本發(fā)明涉及天然產(chǎn)物分離純化領(lǐng)域，具體涉及一種快速制備高純度羥基-γ-山椒素的方法。

背景技術(shù)：

花椒油是直接用食用油浸泡花椒或采用有機(jī)溶劑浸提、超臨界co2萃取等方法制得的花椒油樹脂與食用油適量混合所制成的具有麻香味的調(diào)味油?；ń酚偷募庸ご蟠鬁p少了花椒在貯藏和銷售等環(huán)節(jié)中造成有效成分的損失和微生物污染，解決了花椒粒和花椒粉劑給烹飪及食用帶來的不便，因此越來越受消費者青睞。但目前花椒油市場并不規(guī)范，產(chǎn)品標(biāo)簽大多只標(biāo)明原料，而作為花椒油重要指標(biāo)的麻味物質(zhì)含量并沒有出現(xiàn)在標(biāo)簽上。如何分離出高純度花椒麻味物質(zhì)，以作為花椒及其產(chǎn)品麻味定量的標(biāo)準(zhǔn)品一直是國內(nèi)研究的熱點，也是各花椒生產(chǎn)企業(yè)關(guān)注的焦點。

在花椒的應(yīng)用中，最重要的仍然是它的風(fēng)味，由多不飽和酰胺引起的強烈的麻味是花椒能成為中國“八大味”之一的重要品質(zhì)指標(biāo)?；ń分械穆槲妒怯甚０奉愇镔|(zhì)（麻味物質(zhì)）引起的，研究表明這些物質(zhì)包括γ-山椒素、羥基-γ-山椒素、β-山椒素、羥基-β-山椒素、γ-山椒素、羥基-γ-山椒素、羥基-ε-山椒素、羥基-γ-異山椒素、花椒素、異花椒素等。山椒素又可分為α-山椒素、β-山椒素、γ-山椒素、羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素、羥基-γ-山椒素、羥基-ε-山椒素等，且其中的羥基-α-山椒素和羥基-γ-山椒素的相對含量明顯大于其他的山椒素。這些山椒素在200nm到300nm都有紫外吸收現(xiàn)象，并在270nm處出現(xiàn)了最大吸收峰。

從花椒中提取、分離、純化得到高純度的酰胺類物質(zhì)是一種極其困難的方法。03132341.3公開了一種利用超臨界流體技術(shù)分離花椒麻味成分的工藝，該工藝設(shè)備操作技術(shù)要求較高，且所制備的麻味成分為初步提取物，這類方法需要較強的操作經(jīng)驗，實驗的重復(fù)性極差，結(jié)果不穩(wěn)定，耗時長，且所制備的麻味成分為初步提取物，只能用于工業(yè)化生產(chǎn)中，作為食品和藥品的原料，不適宜作為麻味定量的標(biāo)準(zhǔn)品。而201210175527.9使用薄層層析法從花椒油中提取高純度羥基山椒素的方法，雖然填補了這方面的空白，但制備過程中仍然使用到液相色譜的色譜柱，制備成本增加。

針對上述問題，本發(fā)明采用恒溫振蕩提取、正己烷萃取以及紫外照射三步法對花椒油中的羥基-γ-山椒素進(jìn)行提取，在操作過程中加入了鐵粉作為催化劑，提高了產(chǎn)品的純度。此外該制備方法不需要特殊的儀器設(shè)備，使得制備方法相比于傳統(tǒng)的柱層析法更加簡單、耗時更短、成本低，極大的提高了工作效率。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點，本發(fā)明的技術(shù)方案是提供了一種快速制備高純度羥基-γ-山椒素的方法。該方法操作簡單，不需要專業(yè)性太強的技術(shù)人員進(jìn)行操作，同時耗費時間明顯縮短，制作過程中無需使用制備型或半制備型高效液相色譜儀，降低了制備成本，且獲得的羥基-γ-山椒素的純度高。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：

一種快速制備高純度羥基-γ-山椒素的方法：

（1）以花椒油作為原料，向花椒油中加入甲醇，然后依次進(jìn)行震蕩、超聲、離心，獲取上清液；

（2）向上清液中加入正己烷進(jìn)行萃取，得到下層清液；

（3）對下層清液進(jìn)行層析、過濾，最終將濾液進(jìn)行減壓蒸干，獲得粗提取物；

（4）粗提取物溶于甲醇后加入鐵粉再轉(zhuǎn)移至血清瓶內(nèi)，進(jìn)行紫外燈照射，照射結(jié)束后行減壓蒸干即可獲得羥基-γ-山椒素。

進(jìn)一步的，本發(fā)明中花椒油與甲醇的體積比為1:20，所述花椒油為紅花椒油。

進(jìn)一步的，步驟（1）中采用恒溫震蕩器震蕩，溫度為40℃，震蕩時間為1h，轉(zhuǎn)速為160rpm。

進(jìn)一步的，步驟（1）中超聲時間為5min。

進(jìn)一步的，步驟（1）中離心速度為4000r/min，離心時間為15min。

進(jìn)一步的，所述上步驟（2）中上清液和正己烷的料液比1：2，萃取次數(shù)3次；所述步驟（2）過濾為0.22μm有機(jī)系濾膜過濾。

進(jìn)一步的，所述步驟（3）減壓蒸干采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸干，干燥條件為真空度0.09mpa，溫度為45℃，干燥時間2h。

進(jìn)一步的，所述步驟（4）中甲醇為色譜級甲醇，用量20ml，所述鐵粉為10~20mg。

進(jìn)一步的，所述紫外燈功率為20w，波長為254nm，照射的距離為20cm，照射的時間為4~6h。

進(jìn)一步的，所述步驟（4）減壓蒸干采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸干，干燥條件為真空度0.09mpa，溫度為45℃，干燥時間1h。

本發(fā)明構(gòu)思為：本發(fā)明首先采用甲醇將花椒油中的山椒素提取出來，提取后進(jìn)行震蕩、超聲、離心，將油脂及油溶性物質(zhì)除去。采用正己烷重復(fù)萃取3次，將花椒中的香味物質(zhì)全部除去，以便獲得高純度的麻味物質(zhì)（山椒素），隨后進(jìn)行層析、過濾、蒸干得到粗提取物。最終采用甲醇將山椒素溶解，為山椒素提供極性環(huán)境，加入鐵粉作為催化劑并經(jīng)紫外光照射后獲得純度大于98%的羥基-γ-山椒素，雜質(zhì)與其他同分異構(gòu)體及其他酰胺類物質(zhì)的含量不足2%。這樣純度的羥基-γ-山椒素可用于所有的生理生化實驗以及麻味評價實驗，整個制備方法用時為9~11個小時。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點：

1、由于本發(fā)明提供的一種快速制備高純度羥基-γ-山椒素的方法采用了恒溫振蕩提取、正己烷萃取以及紫外照射處理三個關(guān)鍵步驟，使得制備方法相比于傳統(tǒng)的柱層析法更加簡單、耗時更短，傳統(tǒng)的提取分離純化方法一般耗時24~48小時，且操作復(fù)雜，經(jīng)驗性較強，重復(fù)性較差，本發(fā)明提供的方法全過程只需要9~11個小時，且操作簡單，一般的技術(shù)人員均可熟練掌握。相比專利cn201210175527.9步驟（1）中提及的層析柱除去多酚，需要在-20℃以下避光冷凍12～18小時，操作時間明顯長于本發(fā)明全程時間7~9h。另外步驟（2）中提及的薄層層析法是用體積比1:9的甲醇和氯仿混合液作為展開劑，將上述洗脫液在薄層板上進(jìn)行點樣，展開，并置于254nm的紫外燈下，將出現(xiàn)明顯紫色斑點的第二組分確定為目標(biāo)物所在組分，其中明顯紫色斑點僅為定性而非定量，完全依靠操作人員的經(jīng)驗進(jìn)行判定，所以對技術(shù)的掌握要求跟高，而本發(fā)明中并不要求操作性和豐富的經(jīng)驗。

2、由于本發(fā)明提供的一種快速制備高純度羥基-γ-山椒素的方法采用了合適的紫外照射處理，并添加鐵粉作為催化劑，利用了光反應(yīng)和化學(xué)反應(yīng)使得羥基-γ-山椒素的同分異構(gòu)體羥基-γ-異山椒素向其發(fā)生轉(zhuǎn)化，進(jìn)而提高了羥基-γ-山椒素的純度，使得目標(biāo)物質(zhì)的純度達(dá)到98%以上。而專利cn201210175527.9中并未添加任何催化劑，最終制得的羥基-γ-山椒素相對含量僅為81.55%，羥基-γ-異山椒素相對含量為3.43%，且后者無法發(fā)生轉(zhuǎn)化，濃度得不到提高。而本發(fā)明中最終制得的羥基-γ-山椒素相對含量最低為98.91%，最高為99.18%。

3、由于本發(fā)明提供的一種快速制備高純度羥基-γ-山椒素的方法不需要特殊的儀器設(shè)備，如制備型或半制備型高效液相色譜儀，且操作簡單，耗時短，成本低，因此可以為一般的實驗室和一般操作水平的人員用來制備高純度的羥基-γ-山椒素以進(jìn)行其所需實驗，極大的提高了工作效率。

附圖說明

圖1實施例1制備的物質(zhì)hplc圖譜；

圖2實施例2制備的物質(zhì)hplc圖譜；

圖3實施例3制備的物質(zhì)hplc圖譜。

具體實施方式

下面通過實施例對本發(fā)明進(jìn)行具體的描述，有必要在此指出的是以下實施例只用于對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說明，不能理解為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。該領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員可以根據(jù)上述本發(fā)明的內(nèi)容，對本發(fā)明做出一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整。

實施例1

（1）取30ml紅花椒油，按體積比1:20加入甲醇，使用恒溫振蕩器40℃振蕩1h，轉(zhuǎn)速160rpm，再超聲5min，將浸提液移入離心管中4000r/min離心15min后取上清液；

（2）將上清液用正己烷進(jìn)行萃取，料液比1：2，萃取3次，將萃取的下層清液過堿性三氧化二鋁柱，所得層析液過0.22μm有機(jī)系濾膜，最后將濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀45℃（真空度0.09mpa）減壓蒸干2h，得粗提物；

（3）取10mg粗提物溶于20ml色譜級甲醇中，加入10mg的鐵粉，放入血清瓶中，將其進(jìn)行紫外照射處理，紫外照射條件為紫外燈功率20w，紫外線波長為254nm，物品距離紫外燈20cm，照射時間為4小時，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀45℃（真空度0.09mpa）減壓蒸干，蒸干時間1h即可獲得羥基-γ-山椒素。

實施例2

（1）取30ml紅花椒油，按體積比1:20加入甲醇，使用恒溫振蕩器40℃振蕩1h，轉(zhuǎn)速160rpm，再超聲5min，將浸提液移入離心管中4000r/min離心15min后取上清液；

（2）將上清液用正己烷進(jìn)行萃取，料液比1：2，萃取3次，將萃取的下層清液過堿性三氧化二鋁柱，所得層析液過0.22μm有機(jī)系濾膜，最后將濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀45℃（真空度0.09mpa）減壓蒸干2h，得粗提物；

（3）取10mg粗提物溶于20ml色譜級甲醇中，加入20mg的鐵粉，放入血清瓶中，將其進(jìn)行紫外照射處理，紫外照射條件為紫外燈功率20w，紫外線波長為254nm，物品距離紫外燈20cm，照射時間為6小時，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀45℃（真空度0.09mpa）減壓蒸干，蒸干時間1h即可獲得羥基-γ-山椒素。

實施例3

（1）取30ml紅花椒油，按體積比1:20加入甲醇，使用恒溫振蕩器40℃振蕩1h，轉(zhuǎn)速160rpm，再超聲5min，將浸提液移入離心管中4000r/min離心15min后取上清液；

（2）將上清液用正己烷進(jìn)行萃取，料液比1：2，萃取3次，將萃取的下層清液過堿性三氧化二鋁柱，所得層析液過0.22μm有機(jī)系濾膜，最后將濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀45℃（真空度0.09mpa）減壓蒸干2h，得粗提物；

（3）取10mg粗提物溶于20ml色譜級甲醇中，加入15mg的鐵粉，放入血清瓶中，將其進(jìn)行紫外照射處理，紫外照射條件為紫外燈功率20w，紫外線波長為254nm，物品距離紫外燈20cm，照射時間為5小時，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀45℃（真空度0.09mpa）減壓蒸干，蒸干時間1h即可獲得羥基-γ-山椒素。

測試?yán)?

（1）取30ml紅花椒油，按體積比1:20加入甲醇，使用恒溫振蕩器40℃振蕩1h，轉(zhuǎn)速160rpm，再超聲5min，將浸提液移入離心管中4000r/min離心15min后取上清液；

（2）將上清液用正己烷進(jìn)行萃取，料液比1：2，萃取3次，將萃取的下層清液過堿性三氧化二鋁柱，所得層析液過0.22μm有機(jī)系濾膜，最后將濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀45℃（真空度0.09mpa）減壓蒸干2h，得粗提物；

（3）取10mg粗提物溶于20ml色譜級甲醇中，加入20mg的鐵粉，放入血清瓶中，待反應(yīng)結(jié)束后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀45℃（真空度0.09mpa）減壓蒸干，蒸干時間1h即可獲得羥基-γ-山椒素。

測試?yán)?

將上述制備得到的物質(zhì)進(jìn)行光譜檢測，采用高效液相色譜法（hplc）進(jìn)行檢測，檢測條件為色譜柱：mnnucleodur1100-5c18柱(?4×125mm,5μm)；流動相：a水；b乙腈；流速：0.5ml/min；柱溫：25℃；紫外檢測波長：270nm；進(jìn)樣量：20μl。洗脫程序如表1所示。

表1hplc洗脫程序

根據(jù)hplc分析結(jié)果，如圖1所示，實施例1制備得到的物質(zhì)中羥基-γ-山椒素的純度為99.18%。如圖2所示，實施例2制備得到的物質(zhì)中羥基-γ-山椒素的純度為98.96%。如圖3所示，實施例3制備得到的物質(zhì)中羥基-γ-山椒素的純度為98.91%。測試?yán)?制備得到的物質(zhì)中羥基-γ-山椒素為79%，羥基-γ-異山椒素為12%。