本發(fā)明涉及生物制藥生產技術領域，具體而言，涉及一種細胞培養(yǎng)病毒液分離純化方法。

背景技術：

隨著獸用生物疫苗行業(yè)的不斷發(fā)展，尤其生物反應器細胞高密度懸浮培養(yǎng)技術的應用，人們對疫苗的安全性和副作用的認識逐步加深，分離純化在疫苗制備和生產中的地位日益凸顯，離心和沉淀作為傳統(tǒng)的分離大顆粒物方法已在各類疫苗中得到廣泛的應用。目前傳統(tǒng)的方法主要是離心法，但由于高密度培養(yǎng)的細胞碎片等雜質較多，離心效果也不是很好，并且購買連續(xù)離心機的花費也比較高昂，若加上一般的自然沉降也最多只能抽出50％～60％的上清，若用化學法進行沉降，后期去除化學劑又成為難題。由于前端的分離過程效果不好，目前整個的分離純化的過程比較繁瑣，花費時間較長，病毒損耗較大等問題。

有鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術實現要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種細胞培養(yǎng)病毒液分離純化方法，以解決上述問題。

為了實現本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術方案：

一種細胞培養(yǎng)病毒液分離純化方法，包括：

將細胞培養(yǎng)病毒液低溫靜置使雜質充分沉淀后用無菌處理的氣體給生物反應器加壓，利用提上清裝置進行提上清操作得到病毒液上清；將所述病毒液上清離心后進行濃縮；

所述提上清裝置包括導流收液桶，所述導流收液桶的側壁上設置有進液口，所述導流收液桶的頂端與出液管相連；

所述進液口上方和下方的桶身上分別設置有上擋板和下?lián)醢澹宜錾蠐醢搴拖聯(lián)醢宓膬葟骄笥谒鰧Я魇找和暗膬葟健?/p>

該方法對病毒液在離心前用物理的方法進行處理，可處理掉90％左右的可見大顆粒，可大大降低后期離心的難度和時間，大大提高純化效率，減少純化設備及步驟，縮短純化時間。

優(yōu)選的，如上所述的細胞培養(yǎng)病毒液分離純化方法，所述細胞培養(yǎng)病毒液的滅活在所述提上清操作之后進行。

病毒液滅活后由于滅活劑的作用，會使得細胞碎片等顆粒物變得更小，雜質難以屏蔽，不利于提清裝置的處理。

優(yōu)選的，如上所述的細胞培養(yǎng)病毒液分離純化方法，所述低溫靜置的溫度為2～8℃，靜置時間為20～28小時；

更優(yōu)選的，所述低溫靜置的溫度為4～6℃，靜置時間為22～26小時。

2～8℃的溫度一方面利于保持病毒的生物活性，另一方面由于低溫下，雜質顆粒的布朗運動水平越低，也利于保證更好的沉降效果。

優(yōu)選的，如上所述的細胞培養(yǎng)病毒液分離純化方法，所述濃縮的方法為膜包法。

優(yōu)選的，如上所述的細胞培養(yǎng)病毒液分離純化方法，所述上擋板設置在所述導流收液桶的頂部，所述下?lián)醢逶O置在所述導流收液桶的底部；

更優(yōu)選的，所述進液口與所述下?lián)醢逑嗲小?/p>

優(yōu)選的，如上所述的細胞培養(yǎng)病毒液分離純化方法，所述下?lián)醢宄时P口朝下的圓盤形，所述上擋板為圓錐形擋板；

優(yōu)選的，所述圓錐形擋板軸截面頂角為120°～140°；

優(yōu)選的，所述上擋板的內徑是所述導流收液桶內徑的2～3倍，更優(yōu)選為2.5倍；

優(yōu)選的，所述下?lián)醢宓膬葟绞撬鰧Я魇找和皟葟降?.3～2倍，更優(yōu)選為1.6倍。

下?lián)醢宓闹饕饔檬亲钃跸虏克槠细?；上擋板的主要作用是阻擋少量上浮的碎片或顆粒物再次下落。所述進液口位于上擋板與下?lián)醢逯g，可保證收集的上清液中雜質更少。

其中，所述圓錐形擋板的開口向下。

圓錐形擋板可在阻擋少量上浮的碎片或顆粒物再次下落的同時，使得下落的雜質物質呈輻射狀地遠離導流收液桶的進液口。

下?lián)醢宓男螤羁梢栽O置為一個倒扣的平盤狀結構，且平面與邊緣處為弧形倒角，可使得上浮的雜質被困在下?lián)醢逑旅妫钄嘈Ч选?/p>

優(yōu)選的，如上所述的細胞培養(yǎng)病毒液分離純化方法，所述無菌處理的氣體為空氣，所述空氣的注入速度小于等于0.5l/s；

更優(yōu)選的，所述空氣的注入速度為0.1l/s～0.5l/s；還可以選擇0.2l/s～0.4l/s、0.3l/s等。

空氣的注入速度決定這生物反應器中液體流動的快慢，若注入速度太快，會引起反應器中的雜質攪動劇烈，則提清效果也會受到影響；若注入速度太慢，顯然會延長提清時間。

空氣的注入速度與提清裝置的結構有關，本發(fā)明優(yōu)選的提取裝置根據流體力學進行優(yōu)化，使得即便再較快的提清速率下依然能保持良好的提清效果。

優(yōu)選的，如上所述的細胞培養(yǎng)病毒液分離純化方法，所述進液口為1～7個；更優(yōu)選的，所述進液口為2～6個，也可以選擇3、4、5個，最優(yōu)選的，所述進液口為4個；

優(yōu)選的，所述進液口的形狀可以為圓形、橢圓形、矩形或上述形狀的一部分如半圓形；

優(yōu)選的，為保證吸收上清液的效率，所述進液口呈輻射狀的等距設置于所述導流收液桶的桶壁上。

優(yōu)選的，所述進液口的總表面積≥16cm²。

最優(yōu)選的，若生物反應器為1500～2500l容積，則顯得所述進液口為4個，且每個進液口的開口為4cm²。

優(yōu)選的，所述導流收液桶的桶身形狀為圓柱體；

更優(yōu)選的，所述導流收液桶的直徑和桶高的比值為(100～115):150。

優(yōu)選的，如上所述的細胞培養(yǎng)病毒液分離純化方法，所述出液管為l形管；

更優(yōu)選的，所述出液管的端部設置有閥門接口；所述閥門接口與l形管的拐角之間設置有罐體連接卡箍。

優(yōu)選的，如上所述的細胞培養(yǎng)病毒液分離純化方法，所述提上清裝置位于所述生物反應器的罐體的下1/8～1/2處，且所述導流收液桶設置于所述生物反應器的橫截面中心位置。

導流收液桶的位置應該在生物反應器的靠下部位，但也不要低于靜置時沉淀的密集處。

與現有技術相比，本發(fā)明的有益效果為：

使用本發(fā)明提供的細胞培養(yǎng)病毒液分離純化方法，病毒培養(yǎng)液在離心前用物理的方法進行處理，可處理掉90％左右的可見大顆粒，可大大降低后期離心的難度和時間，大大提高純化效率，減少純化設備及步驟，縮短純化時間。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明具體實施方式或現有技術中的技術方案，下面將對具體實施方式或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實施方式，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為本發(fā)明提供的提上清裝置的結構示意圖；

圖2為包含本發(fā)明提供的提上清裝置的生物反應器的示意圖。

附圖標記：

1-導流收液桶；

2-進液口；

3-出液管；

4-上擋板；

5-下?lián)醢澹?/p>

6-閥門接口；

7-罐體連接卡箍；

8-生物反應器；

9-提上清裝置。

具體實施方式

下面將結合附圖和具體實施方式對本發(fā)明的技術方案進行清楚、完整地描述，但是本領域技術人員將會理解，下列所描述的實施例是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例，僅用于說明本發(fā)明，而不應視為限制本發(fā)明的范圍?；诒景l(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產品。

在本發(fā)明的描述中，需要說明的是，術語“中心”、“上”、“下”、“左”、“右”、“豎直”、“水平”、“內”、“外”等指示的方位或位置關系為基于附圖所示的方位或位置關系，僅是為了便于描述本發(fā)明和簡化描述，而不是指示或暗示所指的裝置或元件必須具有特定的方位、以特定的方位構造和操作，因此不能理解為對本發(fā)明的限制。此外，術語“第一”、“第二”、“第三”僅用于描述目的，而不能理解為指示或暗示相對重要性。

在本發(fā)明的描述中，需要說明的是，除非另有明確的規(guī)定和限定，術語“安裝”、“相連”、“連接”應做廣義理解，例如，可以是固定連接，也可以是可拆卸連接，或一體地連接；可以是機械連接，也可以是電連接；可以是直接相連，也可以通過中間媒介間接相連，可以是兩個元件內部的連通。對于本領域的普通技術人員而言，可以具體情況理解上述術語在本發(fā)明中的具體含義。

一種細胞培養(yǎng)病毒液分離純化方法，包括：

將細胞培養(yǎng)病毒液低溫靜置使雜質充分沉淀后用無菌處理的氣體給生物反應器加壓，利用提上清裝置進行提上清操作得到病毒液上清，對所述病毒液上清中的病毒進行滅活，離心后利用膜包法進行濃縮；

所述低溫靜置的溫度為4℃，靜置時間為24小時。

如圖2所示，該提上清裝置9可設置于生物反應器8中，用于病毒培養(yǎng)液在離心前用物理的方法進行處理。所述生物反應器8的容積為1500～2500l，所在給生物反應器加壓時使用無菌處理的空氣，空氣注入速度為0.1～0.5l/s，提上清裝置9位于所述生物反應器8的罐體的下1/8～1/2處，且所述導流收液桶設置于所述生物反應器的橫截面中心位置。收集得到病毒液上清會在壓力的作用下流入進液口2，經由導流收液桶1流向出液管3。

該提上清裝置結構如圖1所示，包括導流收液桶1、進液口2、出液管3、上擋板4、下?lián)醢?。

所述裝置的主體為導流收液桶1，所述導流收液桶1的側壁上設置有進液口2，所述導流收液桶1的頂端與出液管3相連；

所述進液口2上端和下端的桶身上分別設置有上擋板4和下?lián)醢?，且所述上擋板4和下?lián)醢?的內徑均大于所述導流收液桶1的內徑。

下?lián)醢?的主要作用是阻擋下部碎片上?。簧蠐醢?的主要作用是阻擋少量上浮的碎片或顆粒物再次下落。所述進液口2位于上擋板4與下?lián)醢?之間，可保證收集的上清液中雜質更少。

優(yōu)選的，所述提上清裝置的材質可選擇防腐蝕的材料，例如不銹鋼，氧化鋁、鈦合金等。

優(yōu)選的，所述上擋板4和下?lián)醢?與所述導流收液桶1的連接方式為焊接。

為保證阻擋雜質的效果好，優(yōu)選的，所述上擋板4設置在所述導流收液桶1的頂部；

優(yōu)選的，所述下?lián)醢?設置在所述導流收液桶1的底部；

進液口2也可以設置在所述導流收液桶1的底部，優(yōu)選的，所述進液口2與所述下?lián)醢?相切。

優(yōu)選的，如上所述的提上清裝置，所述上擋板4為圓錐形擋板；更優(yōu)選的，所述圓錐形擋板軸截面的頂角為120°～140°；最優(yōu)選為130°。

圓錐形擋板可在阻擋少量上浮的碎片或顆粒物再次下落的同時，使得下落的雜質物質呈輻射狀地遠離導流收液桶1的進液口2。

優(yōu)選的，如上所述的提上清裝置，所述下?lián)醢?為平面擋板，且邊緣處向下方延伸；更優(yōu)選的，邊緣處沿弧形倒角向下方延伸。

下?lián)醢?的形狀可以設置為一個倒扣的平盤狀結構，弧形倒角可使得上浮的雜質被困在下?lián)醢?下面，阻斷效果更佳。

優(yōu)選的，如上所述的提上清裝置，所述進液口2為1～7個。

更優(yōu)選的，所述進液口2為2～6個，也可以選擇3、4、5個，最優(yōu)選的，所述進液口2為4個。

優(yōu)選的，所述進液口2的形狀可以為圓形、橢圓形、矩形或上述形狀的一部分如半圓形。

優(yōu)選的，為保證吸收上清液的效率，所述進液口2呈輻射狀的等距設置于所述導流收液桶的桶壁上。

優(yōu)選的，如上所述的提上清裝置，導流收液桶1的桶身形狀為圓柱體。

優(yōu)選的，如上所述的提上清裝置，所述出液管3為l形管，且所述出液管3的端部設置有閥門接口6；

所述閥門接口與l形管的拐角之間設置有罐體連接卡箍7。

為進一步說明發(fā)明的技術效果，將給出一個實際應用的案例，細胞培養(yǎng)病毒液分離純化方法同上面所述，具體在該案例中，生物反應器的容積為2000l，生物反應器罐體的高為0.8米為圓柱體。提上清裝置的導流收液桶位于距離罐底10cm處的中心位置。下進液口有4個，每個進液口的開口大小為4cm²。導流收液桶為直徑10cm高15cm的圓柱體，上擋板為頂角130°的圓錐形，下?lián)醢宄时P口朝下的圓盤形，上擋板的直徑為25cm，下?lián)醢逯睆?6cm。在注入無菌空氣時，空氣的流速為120ml/s～130ml/s。實驗組和對照組使用的生物反應器相同，所處理的樣品也培養(yǎng)狀況也相同，區(qū)別在于：

未用提清裝置的純化濃縮工藝：離心去碎片→中空纖維柱澄清→膜包濃縮；

使用提清裝置的純化濃縮工藝：靜置提清→離心去碎片→膜包濃縮。

結果如表1所示。

表1

通常目前各個廠家的離心機采用進口連續(xù)流離心機，生產用離心機基本都在幾百萬元人名幣，而本發(fā)明提供的病毒液分離純化方法由于前端處理比較好，所以用國產管式離心機就可以滿足生產要求，國產離心機僅十幾萬人民幣，可以大幅度降低分離純化的成本。

經離心處理后的病毒液濁度較低，可直接進入膜包進行濃縮處理。而目前大多廠家經離心處理后的病毒液濁度仍然較高，需要再用中空纖維設備繼續(xù)進行澄清，然后再進入膜包進行濃縮處理。

最后應說明的是：以上各實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案，而非對其限制；盡管參照前述各實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，但本領域的普通技術人員應當理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分或者全部技術特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應技術方案的本質脫離本發(fā)明各實施例技術方案的范圍。