(fā)酵制備方法，包括以下步驟：將從銀耳菌包中分離的高產(chǎn)黑色素香灰菌株發(fā)酵液除去菌絲體后，用強(qiáng)酸破壞發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)，在將黑色素通過堿性溶液沉淀出來，收集沉淀得到黑色素粗提物，再進(jìn)行純化。再通過動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)所提取的黑色素具有一定的保肝功效。具體為：
將獲得的香灰菌株接入液體培養(yǎng)基中，搖瓶發(fā)酵3d時即開始產(chǎn)黑色素，發(fā)酵7天時提取其發(fā)酵液中的黑色素。
除去發(fā)酵液中菌絲體，將發(fā)酵液于3mol/L鹽酸中，發(fā)酵液與鹽酸的體積比為1：10
，在60~70℃水浴1.5小時后心，留沉淀，向上述所得沉淀中加入150ml 2mol/L NaOH ，超聲提取2h后再通過離心棄沉淀留上清。用鹽酸調(diào)節(jié)上清液pH至1.5~2.0。將上清液放入70℃水浴鍋中14h。之后再通過離心，棄上清。最后將沉淀用去離子水洗滌3~5次。
檢測得到其色素含量為2500-3000mg/L，經(jīng)紅外質(zhì)譜測定發(fā)現(xiàn)，該黑色素結(jié)構(gòu)與黑木耳子實(shí)體中提取的黑色素相似且高于黑木耳液體發(fā)酵所得。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：通過從香灰菌菌株發(fā)酵液中提取黑色素方法，提高黑色素產(chǎn)量。采用香灰菌菌株發(fā)酵法制備黑色素，縮短黑色素提取時間成本較低，得到黑色素的率為5%左右,適用于大規(guī)模工廠化生產(chǎn)，并可促進(jìn)其后續(xù)生物產(chǎn)品的開發(fā)。
附圖說明
圖1 香灰菌黑色素紅外光譜圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
將香灰菌株接入100ml液體培養(yǎng)基中，接種量為3%，搖瓶發(fā)酵7天；除去發(fā)酵液中菌絲體，將發(fā)酵液于3mol/L鹽酸中，體積比為1：10，在65℃水浴1.5小時后離心，留沉淀，向上述所得沉淀中加入150ml 2mol/L NaOH， 超聲提取2h后再通過離心棄沉淀留上清；用鹽酸調(diào)節(jié)上清液pH至2.0；將上清液放入70℃水浴鍋中14h；之后再通過離心，棄上清；最后將沉淀用去離子水洗滌4次；得到黑色素。
得到較純的黑色素。檢測的其色素含量為2500-3000mg/L，經(jīng)紅外質(zhì)譜測定發(fā)現(xiàn)，該黑色素結(jié)構(gòu)與黑木耳子實(shí)體中提取的黑色素相似且高于黑木耳液體發(fā)酵所得。
對提取到的黑色素進(jìn)行紅外光譜分析發(fā)現(xiàn)其結(jié)構(gòu)有以下特征：1 ) 在波數(shù)3432.57cm-1 處都有較寬而強(qiáng)的吸收峰，說明存在－ NH 結(jié)構(gòu)；1456.46 cm-1 處的吸收峰是自由羧基基團(tuán)－ COOH 引起的振動；1652.56cm-1 處吸收峰是C=O 的非對稱振動及N－H變角振動形成，說明可能存在－COOH；1384.73cm-1 處吸收峰是C － CH3 的彎曲和骨架振動吸收參與形成；600～700cm-1 范圍的吸收帶很弱，表明苯環(huán)被取代，形成共軛體系。2)香灰菌黑色素都在波數(shù)2923.88cm-1 與2852.23cm-1 左右處有吸收峰可能是由于C －H 伸縮振動形成，即為－ CH 和－ CH2 的共振吸收峰。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。