本發(fā)明涉及生物技術(shù)和植物生物學領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及一種互花米草甘油醛-3-磷酸脫氫酶sagapdh及其編碼基因與應用。

背景技術(shù)：

甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,gapdhs)是生物體內(nèi)高度保守的蛋白質(zhì)。作為糖酵解途徑的關(guān)鍵酶之一，gapdhs在細胞的碳代謝中起著核心作用，是維持生命活動能量形成的最基本酶之一。目前發(fā)現(xiàn)，gapdhs的功能具有多樣性，參與細胞內(nèi)膜分揀、受體介導的信號轉(zhuǎn)導、細胞凋亡等事件，在許多細胞路徑中起關(guān)鍵作用。高等植物gapdh是糖酵解、糖異生和卡爾文循環(huán)過程中的關(guān)鍵酶，同樣是多功能酶，并在干旱、鹽害等非生物脅迫中起著重要的作用。

互花米草(spartinaalterniflora)是多年生草本植物，屬于禾本科米草屬。由于其秸稈密集粗壯、地下根莖發(fā)達，具有保灘護堤、促淤造陸等生態(tài)功能。另一方面，互花米草還具有較高的鹽適應性，還是研究和發(fā)掘耐鹽基因及其作用機制的優(yōu)良材料。因此，開發(fā)和利用互花米草耐鹽基因具有重要的意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種互花米草甘油醛-3-磷酸脫氫酶sagapdh，其氨基酸序列如seqidno.1所示。

本發(fā)明的另一目的是提供編碼該甘油醛-3-磷酸脫氫酶sagapdh編碼基因的核苷酸序列，其核苷酸序列如seqidno.2所示。

本發(fā)明的又一目的是提供甘油醛-3-磷酸脫氫酶sagapdh的功能。

本發(fā)明所提供的甘油醛-3-磷酸脫氫酶sagapdh來源于互花米草(spartinaalterniflora)，氨基酸序列如seqidno.1所示。

本發(fā)明所述的互花米草甘油醛-3-磷酸脫氫酶sagapdh的編碼基因，其核苷酸序列如seqidno.2所示，含有1014bp的最大開放閱讀框，編碼seqidno.1所示的337個氨基酸殘基序列。

含有本發(fā)明如sagapdh基因seqidno.2的原核表達載體。

將互花米草甘油醛-3-磷酸脫氫酶sagapdh插入e.coli表達載體pet-28a(+)，獲得重組表達載體pet28a-sagapdh。將獲得的重組表達載體，轉(zhuǎn)化e.coli表達系統(tǒng)，如e.colibl21(de3)表達載體，獲得可表達互花米草甘油醛-3-磷酸脫氫酶sagapdh的e.coli重組表達菌株。

有益效果：

本發(fā)明在互花米草中克隆得到一種甘油醛-3-磷酸脫氫酶sagapdh的編碼基因，sagapdh基因受鹽脅迫的誘導表達。表達互花米草甘油醛-3-磷酸脫氫酶sagapdh的e.coli重組表達菌株與對照菌株相比，提高了耐鹽性。

本發(fā)明的sagapdh對于獲得耐鹽性植物提供基因材料及理論基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1是sagapdh基因在互花米草在鹽脅迫處理下的誘導表達特性。

圖2是本發(fā)明蛋白質(zhì)sagapdh在e.colibl21(de3)重組表達菌株中表達后的聚丙烯酰胺凝膠電泳(sds-page)圖譜。其中：1，含有空載體pet28a(+)的e.colibl21(de3)誘導6h；2，含有重組表達載體pet28a-sagapdh的e.colibl21(de3)誘導6h；3，蛋白marker；4，純化的sagapdh蛋白。

圖3是溫度對甘油醛-3-磷酸脫氫酶sagapdh酶活力影響曲線。

圖4是ph值對甘油醛-3-磷酸脫氫酶sagapdh酶活力影響曲線。

圖5是表達sagapdh蛋白重組菌株與對照菌株耐鹽性比較。

具體實施方式

以下結(jié)合具體實施例并附圖，進一步闡述本發(fā)明。

以下實施例進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。

若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。

實施例1、互花米草甘油醛-3-磷酸脫氫酶sagapdh編碼基因的克隆

合成兩條引物分別具有序列表中seqidno.3和seqidno.4的核苷酸序列。

以從互花米草中提取的rna反轉(zhuǎn)錄獲得的cdna為模板，利用具有序列表中seqidno.3和seqidno.4的核苷酸引物序列，pcr擴增sagapdh基因編碼區(qū)片段。

在紫外燈照射下，切下目標sagapdh基因dna條帶。然后采用多功能dna純化試劑盒(離心柱型)從瓊脂糖凝膠中回收dna片段。將回收的dna片段連接到pmd19-t載體上，轉(zhuǎn)化e.colidh5α感受態(tài)細胞，經(jīng)氨芐抗性篩選后挑取單克隆子進行菌落pcr驗證。陽性克隆子經(jīng)測序后，利用blast軟件進行比對分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)插入的片段與無芒隱子草(cleistogenessongorica)甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因一致性達到94％。

sagapdh編碼基因具有序列表中seqidno.2的核苷酸序列。自seqidno.2的5’-端第1-1014位核苷酸為sagapdh的開放閱讀框(openreadingframe,orf)，自seqidno.2的5’-端的第1-3位核苷酸為sagapdh編碼基因的起始密碼子atg，自seqidno.2的5’-端的第1012-1014位核苷酸為sagapdh編碼基因的終止密碼子tag?；セ撞莞视腿?3-磷酸脫氫酶sagapdh基因編碼一個含有337個氨基酸的蛋白質(zhì)，具有seqidno.1的氨基酸序列，用軟件預測到該蛋白質(zhì)的理論分子量大小為36.4kda，等電點pi為8.55。

實施例2、互花米草甘油醛-3-磷酸脫氫酶sagapdh基因在鹽脅迫(氯化鈉)下的表達特性

以長勢一致(4-5葉片)的互花米草盆栽幼苗為材料，進行不同濃度(0、100、200、400和800mm)的氯化鈉處理；在處理后的不同時間點(0、1、2和3d)分別選取互花米草相同部位的葉片，提取樣品的rna并反轉(zhuǎn)錄合成cdna。利用實時熒光定量pcr的技術(shù)對sagapdh基因在氯化鈉脅迫下的表達進行研究。實時熒光定量pcr引物的分別具有序列表中seqidno.5和seqidno.6所示的核苷酸序列。

結(jié)果分析表明：sagapdh基因顯著的受氯化鈉脅迫的誘導表達。其中，200mm氯化鈉在處理時間2d時，sagapdh基因的表達量達到最高。

實施例3、互花米草甘油醛-3-磷酸脫氫酶sagapdh基因在e.coli中的異源表達

一、攜帶sagapdh基因e.coli表達系統(tǒng)重組載體的構(gòu)建

以互花米草cdna為模板，根據(jù)序列seqidno.2設(shè)計引物，pcr擴增互花米草sagapdh基因編碼區(qū)的dna序列。引物兩端分別引入ndei和xhoi酶切位點和保護堿基；引物序列如seqidno.7和seqidno.8所示。

對pcr產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，切下目的條帶純化回收，將回收的dna片段連接到pmd19-t載體上，轉(zhuǎn)化e.colidh5α感受態(tài)細胞，經(jīng)氨芐抗性篩選，挑取克隆子進行菌落pcr驗證后提取質(zhì)粒測序，得到含有ndei和xhoi酶切位點及編碼sagapdh基因的質(zhì)粒pmd19t-sagapdh。

將質(zhì)粒pmd19t-sagapdh和空載體質(zhì)粒pet28a(+)分別在30℃條件下用ndei和xhoi雙酶切12h后，酶切產(chǎn)物分別進行1％瓊脂糖凝膠電泳分析，回收，用t4dna連接酶4℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化e.colidh5α感受態(tài)細胞，挑取卡那霉素抗性的單克隆，提取質(zhì)粒，以seqidno.7和seqidno.8引物進行pcr鑒定，并將pcr鑒定正確的陽性克隆子進行測序鑒定。將測序正確的含有seqidno.1序列并與6×組氨酸(his)融合的重組載體命名為pet28a-sagapdh。

二、重組表達載體pet28a-sagapdh轉(zhuǎn)化宿主、陽性克隆鑒定

將步驟一中構(gòu)建的重組表達載體pet28a-sagapdh轉(zhuǎn)化e.colibl21(de3)感受態(tài)細胞，同時將pet28a空載體e.colibl21(de3)，作為對照菌。挑取卡那霉素抗性的單克隆，以seqidno.7和seqidno.8引物進行pcr檢測。將菌落pcr驗證陽性的克隆子，用于蛋白的誘導表達。

三、sagapdh基因的原核表達和純化

將步驟二中鑒定正確的克隆培養(yǎng)過夜，再將細菌100倍稀釋于含有卡那霉素(50mg/l)的lb液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待菌液生長至od600為0.6-0.8時，加入iptg(終濃度為0.1mm)進行誘導培養(yǎng)，16℃誘導12h，同時將含有pet28a(+)空載體e.colibl21(de3)作為對照菌。取誘導過的菌液1ml，離心收集菌體(4000rpm，10min)，菌體蛋白進行鎳柱純化，并經(jīng)12％sds-page電泳檢測。結(jié)果表明，在iptg誘導下，含有重組表達載體pet28a-sagapdh的e.colibl21(de3)中成功表達了sagapdh蛋白，且重組表達的sagapdh蛋白表觀分子量與理論分子量相近(圖2)。

實施例4、溫度對互花米草甘油醛-3-磷酸脫氫酶sagapdh酶活力的影響。

酶最適溫度測試時的條件為：溫度范圍為15～50℃、底物為1.2μmd-甘油醛3-磷酸、4mm氧化型輔酶i(nad⁺)、10mmna3aso4、3mm二硫蘇糖醇、50mmtris-hcl緩沖液(ph8.5)。在不同溫度下測定的最高酶活力設(shè)置為100％。

如圖3所示，互花米草甘油醛-3-磷酸脫氫酶sagapdh最適反應溫度為37℃。當反應低于37℃時，隨著溫度的逐漸升高，sagapdh的酶活力逐漸增加。在最適反應溫度(37℃)條件下，sagapdh的酶活力是15℃條件下的2.3倍。隨著反應溫度的升高，sagapdh的酶活力則有所降低。

實施例5、ph值對互花米草甘油醛-3-磷酸脫氫酶sagapdh酶活力的影響。

酶的最適ph是在不同ph條件下進行分析的，如ph6.0～9.0(tris-hcl緩沖液，50mm)。在不同ph下測定的最高酶活力設(shè)置為100％。在不同ph緩沖液處理條件下，sagapdh的最適ph為8.5。當ph在6.5～8.5之間時，隨著ph的增加，sagapdh的相對酶活力逐漸增大。而ph在6.0～6.5之間時隨著ph的增加，sagapdh的相對酶活力逐漸減小(圖4)。

實施例6、表達互花米草甘油醛-3-磷酸脫氫酶sagapdh重組大腸桿菌耐鹽性分析。

根據(jù)實施案例2中構(gòu)建的空載體pet28a(+)和重組表達載體pet28a-sagapdh表達菌株，用0.1mmiptg誘導培養(yǎng)至od600＝0.5，并設(shè)置不受iptg誘導的對照。隨后將培養(yǎng)的菌體進行梯度稀釋(分別設(shè)置稀釋梯度為0、1:10,1:100,1:1000,and1:10000)，并點播5μl在含有對照(171mmnacl)及800mmnacl和800mmkcl的lb固體培養(yǎng)上。隨后，將平板放置于37℃繼續(xù)生長至菌斑出現(xiàn)(12-16h)，結(jié)果如圖5所示。

圖5表明，重組表達載體pet28a-sagapdh表達菌株相較于空載體pet28a(+)表達菌株具有較高的鹽脅迫耐受性。

序列表

<110>江蘇省中國科學院植物研究所

<120>一種互花米草甘油醛-3-磷酸脫氫酶sagapdh及其編碼基因與應用

<160>8

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>337

<212>prt

<213>互花米草（spartinaalterniflora）

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<213>互花米草（spartinaalterniflora）

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