本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種t淋巴細胞、一種慢病毒、一種轉(zhuǎn)基因淋巴細胞、一種構(gòu)建體、一種用于治療癌癥的治療組合物和一種提高淋巴細胞活性的方法。

背景技術(shù)：

腦膠質(zhì)母細胞瘤是惡性度最高的腦瘤，占中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤的～81％，惡性膠質(zhì)瘤的發(fā)病率為3-6/10萬,每年中國因此病死亡人數(shù)為3萬人。惡性膠質(zhì)瘤呈浸潤性生長，與正常腦組織無明顯界限，并且多數(shù)不限于一個腦葉，呈指狀深入破壞腦組織，手術(shù)不可能完全切除。雖然母前采用了最為積極的治療手段，但中位生存期仍只有<15個月，單獨使用放療，僅有不足1％的患者可以存活5年，即使新出現(xiàn)的放療與替莫唑胺(tmz)化療的聯(lián)用方案，也只使近10％患者存活至5年以上。

由此可見，開發(fā)有效治療腦膠質(zhì)母細胞瘤的方法尤為迫切.

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本申請是基于發(fā)明人對以下事實和問題的發(fā)現(xiàn)和認識作出的：

egfr突變體egfrviii(egfr胞外段的267個氨基酸被去除，其是由egfr基因的第2～7個外顯子(275～1075位核苷酸)去除后的基因編碼的)在約30％的膠質(zhì)母細胞瘤患者中表達，但在正常組織中未檢測到，因此，egfrviii可代表膠質(zhì)母細胞瘤的特異性突變。

基于上述發(fā)現(xiàn)，發(fā)明人提出了一種攜帶沉默細胞免疫檢查點的核酸分子和編碼嵌合抗原受體的核酸分子的構(gòu)建體和一種以此構(gòu)建體導(dǎo)入后形成的轉(zhuǎn)基因淋巴細胞，其編碼的嵌合抗原受體特異性結(jié)合抗原egfrviii。因此，本發(fā)明提出的構(gòu)建體和轉(zhuǎn)基因淋巴細胞可用于腫瘤，尤其是膠質(zhì)母細胞瘤的過繼t細胞的免疫治療，本發(fā)明提出的轉(zhuǎn)基因淋巴細胞對egfrviii突變的腦膠質(zhì)母細胞瘤細胞具有強的特異殺傷能力。

在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了一種t淋巴細胞。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述t淋巴細胞的細胞免疫檢查點被沉默；以及表達嵌合抗原受體，其中，所述嵌合抗原受體包括：胞外區(qū)，所述胞外區(qū)包括單鏈抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，所述單鏈抗體特異性識別抗原egfrviii；跨膜區(qū)，所述跨膜區(qū)與所述胞外區(qū)相連，并且嵌入到所述t淋巴細胞 的細胞膜中；胞內(nèi)區(qū)，所述胞內(nèi)區(qū)與所述跨膜區(qū)相連，并且所述胞內(nèi)區(qū)包括cd28或4-1bb的胞內(nèi)段以及cd3ζ鏈。其中，細胞免疫檢查點包括細胞表面或細胞內(nèi)至少之一的免疫檢查點。根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明實施例的t淋巴細胞具有抵抗腫瘤細胞介導(dǎo)的免疫抑制的特性，在體外的增殖能力、在腫瘤病人體內(nèi)的增殖和生存能力顯著提高，對腫瘤細胞的殺傷能力顯著增強，尤其對egfrviii突變的腦膠質(zhì)母細胞瘤具有顯著的定向殺傷作用。

在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提出了一種慢病毒。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述慢病毒攜帶下列核酸分子：編碼嵌合抗原受體的核酸分子，所述嵌合抗原受體具有seqidno：1所示的氨基酸序列，所述編碼嵌合抗原受體的核酸分子具有seqidno：2所示的核苷酸序列；以及沉默細胞免疫檢查點的核酸分子，所述沉默細胞免疫檢查點的核酸分子的核苷酸序列為選自seqidno：3～135的至少之一。

malpvtalllplalllhaarpgsdiqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqgirnnlawyqqkpgkapkrliyaasnlqsgvpsrftgsgsgteftlivsslqpedfatyyclqhhsypltsgggtkveikrtgstsgsgkpgsgegsevqvlesggglvqpggslrlscaasgftfssyamswvrqapgkglewvsaisgsggstnyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycagssgwseywgqgtlvtvssaaafvpvflpakptttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlycnhrnkrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(seqidno：1)。

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cuccucuggauccuugcagcagu(seqidno：25)。

uuugugugugaguaugcaucucc(seqidno：26)。

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根據(jù)本發(fā)明的實施例，將本發(fā)明實施例的慢病毒導(dǎo)入淋巴細胞所得的轉(zhuǎn)基因淋巴細胞，其具有抵抗腫瘤細胞介導(dǎo)的免疫抑制的特性，在體外的增殖能力、在腫瘤病人體內(nèi)的增殖和生存能力顯著增強，對腫瘤細胞的殺傷能力顯著增強，尤其對egfrviii突變的腦膠質(zhì)母細胞瘤具有顯著的定向殺傷作用。

在本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提出了一種慢病毒。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述慢病毒攜帶含有seqidno：136、137、138或139所示的核苷酸序列。

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tctagagctagcagatctatggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccgggatccgacatccagatgacccagagccctagcagcctgagcgccagcgtgggcgacagagtgaccatcacctgtcgggccagccagggcatcagaaacaacctggcctggtatcagcagaagcccggcaaggcccccaagagactgatctacgctgccagcaatctgcagagcggcgtgcccagcagattcaccggaagcggctccggcaccgagttcaccctgatcgtgtccagcctgcagcccgaggacttcgccacctactactgcctgcagcaccacagctaccctctgaccagcggcggaggcaccaaggtggagatcaagcggaccggcagcaccagcggcagcggcaagcctggcagcggcgagggaagcgaggtccaggtgctggaatctggcggcggactggtgcagcctggcggcagcctgagactgagctgtgccgccagcggcttcaccttcagcagctacgccatgtcttgggtccggcaggctcctggaaagggcctggaatgggtgtccgccatcagcggctctggcggctccaccaactacgccgacagcgtgaagggccggttcaccatcagccgggacaacagcaagaacaccctgtatctgcagatgaacagcctgagagccgaggacaccgccg tgtactactgtgccggcagcagcgggtggagcgagtactggggccagggcacactggtcacagtgtctagcgcggccgcattcgtgccggtcttcctgccagcgaagcccaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaccacaggaacaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgctaatcctactgcgtcgacttcgaactcgagcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattctggggggtggggtggggcaggacagcaagggggaggattgggaagacaatagcaggcatgctggggatgcggtgggctctatgggtcgaccaaggtcgggcaggaagagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattagaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacacctccccaggcgcagatcaaagagagttcaagagactctctttgatctgcgccttttttagctatcgatatcgatagctaaaaagcatcacttgggattaatatctcttgaatattaatcccaagtgatgcggggaagatctgtggtctcatacagaacttataagattcccaaatccaaagacatttcacgtttatggtgatttcccagaacacatagcgacatgcaaatattgcagggcgccactcccctgtccctcacagccatcttcctgccagggcgcacgcgcgctgggtgttcccgcctagtgacactgggcccgcgattccttggagcgggttgatgacgtcagcgttcgaattgtcgac(seqidno：139)。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，將本發(fā)明實施例的慢病毒導(dǎo)入淋巴細胞所得的轉(zhuǎn)基因淋巴細胞，其具有抵抗腫瘤細胞介導(dǎo)的免疫抑制的特性，在體外的增殖能力、在腫瘤病人體內(nèi)的 增殖和生存能力顯著增強，對腫瘤細胞的殺傷能力顯著增強，尤其對egfrviii突變的腦膠質(zhì)母細胞瘤具有顯著的定向殺傷作用。

在本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提出了一種轉(zhuǎn)基因淋巴細胞。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述淋巴細胞細胞免疫檢查點被沉默；以及表達嵌合抗原受體。發(fā)明人驚奇的發(fā)現(xiàn)，細胞免疫檢查點被沉默和表達嵌合抗原受體的淋巴細胞的體外增殖能力、在腫瘤病人體內(nèi)的增殖和生存能力以及在腫瘤病人體內(nèi)的對腫瘤細胞的特異性殺傷能力大大提高，尤其對egfrviii突變的腦膠質(zhì)母細胞瘤具有顯著的定向殺傷作用。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，上述轉(zhuǎn)基因淋巴細胞還可以具有下列附加技術(shù)特征至少之一：

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述嵌合抗原受體包括：胞外區(qū)，所述胞外區(qū)能夠與抗原特異性結(jié)合；跨膜區(qū)；以及胞內(nèi)區(qū)，所述胞內(nèi)區(qū)包括免疫共刺激分子胞內(nèi)段。具有上述結(jié)構(gòu)的嵌合抗原受體的存在，大大提高了本發(fā)明實施例的轉(zhuǎn)基因淋巴細胞的靶向定位，大大提高了本發(fā)明實施例的轉(zhuǎn)基因淋巴細胞對抗原表達腫瘤細胞的定向殺傷作用。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述抗原是腫瘤抗原。因此，本發(fā)明實施例的轉(zhuǎn)基因淋巴細胞對腫瘤的定向殺傷作用更加顯著。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述胞外區(qū)包括抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，所述抗體結(jié)合所述抗原?？乖贵w的特異性結(jié)合作用，大大提高了本發(fā)明實施例的轉(zhuǎn)基因淋巴細胞的靶向定位和對表達抗原的腫瘤細胞的定向殺傷作用。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述抗體為單鏈抗體。單鏈抗體可去除非特異性反應(yīng)的競爭性表面蛋白，同時單鏈抗體更易滲透腫瘤組織增加藥物治療濃度。本發(fā)明實施例的轉(zhuǎn)基因淋巴細胞表達單鏈抗體的嵌合抗原受體，大大提高了本發(fā)明實施例的轉(zhuǎn)基因淋巴細胞對靶向腫瘤細胞的定向殺傷作用。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述抗原為egfrviii。因此所述轉(zhuǎn)基因淋巴細胞針對表達抗原egfrviii的細胞具有定向性殺傷作用，抗原抗體的特異性結(jié)合作用更強，大大提高了本發(fā)明實施例的轉(zhuǎn)基因淋巴細胞對egfrviii抗原表達腫瘤細胞的定向殺傷作用。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述淋巴細胞細胞免疫檢查點獨立地選自ctla4、pd-1、tim-3、btla、lag-1irak-m、socs-1、a20、cbl-b的至少之一。其中，ctla4、pd-1、tim-3、btla、lag-1為細胞表面免疫檢查點，irak-m、socs-1、a20、cbl-b為細胞內(nèi)免疫檢查點。本發(fā)明實施例的免疫檢查點具有負向調(diào)控和減弱細胞免疫應(yīng)答的作用，其通過與腫瘤細胞上相應(yīng)的配體的特異結(jié)合，導(dǎo)致t淋巴細胞增生性反應(yīng)的下調(diào),細胞因子的分泌減少,和t細胞的無能或凋亡。根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明實施例的細胞表面或細胞內(nèi)免疫檢查點的成功沉默，進一步提高了轉(zhuǎn)基因淋巴細胞抵抗腫瘤介導(dǎo)的免疫抑制的功效，轉(zhuǎn)基因淋巴細胞在體外擴增及在腫瘤病人體內(nèi)的增殖和生存能力、對腫瘤細胞的定向殺傷作 用進一步加強。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述淋巴細胞細胞表面免疫檢查點被沉默是通過shrna、反義核酸、核酶、顯性負突變、crispr和鋅指核酸酶至少之一實現(xiàn)的。根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明實施例的細胞免疫檢查點的成功沉默，可顯著提高本發(fā)明實施例的淋巴細胞抵抗腫瘤介導(dǎo)的免疫抑制的特性，進一步提高了轉(zhuǎn)基因淋巴細胞增殖腫瘤細胞的定向殺傷作用。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述免疫共刺激分子胞內(nèi)段獨立地選自4-1bb、ox-40、cd40l、cd27、cd30、cd28以及他們的衍生物的至少一種。本發(fā)明實施例的免疫共刺激分子胞內(nèi)段的表達以及細胞免疫檢查點的沉默聯(lián)合具有正向調(diào)控和增強細胞免疫應(yīng)答的作用，使得本發(fā)明實施例的轉(zhuǎn)基因淋巴細胞增殖對腫瘤的定向殺傷作用效果更加顯著；本發(fā)明實施例的免疫共刺激分子胞內(nèi)段的表達以及細胞免疫檢查點的沉默的聯(lián)合，使得本發(fā)明實施例的轉(zhuǎn)基因淋巴細胞的增殖能力以及對腫瘤的定向殺傷作用更加顯著。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述淋巴細胞細胞免疫檢查點是ctla4、pd-1、cbl-b。其中，ctla4、pd-1是細胞表面免疫檢查點，cbl-b是細胞內(nèi)免疫檢查點。根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明實施例的淋巴細胞細胞表面免疫檢查點ctla4或pd-1被沉默，或淋巴細胞細胞內(nèi)免疫檢查點是cbl-b被沉默，阻止了pd1或ctla4分子表達與其相應(yīng)配體pd-l1及pd-l2或cd80及cd86的結(jié)合，從而有效抑制了對t淋巴細胞的無能或凋亡，或通過cbl-b沉默,增強t細胞受體信號傳導(dǎo)，使得轉(zhuǎn)基因淋巴細胞在腫瘤病人體內(nèi)的增殖和生存能力得到進一步提高，對腫瘤的定向殺傷作用效果更加顯著。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述淋巴細胞細胞內(nèi)免疫檢查點被沉默是通過shrna實現(xiàn)的。根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明實施例的shrna攜帶特異性沉默細胞表面或細胞內(nèi)至少之一免疫檢查點的shrna，本發(fā)明實施例的shrna具有高效、特異性的沉默細胞表面或細胞內(nèi)至少之一免疫檢查點的作用，細胞免疫檢查點的成功沉默，即細胞表面或細胞內(nèi)免疫檢查點的成功沉默，阻止了免疫檢查點與相應(yīng)配體的特異性結(jié)合，從而有效抑制了免疫檢查點對t淋巴細胞無能或凋亡等的負調(diào)控機制，進而使得本發(fā)明實施例的轉(zhuǎn)基因淋巴細胞在在腫瘤病人體內(nèi)的增殖和生存能力得到進一步提高，配合嵌合抗原受體的抗原靶向性，使得本發(fā)明實施例的轉(zhuǎn)基因淋巴細胞對腫瘤的定向殺傷作用效果更加顯著。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述免疫共刺激分子胞內(nèi)段是4-1bb或cd28的胞內(nèi)段。本發(fā)明中的轉(zhuǎn)基因淋巴細胞的嵌合抗原受體的免疫共刺激分子胞內(nèi)段是cd28或者4-1bb的胞內(nèi)段。根據(jù)本發(fā)明的實施例，免疫共刺激分子胞內(nèi)段是cd28或者4-1bb的胞內(nèi)段，進一步增強了本發(fā)明實施例的轉(zhuǎn)基因淋巴細胞的定向殺傷作用。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述淋巴細胞是cd3+t淋巴細胞或自然殺傷細胞或自然殺傷t細胞。本發(fā)明實施例的上述淋巴細胞的細胞免疫檢查點被沉默同時表達抗原特異性的嵌合 抗原受體，如本發(fā)明的實施例的egfrviii抗原特異性的嵌合抗原受體，上述淋巴細胞的細胞免疫殺傷作用的靶向性更強，在腫瘤病人體內(nèi)的增殖和生存能力得到進一步提高，對腫瘤的定向殺傷作用效果更加顯著。

在本發(fā)明的第九方面，本發(fā)明提出了一種構(gòu)建體。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述構(gòu)建體包括：第一核酸分子，所述第一核酸分子編碼嵌合抗原受體；以及第二核酸分子，所述第二核酸分子沉默細胞免疫檢查點。其中，所述細胞免疫檢查點、所述嵌合抗原受體如前所述。根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明實施例的構(gòu)建體成功導(dǎo)入本發(fā)明實施例的淋巴細胞后，可有效沉默細胞表面或細胞內(nèi)至少之一免疫檢查點和表達抗原特異性的嵌合抗原受體，從而本發(fā)明實施例的淋巴細胞對腫瘤細胞，尤其是egfrviii突變的腫瘤細胞的定向殺傷作用更加顯著。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，上述構(gòu)建體還可以進一步包括下列附加技術(shù)特征至少之一：

根據(jù)本發(fā)明的實施例，其特征在于所述第一核酸分子與所述第二核酸分子被設(shè)置在前面所述的淋巴細胞中沉默細胞免疫檢查點和表達所述嵌合抗原受體。根據(jù)本發(fā)明的實施例，成功設(shè)置了上述第一核酸分子以及第二核酸分子的淋巴細胞，其淋巴細胞的細胞表面或細胞內(nèi)至少之一的免疫檢查點被成功沉默，同時在淋巴細胞表面成功表達了抗原特異性，如本發(fā)明實施例的egfrviii特異性的嵌合抗原受體，其具有殺傷力更強和特異性更強的腫瘤殺傷效果，安全性更高。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述構(gòu)建體進一步包括：第一啟動子，所述第一啟動子與所述第一核酸分子可操作地連接；以及第二啟動子,所述第二啟動子與所述第二核酸分子可操作地連接。根據(jù)本發(fā)明的實施例，第一啟動子以及第二啟動子的引入，使得第一核酸分子以及第二核酸分子分別獨立的表達，有效保證了嵌合抗原受體抗原靶向性的生物學(xué)作用及以有效沉默了細胞免疫檢查點，使得本發(fā)明實施例的淋巴細胞的靶向作用更強，對腫瘤的殺傷作用，尤其對egfrviii突變的腫瘤細胞的定向殺傷更加顯著。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述第一啟動子、所述第二啟動子分別獨立地選自u6，h1,cmv，ef-1,ltr,rsv啟動子。根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明實施例的上述啟動子具有啟動效率高、特異性強的特點，從而保證了細胞免疫檢查點的高效沉默和嵌合抗原受體的高效表達，從而本發(fā)明實施例的淋巴細胞的體外增殖能力、在腫瘤病人體內(nèi)的增殖和生存能力大大提高，對腫瘤的定向殺傷效果更加顯著。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述構(gòu)建體的載體是非致病性病毒載體。非致病性病毒載體的引入大大提高了構(gòu)建體在淋巴細胞中的復(fù)制和擴增效率，從而大大提高了細胞免疫檢查點的沉默和嵌合抗原受體在淋巴細胞中的高效表達，使得淋巴細胞體外增殖能力、在腫瘤病人體內(nèi)的增殖和生存能力大大提高，淋巴細胞的靶向作用進一步增強，對腫瘤細胞的殺傷 作用更加顯著。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述構(gòu)建體的載體是病毒載體，所述病毒載體包括選自反轉(zhuǎn)錄病毒載體、慢病毒載體或腺病毒相關(guān)病毒載體的至少之一。本發(fā)明實施例的病毒的載體在病毒包裝和感染過程中，病毒感染范圍廣泛，既可感染終末分化細胞，又可感染處于分裂期的細胞，其基因組既可整合到宿主染色體，又可游離在宿主染色體之外，從而可實現(xiàn)廣譜而高效的感染效率，細胞免疫檢查點被高效沉默和嵌合抗原受體在淋巴細胞中的高效表達，使得本發(fā)明實施例的淋巴細胞的體外增殖能力、在腫瘤病人體內(nèi)的增殖和生存能力大大提高，淋巴細胞的靶向作用進一步增強，對腫瘤細胞，尤其是egfrviii突變的腫瘤細胞的定向殺傷作用更加顯著。

在本發(fā)明的第十方面，本發(fā)明提出了一種制備前面所述的t淋巴細胞或者轉(zhuǎn)基因淋巴細胞的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述方法包括：將前面所述的構(gòu)建體或者前面所述的慢病毒引入到淋巴細胞中或者t淋巴細胞。所述構(gòu)建體或慢病毒成功引入上述淋巴細胞或者t淋巴細胞中，實現(xiàn)了淋巴細胞的細胞免疫檢查被沉默和嵌合抗原受體的表達，從而本發(fā)明實施例的制備方法制備的轉(zhuǎn)基因淋巴細胞或t淋巴細胞在腫瘤病人體內(nèi)和體外的增殖及腫瘤病人體內(nèi)存活能力大大提高，轉(zhuǎn)基因淋巴細胞或t淋巴細胞對腫瘤細胞，尤其是對egfrviii突變的腫瘤細胞的靶向殺傷作用更強。

在本發(fā)明的第十一方面，本發(fā)明提出了一種用于治療癌癥的治療組合物。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述治療組合物包括：上述構(gòu)建體、慢病毒、t淋巴細胞或者轉(zhuǎn)基因淋巴細胞。上述任意一種治療組合物的組成均可實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因淋巴細胞或t淋巴細胞的細胞表面或細胞內(nèi)免疫檢查點的沉默和嵌合抗原受體在轉(zhuǎn)基因淋巴細胞或t淋巴細胞中的高效表達，從而使得所得轉(zhuǎn)基因淋巴細胞或t淋巴細胞具有顯著的抵抗腫瘤細胞介導(dǎo)的免疫抑制，在腫瘤病人體外和體內(nèi)的增殖及腫瘤病人體內(nèi)存活能力大大提高，轉(zhuǎn)基因淋巴細胞或t淋巴細胞對腫瘤細胞的靶向殺傷作用更強，本發(fā)明實施例的治療癌癥的治療組合物對腫瘤細胞的靶向殺傷作用顯著增強，尤其是對egfrviii突變的腫瘤細胞的靶向殺傷作用顯著增強。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，上述治療組合物還可以進一步包括下列附加技術(shù)特征至少之一：

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述癌癥包括腦膠質(zhì)母細胞瘤、非小細胞肺癌、乳腺癌或卵巢癌。腦膠質(zhì)母細胞瘤、非小細胞肺癌、乳腺癌或卵巢癌癌細胞具有egfrviii的特異性表達，本發(fā)明實施例的治療組合物可使淋巴細胞細胞表面或細胞內(nèi)免疫檢查點的沉默和高效表達抗原特異性嵌合抗原受體，如本發(fā)明實施例的egfrviii抗原特異性嵌合抗原受體，所得淋巴細胞或t淋巴細胞具有顯著的抵抗腫瘤細胞介導(dǎo)的免疫抑制的特性，在腦膠質(zhì)母細胞瘤、非小細胞肺癌、乳腺癌或卵巢癌的微環(huán)境中的存活能力大大提高，所得淋巴細胞或t淋巴細胞對egfrviii突變的腦膠質(zhì)母細胞瘤、非小細胞肺癌、乳腺癌或卵巢癌癌的腫瘤細胞的 靶向殺傷作用更強。

在本發(fā)明的第十二方面，本發(fā)明提出了一種提高淋巴細胞活性的方法，所述淋巴細胞攜帶嵌合抗原受體，根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述方法包括：使所述淋巴細胞的細胞免疫檢查點被沉默。所述細胞免疫檢查點、所述淋巴細胞和所述嵌合抗原受體是如前所定義的，所述淋巴細胞活性包括所述淋巴細胞體外增殖能力、在腫瘤病人體內(nèi)的增殖和生存能力以及所述淋巴細胞在腫瘤病人體內(nèi)的定向殺傷能力的至少一種。根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明實施例的淋巴細胞的細胞表面或細胞內(nèi)免疫檢查點被沉默，淋巴細胞被活化、增生性反應(yīng)上調(diào)、細胞因子分泌增多、抗調(diào)亡能力增強，使得本發(fā)明實施例的淋巴細胞在體外擴增、在腫瘤病人體內(nèi)的增殖及腫瘤病人體內(nèi)存活能力大大提高上述淋巴細胞細胞免疫檢查點的沉默配合淋巴細胞嵌合抗原受體的抗原特異性功效，從而實現(xiàn)了有效抵抗腫瘤細胞介導(dǎo)的免疫抑制，對egfrviii突變的腫瘤細胞的靶向殺傷作用顯著增強。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，上述提高淋巴細胞活性的方法還可以進一步包括如下附加技術(shù)特征至少之一：

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述腫瘤包括選自egfrviii突變的腦膠質(zhì)母細胞瘤、egfrviii突變的非小細胞肺癌、egfrviii突變的乳腺癌或egfrviii突變的卵巢癌的至少之一。本發(fā)明實施例的提高淋巴細胞活性的方法，是使淋巴細胞攜帶egfrviii抗原特異性的嵌合抗原受體，同時使淋巴細胞的免疫檢查點被沉默，本發(fā)明實施例的提高淋巴細胞活性的方法特異性進一步提高了對egfrviii突變的腫瘤細胞的定向殺傷能力，如上述egfrviii突變的腫瘤細胞。

需要說明的是，本發(fā)明中所使用的術(shù)語“細胞免疫檢查點”包括細胞表面免疫檢查點和細胞內(nèi)免疫檢查點，“細胞表面免疫檢查點”是一種淋巴細胞表面的膜蛋白，其與腫瘤細胞上表達的配體相互作用，可以抑制抗腫瘤淋巴細胞反應(yīng)。“細胞內(nèi)免疫檢查點”是一種細胞內(nèi)蛋白，此種細胞免疫檢查點蛋白一種負調(diào)控的細胞信號傳導(dǎo)機構(gòu)蛋白，可以抑制抗腫瘤淋巴細胞反應(yīng)。

附圖說明

圖1是根據(jù)本發(fā)明實施例的共表達egfrviii抗原特異性的嵌合抗原受體和沉默人類細胞免疫檢查點的慢病毒載體的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2是根據(jù)本發(fā)明實施例的共表達egfrviii抗原特異性的嵌合抗原受體和沉默pd1的淋巴細胞增殖能力增強的結(jié)果圖；

圖3是根據(jù)本發(fā)明實施例的共表達egfrviii抗原特異性的嵌合抗原受體和沉默pd1的淋巴細胞干擾素-γ分泌增多的結(jié)果圖；以及

圖4是根據(jù)本發(fā)明實施例的共表達egfrviii抗原特異性的嵌合抗原受體和沉默pd1的淋巴細胞殺傷腫瘤細胞能力增強的結(jié)果圖。

具體實施方式

下面詳細描述本發(fā)明的實施例，下面描述的實施例是示例性的，旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。

t淋巴細胞或轉(zhuǎn)基因淋巴細胞

在本發(fā)明的一方面，本發(fā)明提出了一種t淋巴細胞或轉(zhuǎn)基因淋巴細胞。根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明實施例的t淋巴細胞的細胞免疫檢查點被沉默；以及表達嵌合抗原受體，其中，嵌合抗原受體包括：胞外區(qū)，胞外區(qū)包括單鏈抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，單鏈抗體特異性識別抗原egfrviii；跨膜區(qū)，跨膜區(qū)與胞外區(qū)相連，并且嵌入到所t淋巴細胞的細胞膜中；胞內(nèi)區(qū)，胞內(nèi)區(qū)與跨膜區(qū)相連，并且胞內(nèi)區(qū)包括cd28或4-1bb的胞內(nèi)段以及cd3ζ鏈。其中，細胞免疫檢查點包括細胞表面或細胞內(nèi)的免疫檢查點。本發(fā)明實施例的t淋巴細胞或轉(zhuǎn)基因淋巴細胞細胞免疫檢查點被沉默聯(lián)合表達egfrviii抗原特異性的嵌合抗原受體，本發(fā)明實施例的t淋巴細胞或轉(zhuǎn)基因淋巴細胞在腫瘤病人體內(nèi)和體外的增殖和生存能力以及在腫瘤病人體內(nèi)的對特意性腫瘤細胞的殺傷能力顯著增強，尤其對egfrviii突變的腦膠質(zhì)母細胞瘤細胞的特異性殺傷效果大大提高。

腫瘤可以避免免疫監(jiān)視，通過刺激其免疫抑制性受體的表達而關(guān)閉淋巴細胞對其的免疫殺傷反應(yīng)；作為免疫負調(diào)節(jié)機制,激活的細胞毒性t淋巴細胞(ctls)也表達負調(diào)控的監(jiān)管機構(gòu),即細胞表面或細胞內(nèi)的免疫檢查點分子。如本發(fā)明實施例的程序性細胞死亡1受體(pd-1)表達在活化ctls上，其與腫瘤細胞上表達的程序性死亡配體1(pd-l1)相互作用,可以抑制抗腫瘤t細胞反應(yīng)。許多腫瘤,包括淋巴瘤、肺癌、卵巢癌、黑色素瘤、胰腺腫瘤,表達pd-l1。pd-l1與其配體pd-1的結(jié)合，導(dǎo)致ctls增生性反應(yīng)的下調(diào),細胞因子的分泌減少,和t細胞的無能或凋亡。本發(fā)明實施例的細胞毒性t淋巴細胞抗原4(ctla-4)是另一個t細胞的關(guān)鍵負面調(diào)節(jié)因子，其可抑制t細胞活化，其通過與表達在抗原遞呈細胞上的配體b7.1、b7.2(cd80和cd86)的相互作用而抑制t細胞的活化。本發(fā)明實施例的細胞毒性t淋巴細胞內(nèi)的cbl-b(e3泛素蛋白連接酶cbl-b)是細胞內(nèi)的另一個關(guān)鍵負面調(diào)節(jié)因子，其通過抑制t細胞受體(tcr)信號傳導(dǎo)，來抑制t細胞的活性。因此，本發(fā)明實施例的t淋巴細胞或轉(zhuǎn)基因淋巴細胞的免疫檢查點被沉默，t淋巴細胞或轉(zhuǎn)基因淋巴細胞的在腫瘤病人體內(nèi)的增殖和生存能力顯著提高。

另外，根據(jù)本發(fā)明的實施例，上述嵌合抗原受體胞外區(qū)的抗體為單鏈抗體。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，單鏈抗體可去除非特異性反應(yīng)的競爭性表面蛋白，同時單鏈抗體更易滲透腫瘤組織增 加藥物治療濃度。本發(fā)明實施例的轉(zhuǎn)基因淋巴細胞表達單鏈抗體的嵌合抗原受體，大大提高了轉(zhuǎn)基因淋巴細胞對靶向腫瘤細胞的定向殺傷作用。

根據(jù)本發(fā)明的另外一些實施例，上述抗體的結(jié)合抗原為egfrviii。因此本發(fā)明實施例的轉(zhuǎn)基因淋巴細胞針對表達抗原egfrviii的細胞具有定向性殺傷作用，抗原抗體的特異性結(jié)合作用更強，大大提高了本發(fā)明實施例的轉(zhuǎn)基因淋巴細胞對egfrviii抗原表達腫瘤細胞的定向殺傷作用。

根據(jù)本發(fā)明的另外一些實施例，淋巴細胞的細胞免疫檢查點包括細胞表面和細胞內(nèi)的免疫檢查點，本發(fā)明實施例的淋巴細胞細胞表面免疫檢查點獨立地選自ctla4、pd-1、tim-3、btla、lag-1至少之一，淋巴細胞細胞內(nèi)免疫檢查點獨立地選自irak-m、socs-1、a20、cbl-b的至少之一。上述分子能夠與腫瘤細胞表達的抗原特異性結(jié)合，抑制淋巴細胞的活化，促進淋巴細胞的無能或凋亡，從而負向調(diào)控和減弱細胞免疫應(yīng)答。根據(jù)本發(fā)明的實施例，上述細胞表面或細胞內(nèi)免疫檢查點的成功沉默，進一步提高了轉(zhuǎn)基因淋巴細胞在腫瘤病人體內(nèi)的增殖和生存能力，對腫瘤細胞的定向殺傷作用進一步加強。

根據(jù)本發(fā)明的另外一些實施例，本發(fā)明實施例的淋巴細胞細胞表面免疫檢查點被沉默是通過shrna、反義核酸、核酶、顯性負突變、鋅指核酸酶和crispr至少之一實現(xiàn)的。

小發(fā)夾rna或短發(fā)夾rna(shrna)是sirna(小干擾rna)的導(dǎo)入形式，sirna是一種小rna分子(由21～25個核苷酸組成)，由dicer(rnaaseⅲ家族中對雙鏈rna具有特異性剪切作用的酶)加工而成；sirna在rna沉默通路中起中心作用，對特定信使rna(mrna)進行降解，為轉(zhuǎn)錄水平后調(diào)控。

反義核酸包括反義rna和反義dna，反義rna是指能和mrna完全互補的一段小分子rna或寡聚核苷酸片段，反義dna是指能與基因dna雙鏈中的有義鏈互補結(jié)合的短小dna分子，反義rna和反義dna主要是通過mrna的翻譯和基因dna的轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮作用的；反義核酸一方面通過與靶mrna結(jié)合形成空間位阻效應(yīng)，阻止核糖體與mrna結(jié)合，另一方面其與mrna結(jié)合后激活內(nèi)源性rna酶或核酶，進而降解mrna；反義dna與基因dna雙螺旋的調(diào)控區(qū)特異結(jié)合形成dna三聚體，或與dna編碼區(qū)結(jié)合，終止正在轉(zhuǎn)錄的mrna鏈的延長；反義核酸還可抑制轉(zhuǎn)錄后mrna的加工修飾，如5'端加帽、3'端加尾、中間剪接和內(nèi)部堿基甲基化等，并阻止成熟mrna由細胞核向細胞漿內(nèi)運輸，因此，反義rna是一種有效的沉默目的基因的技術(shù)。

核酶是具有催化功能的rna分子，是生物催化劑，可降解特異的mrna序列，核酶通過催化轉(zhuǎn)磷酸酯和磷酸二酯鍵水解反應(yīng)參與rna自身剪切、加工過程，與一般的反義rna相比，核酶具有較穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，不易受到rna酶的攻擊，更重要的是，核酶在切斷mrna后，又可從雜交鏈上解脫下來，重新結(jié)合和切割其它的mrna分子。

顯性負性突變是指某些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白突變后不僅自身無功能，還能抑制或阻斷同一細胞內(nèi)的野生型信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的作用，其主要通過和野生型蛋白形成二聚物的方式實現(xiàn)，這種突變毒性作用大，能顯著抑制或阻斷細胞內(nèi)目標(biāo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的作用。

鋅指核酸酶由一個dna識別域和一個非特異性核酸內(nèi)切酶構(gòu)成，dna識別域是由一系列cys2-his2鋅指蛋白串聯(lián)組成(一般3～4個)，每個鋅指蛋白識別并結(jié)合一個特異的三聯(lián)體堿基，鋅指蛋白形成α-β-β二級結(jié)構(gòu)，其中α螺旋的16氨基酸殘基決定鋅指的dna結(jié)合特異性，骨架結(jié)構(gòu)保守，對決定dna結(jié)合特異性的氨基酸引入序列的改變可以獲得新的dna結(jié)合特異性，從而可以針對不同的目的基因設(shè)計不同的氨基酸引入序列，實現(xiàn)不同目的基因的特異性沉默。

crispr(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats,規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù))，是一種基因編輯器，是細菌用以保護自身對抗病毒的一個系統(tǒng)。它可以用來刪除、添加、激活或抑制其他生物體的目標(biāo)基因，這些目標(biāo)基因包括人細胞內(nèi)的目標(biāo)基因。

crispr簇是一個廣泛存在于細菌和古生菌基因組中的特殊dna重復(fù)序列家族，其序列由一個前導(dǎo)區(qū)(leader)、多個短而高度保守的重復(fù)序列(repeat)和多個間隔區(qū)(spacer)組成。前導(dǎo)區(qū)一般位于crispr簇上游，是富含at長度為300～500bp的區(qū)域，被認為可能是crispr簇的啟動子序列。重復(fù)序列區(qū)長度為21～48bp，含有回文序列，可形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)。重復(fù)序列之間被長度為26～72bp的間隔區(qū)隔開。spacer區(qū)域由俘獲的外源dna組成，當(dāng)含有同樣序列的外源dna入侵時，可被細菌機體識別，并進行剪切使之表達沉默，達到保護自身安全的目的。通過對crispr簇的側(cè)翼序列分析發(fā)現(xiàn)，在其附近存在一個多態(tài)性家族基因。該家族編碼的蛋白質(zhì)均含有可與核酸發(fā)生作用的功能域(具有核酸酶、解旋酶、整合酶和聚合酶等活性)，并且與crispr區(qū)域共同發(fā)揮作用，因此被命名為crispr關(guān)聯(lián)基(crisprassociated)，縮寫為cas。目前發(fā)現(xiàn)的cas包括cas1～cas10等多種類型。cas基因與crispr共同進化，共同構(gòu)成一個高度保守的系統(tǒng)。當(dāng)細菌抵御噬菌體等外源dna入侵時，在前導(dǎo)區(qū)的調(diào)控下，crispr被轉(zhuǎn)錄為長的rna前體(prerisprrna，pre-crrna)，然后加工成一系列短的含有保守重復(fù)序列和間隔區(qū)的成熟crrna，最終識別并結(jié)合到與其互補的外源dna序列上發(fā)揮剪切作用。pre-crrna的加工由cas家族中的cas9參與。cas9含有在氨基末端的ruvc和蛋白質(zhì)中部的hnh2個獨特的活性位點，在crrna成熟和雙鏈dna剪切中發(fā)揮作用。pre-crrna轉(zhuǎn)錄的同時，與其重復(fù)序列互補的反式激活crrna(trans-activatingcrrna，tracrrna)也轉(zhuǎn)錄出來，并且激發(fā)cas9和雙鏈rna特異性rnaseiii核酸酶對pre-crrna進行加工。加工成熟后，crrna、tracrrna和cas9組成復(fù)合體，識別并結(jié)合于crrna互補的序列，然后解開dna雙鏈，形成r-loop，使crrna與互補鏈雜交，另一條鏈保持游離的單鏈狀態(tài)，然后由cas9中的hnh活性位點剪切crrna的互補dna鏈，ruvc活性位點剪切非互補 鏈，最終引入dna雙鏈斷裂(dsb)。通過人工設(shè)計rna，可以改造形成具有引導(dǎo)作用的sgrna(shortguiderna)，以引導(dǎo)cas9對dna的定點目標(biāo)基因切割。

綜上所述，shrna、反義核酸、核酶、顯性負突變、crispr、鋅指核酸酶為特異性沉默目標(biāo)基因的有效手段，沉默基因的手段不受特別限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)具體的實驗?zāi)康暮蜅l件選擇，如本發(fā)明實施例所采用的shrna、反義核酸、核酶、顯性負突變，crispr或鋅指核酸酶的至少之一，實現(xiàn)目的基因的特異性沉默。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，淋巴細胞細胞表面或細胞內(nèi)免疫檢查點被沉默優(yōu)選采用shrna實現(xiàn)。shrna所攜帶的sirna分子通常是一個長度在10和30之間的堿基對的雙重區(qū)域。本發(fā)明實施例的pd1或ctla4或cbl-bsirna被設(shè)計為同源于pd1或ctla4或cbl-bmrna的編碼區(qū)域，通過mrna的降解來抑制基因表達。sirna關(guān)聯(lián)于被稱為誘導(dǎo)rna沉默復(fù)合物(risc)的多重蛋白復(fù)合物，在此期間正義鏈被酶裂解。被激活的risc中基于序列同源性，指引risc到對應(yīng)的mrna；相同的核酸酶切割靶向pd1或ctla4或cbl-bmrna，產(chǎn)生特定基因pd1或ctla4或cb1沉默，抑制特定基因pd1或ctla4或cbl-b的表達。sirna以shrna的形式導(dǎo)入細胞(shrna包含大約18-23的核苷酸sirna序列，后跟一個9-15長度的核苷酸環(huán)和一個sirna序列的反向補充)，shrna的設(shè)計較好的避免了在3’utr細胞基因中的匹配點；確保了適當(dāng)?shù)逆溸x擇。一個單一sirna分子可被重復(fù)應(yīng)用于多靶向mrna分子的分裂。rnai(rna干擾)可通過引入合成sirna的方式被誘導(dǎo)。根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明實施例的shrna不斷產(chǎn)自細胞內(nèi)，因此其效果更加持久，從而延長shrna周期，本發(fā)明實施例采用的shrna具有高效、特異性的沉默細胞表面或細胞內(nèi)免疫檢查點的作用，細胞表面或細胞內(nèi)免疫檢查點的成功沉默，使得轉(zhuǎn)基因淋巴細胞具有顯著的抵抗腫瘤介導(dǎo)的免疫抑制的特性，在腫瘤病人體內(nèi)的增殖和生存能力得到進一步提高，對腫瘤的定向殺傷作用效果更加顯著。

另外，根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述免疫共刺激分子胞內(nèi)段獨立地選自4-1bb、ox-40、cd40l、cd27、cd30、cd28以及他們的衍生物的至少一種。免疫共刺激分子胞內(nèi)段的表達和細胞表面或細胞內(nèi)至少之一免疫檢查點的沉默聯(lián)合具有正向調(diào)控和增強細胞免疫應(yīng)答的作用，使得轉(zhuǎn)基因淋巴細胞具有顯著的抵抗腫瘤介導(dǎo)的免疫抑制的特性，在腫瘤病人體內(nèi)的增殖和生存能力得到進一步提高，對egfrviii突變的腫瘤的定向殺傷作用效果更加顯著。

根據(jù)本發(fā)明的另外一些實施例，淋巴細胞細胞表面免疫檢查點優(yōu)選ctla4或pd-1，淋巴細胞內(nèi)免疫檢查點優(yōu)選cbl-b。根據(jù)本發(fā)明的時施例，淋巴細胞細胞表面免疫檢查點ctla4或pd-1被沉默或細胞內(nèi)免疫檢查點cbl-b被沉默，使得轉(zhuǎn)基因淋巴細胞具有更加顯著的抵抗腫瘤介導(dǎo)的免疫抑制的特性，其在腫瘤病人體內(nèi)的增殖和生存能力得到進一步 提高，對腫瘤的定向殺傷作用效果更加顯著。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明實施例的淋巴細胞是cd3+淋巴細胞或自然殺傷細胞或自然殺傷t細胞。cd3+淋巴細胞是總t細胞，自然殺傷細胞是免疫細胞的一種，非特異性性識別靶細胞，自然殺傷t細胞是具有t細胞和自然殺傷細胞受體的t細胞亞群。上述淋巴細胞中免疫檢查點被沉默和表達嵌合抗原受體，使得上述淋巴細胞的細胞免疫的靶向殺傷性更強，對腫瘤細胞的殺傷作用效果更加顯著。

慢病毒或構(gòu)建體

在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提出了一種慢病毒或構(gòu)建體。根據(jù)本發(fā)明的實施例，慢病毒或構(gòu)建體攜帶下列核酸分子：編碼嵌合抗原受體的核酸分子，嵌合抗原受體具有seqidno：1所示的氨基酸序列，編碼嵌合抗原受體的核酸分子具有seqidno：2所示的核苷酸序列；以及沉默細胞表面或細胞內(nèi)免疫檢查點的核酸分子，沉默細胞表面免疫檢查點的核酸分子的核苷酸序列為選自seqidno：3～68的至少之一，沉默細胞內(nèi)免疫檢查點的核酸分子的核苷酸序列為選自seqidno：69～135的至少之一。其中，seqidno：3～14是人類程序性死亡受體1(pd1)sirna核苷酸序列，seqidno：15～30是人類細胞毒t淋巴細胞相關(guān)抗原4(ctla4)sirna序列，seqidno：31～46是人類t細胞免疫球蛋白粘蛋白分子3(tim3)sirna序列，seqidno：47～57是人類t淋巴細胞衰減因子(btla)sirna序列，seqidno：58～68是人類淋巴細胞活化基因3蛋白(lag1)sirna序列，seqidno：69～85是人類irak-m(白細胞介素-1受體相關(guān)激酶3)sirna核苷酸序列，seqidno：86～96是人類socs1(細胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子1)sirna序列，seqidno：97～116是人類a20(腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)蛋白a20)sirna序列，seqidno：117～135是人類cbl-b(e3泛素蛋白連接酶cbl-b)sirna序列，根據(jù)本發(fā)明的實施例，將本發(fā)明實施例的逆轉(zhuǎn)錄病毒或構(gòu)建體導(dǎo)入淋巴細胞所得的轉(zhuǎn)基因淋巴細胞中，其細胞表面的免疫檢查點pd1、ctla4、tim3、btla、lag1或細胞內(nèi)免疫檢查點irak-m、socs1、a20、cbl-b被特異性沉默和抑制表達，同時在其細胞表面表達抗egfrviii的嵌合抗原受體，從而本發(fā)明實施例的轉(zhuǎn)基因淋巴細胞具有了顯著的抵抗腫瘤介導(dǎo)的免疫抑制的功效，抗調(diào)亡能力和增殖能力增強、定向殺傷能力顯著提高，本發(fā)明實施例的轉(zhuǎn)基因淋巴細胞在腫瘤病人體內(nèi)和體外的增殖和生存能力以及在腫瘤病人體內(nèi)的殺傷能力大大提高，尤其對egfrviii突變的腦膠質(zhì)母細胞瘤細胞特異性殺傷效果尤為顯著。

根據(jù)本發(fā)明地實施例，本發(fā)明實施例的慢病毒或構(gòu)建體攜帶含有seqidno：136、137、138或139所示的核苷酸序列。其中，seqidno：136是共表達抗egfrviii嵌合抗原受體和沉默細胞表面免疫檢查點pd-1的核酸分子(egfrviii-car/ipd1)，seqidno：137是共表達抗egfrviii嵌合抗原受體和沉默細胞內(nèi)免疫檢查點cbl-b的核酸分子 (egfrviii-car/icbl-b)，seqidno：138是共表達抗egfrviii嵌合抗原受體、沉默細胞表面免疫檢查點pd1和沉默細胞內(nèi)免疫檢查點cbl-b的核酸分子(egfrviii-car/ipd1-cbl-b)，seqidno：139是共表達抗egfrviii嵌合抗原受體、沉默細胞表面免疫檢查點pd1和沉默另一個細胞表面免疫檢查點ctla4的核酸分子(egfrviii-car/ipd1-ctla4)。根據(jù)本發(fā)明的實施例，將本發(fā)明實施列的慢病毒導(dǎo)入淋巴細胞所得的轉(zhuǎn)基因淋巴細胞，其細胞表面的免疫檢查點pd1或ctla4被特異性沉默，或細胞內(nèi)的免疫檢查cbl-b被特異性沉默，以及抗egfrviii的嵌合抗原受體表達，使得轉(zhuǎn)基因淋巴細胞具有顯著的抵抗腫瘤介導(dǎo)的免疫抑制的功效，其抗調(diào)亡能力和增殖能力增強、定向殺傷能力顯著提高，從而使得轉(zhuǎn)基因淋巴細胞在腫瘤病人體外和體內(nèi)的增殖和生存能力以及在腫瘤病人體內(nèi)的殺傷能力大大提高，尤其對egfrviii突變的腦膠質(zhì)母細胞瘤細胞的特異性殺傷效果尤為顯著。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，發(fā)明人是通過如下方式實現(xiàn)上述細胞嵌合抗原受體以及表面或細胞內(nèi)免疫檢查點shrna分別獨立地表達的，其中，需要說明的是，此處的表達既指蛋白的表達又指rna轉(zhuǎn)錄。

啟動子：第一啟動子，第一啟動子與編碼嵌合抗原受體的核酸分子可操作地連接；以及第二啟動子，第二啟動子與沉默細胞免疫檢查點的核酸分子可操作地連接。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所采用的第一啟動子、第二啟動子分別獨立地選自u6，cmv,h1，ef-1,ltr,rsv啟動子，第一以及第二啟動子的引入，使得編碼嵌合抗原受體的核酸分子和沉默細胞免疫檢查點的核酸分子分別獨立的表達，從而有效沉默了細胞表面或細胞內(nèi)免疫檢查點，并且保證了嵌合抗原受體的高效表達，使得淋巴細胞在腫瘤環(huán)境中的成活率大大提高，淋巴細胞的靶向作用更強，對腫瘤的特異性殺傷作用更加顯著。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，也可進一步引入第三啟動子，第三啟動子與沉默細胞的免疫檢查點的核酸分子可操作的連接，第三啟動子和第二啟動子所連接的沉默細胞的免疫檢查的核酸分子不同，第三啟動子和第二啟動子分別啟動沉默不同免疫檢查點的shrna。

通過上述第一、第二啟動子或進一步第三啟動子的引入，使得細胞表面或細胞內(nèi)免疫檢查點被高效沉默和嵌合抗原受體高效地表達在本發(fā)明實施例的轉(zhuǎn)基因淋巴細胞膜上，從而高效抑制了免疫檢查點的免疫負調(diào)控和保證了嵌合抗原受體的生物學(xué)作用，從而使得淋巴細胞在腫瘤環(huán)境中的成活率大大提高，淋巴細胞的靶向殺傷作用更加顯著。

另外，根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明實施例的構(gòu)建體的載體是非致病性病毒載體。非致病性病毒載體大大提高了構(gòu)建體在淋巴細胞中的復(fù)制和擴增效率，進而本發(fā)明實施例的淋巴細胞在腫瘤病人體內(nèi)的增殖和生存能力大大提高，淋巴細胞的靶向作用進一步增強，對腫瘤細胞的殺傷作用更加顯著。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明實施例的構(gòu)建體的載體是病毒載體，病毒載體選自反轉(zhuǎn) 錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體或腺病毒關(guān)聯(lián)病毒載體的至少之一。根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明實施例的病毒的載體在病毒包裝和感染過程中，病毒感染范圍廣泛，既可感染終末分化細胞，又可感染處于分裂期的細胞，既可整合到宿主染色體，又可游離在宿主染色體之外，實現(xiàn)廣譜而高效的感染效率，從而細胞表面或細胞內(nèi)免疫檢查點被高效沉默和嵌合抗原受體在淋巴細胞中高效表達，本發(fā)明實施例的淋巴細胞的在腫瘤病人體內(nèi)的增殖和生存能力大大提高，淋巴細胞的靶向作用進一步增強，對腫瘤細胞的殺傷作用更加顯著。

根據(jù)本發(fā)明的具體實施例，以構(gòu)建一個慢病毒載體為例，發(fā)明人為了構(gòu)建一個慢病毒載體，在某些病毒序列的位置，將目的核酸插入到病毒基因組中，從而產(chǎn)生復(fù)制缺陷的病毒。為了產(chǎn)生病毒體，發(fā)明人進而構(gòu)建包裝細胞系(包含gag，pol和env基因，但不包括ltr和包裝成分)。發(fā)明人將含有目的基因的重組質(zhì)粒，連同慢病毒ltr和包裝序列，一起引入包裝細胞系中。包裝序列允許重組質(zhì)粒rna轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物被包裝到病毒顆粒中，然后被分泌到培養(yǎng)基中。進而發(fā)明人收集包含重組慢病毒的基質(zhì)，有選擇性地濃縮，并用于基因轉(zhuǎn)移。慢載體可以感染多種細胞類型，包括可分裂細胞和不可分裂細胞。

另外，根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明實施例的慢病毒是復(fù)合慢病毒，除了常見的慢病毒基因gag，pol和env，還包含有調(diào)控和結(jié)構(gòu)功能的其他基因。慢病毒載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，慢病毒包括：人類免疫缺陷病毒hiv–1，hiv–2和猿猴免疫缺陷病毒siv。慢病毒載體通過多重衰減艾滋病毒致病基因產(chǎn)生，例如全部刪除基因env，vif，vpr，vpu和nef，使慢病毒載體形成生物安全型載體。重組慢病毒載體能夠感染非分裂細胞，同時可用于體內(nèi)和體外基因轉(zhuǎn)移和核酸序列表達。例如：在合適的宿主細胞中，和帶有包裝功能(gag，pol，env，rev和tat)的兩個或更多的載體一起，能夠感染非分裂細胞。重組病毒的靶向性，是通過抗體或特定配體(靶向特定細胞類型受體)與膜蛋白的結(jié)合來實現(xiàn)的。同時，重組病毒的靶向性通過插入一個有效序列(包括調(diào)控區(qū)域)到病毒載體中，連同另一個編碼了特定靶細胞上的受體的配體的基因，使載體具有了特定的靶向。各種有用的慢病毒載體，以及各種方法和操作等產(chǎn)生的載體，用于改變細胞的表達。根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明實施例的慢病毒載體可有效運送和共表達shrna(sirna的轉(zhuǎn)運形式)，該小shrna可以有效抑制pd1或ctla4或cbl-b的表達。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明實施例的腺關(guān)聯(lián)病毒載體(aav)可使用一種或多種為人熟知的血清類型腺關(guān)聯(lián)病毒載體的dna構(gòu)建。本領(lǐng)域技術(shù)人員構(gòu)建一個合適的腺關(guān)聯(lián)病毒載體，以此攜帶和共表達小發(fā)夾rna，該小發(fā)夾rna可以抑制pd1或ctla4或cbl-b基因的表達。

另外，根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明實施例的也包含微基因。微基因意味著用組合(選 定的核苷酸序列和可操作的必要的相關(guān)連接序列)來指導(dǎo)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)錄和/或基因產(chǎn)物在體內(nèi)或體外的宿主細胞中的表達。應(yīng)用“可操作的連接”序列包含連續(xù)目的基因的表達控制序列，和作用于反式或遠距離控制目的基因的表達控制序列。

另外，本發(fā)明實施例的載體還包括常規(guī)控制元素，在和質(zhì)粒載體一起的細胞轉(zhuǎn)染或/和病毒載體一起的細胞感染中，這些元素允許轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)化和/或小發(fā)夾rna的表達。大量的表達控制序列(包括天然的，可誘導(dǎo)和/或特定組織的啟動子)可能被使用。根據(jù)本發(fā)明的實施例，表達shrna的啟動子為rna聚合酶啟動子。同時，根據(jù)本發(fā)明的實施例，啟動子為選自u6,h1,poli,poliiandpoliii的ran聚合酶啟動子。根據(jù)本發(fā)明的實施例，啟動子為組織特異型啟動子。根據(jù)本發(fā)明的實施例，啟動子為誘導(dǎo)型啟動子。根據(jù)本發(fā)明的實施例，啟動子為選自基于所選載體的啟動子。根據(jù)本發(fā)明的實施例，當(dāng)選擇慢病毒載體時，啟動子為u6,h1,cmvie基因,ef-1α,泛素c,或磷酸甘油激酶(pgk)啟動子。其他常規(guī)表達控制序列包括可選標(biāo)記或報告基因，包括編碼遺傳霉素，潮霉素，氨芐青霉素或嘌呤霉素耐藥性等的核苷酸序列。載體的其他組件包括復(fù)制起點。

構(gòu)建載體的技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，這些技術(shù)包括常規(guī)克隆技術(shù)，例如在本發(fā)明實施例中所使用的shrna、聚合酶鏈反應(yīng)和任何適當(dāng)?shù)奶峁┧璧暮塑账嵝蛄械姆椒ā?/p>

根據(jù)本發(fā)明的實施例，發(fā)明人構(gòu)建了共表達小發(fā)夾rna(shrna)(用來抑制免疫檢查點)以及嵌合抗原受體(car)的病毒載體。本發(fā)明實施例的運送沉默pd1或ctla4或cbl-b的sirna的小發(fā)夾rna以及表達嵌合抗原受體(car)的病毒載體或質(zhì)粒是復(fù)合的，此病毒載體或質(zhì)?？山Y(jié)合聚合物或其他材料來增加其穩(wěn)定性，或協(xié)助其靶向運動。

制備轉(zhuǎn)基因淋巴細胞的方法

在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提出了一種制備前面所述的t淋巴細胞或者轉(zhuǎn)基因淋巴細胞的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法包括：將前面所述的構(gòu)建體或者前面所述的慢病毒引入到淋巴細胞中或者t淋巴細胞。引入方式可以選自電轉(zhuǎn)或病毒感染宿主細胞的方式引入。本發(fā)明實施例的構(gòu)建體或慢病毒成功引入上述淋巴細胞或者t淋巴細胞中，實現(xiàn)了針對抗原egfrviii的嵌合抗原受體的表達和淋巴細胞的細胞表面或細胞內(nèi)免疫檢查點被沉默，從而使得所得淋巴細胞或t淋巴細胞具有顯著的抵抗腫瘤介導(dǎo)的免疫抑制的功效，在腫瘤病人體內(nèi)和體外的增殖及腫瘤病人體內(nèi)存活能力大大提高，淋巴細胞或t淋巴細胞對腫瘤細胞，尤其是egfrviii突變的腦膠質(zhì)母細胞瘤細胞的靶向殺傷作用更強。

治療癌癥的治療組合物

在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明的提出了一種用于治療癌癥的治療組合物。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該治療組合物包括：上述構(gòu)建體、上述慢病毒、上述t淋巴細胞或者上述轉(zhuǎn)基因淋巴細胞。上述任意一種治療組合物的組成均可實現(xiàn)針對抗原egfrviii嵌合抗原受體在 轉(zhuǎn)基因淋巴細胞或t淋巴細胞中的高效表達和轉(zhuǎn)基因淋巴細胞或t淋巴細胞細胞表面或細胞內(nèi)免疫檢查點的沉默，從而使得所得轉(zhuǎn)基因淋巴細胞或t淋巴細胞在體外擴增、在腫瘤病人體內(nèi)的增殖及腫瘤病人體內(nèi)存活能力大大提高，轉(zhuǎn)基因淋巴細胞或t淋巴細胞對egfrviii腫瘤細胞的靶向殺傷作用更強。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，提供給患者的本發(fā)明實施例的治療組合物,較好的應(yīng)用于生物兼容溶液或可接受的藥學(xué)運載載體。作為準(zhǔn)備的各種治療組合物被懸浮或溶解在醫(yī)藥上或生理上可接受的載體，如生理鹽水；等滲的鹽溶液或其他精于此道的人的比較明顯的配方中。適當(dāng)?shù)妮d體在很大程度上取決于給藥途徑。其他有水和無水的等滲無菌注射液和有水和無水的無菌懸浮液，是醫(yī)藥上可接受的載體。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，足夠數(shù)量的病毒載體被轉(zhuǎn)導(dǎo)入靶向t細胞中，并提供足夠強度的轉(zhuǎn)基因，沉默pd1或ctla4或cbl-b和表達特有的egfrviii嵌合抗原受體。治療試劑的劑量主要取決于治療狀況,年齡，體重，病人的健康程度，從而可能造成病人的變異性。

沉默pd1或ctla4或cbl-b以及表達特有的針對抗原egfrviii嵌合抗原受體的這些方法是聯(lián)合治療的一部分。這些病毒載體和用于過繼免疫治療的抗腫瘤t細胞，可以被單獨或結(jié)合其他治療癌癥的方法一起執(zhí)行。在合適的條件下，一個治療方法的包括使用一個或多個藥物療法。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述癌癥包括腦膠質(zhì)母細胞瘤、非小細胞肺癌、乳腺癌或卵巢癌。下列生物效應(yīng)的至少之一：細胞表面或細胞內(nèi)免疫檢查點的沉默，聯(lián)合嵌合抗原受體在轉(zhuǎn)基因淋巴細胞或t淋巴細胞中的高效表達，使得所得淋巴細胞或t淋巴細胞在腦膠質(zhì)母細胞瘤、非小細胞肺癌、乳腺癌或卵巢癌的環(huán)境中的存活能力大大提高，淋巴細胞或t淋巴細胞對腦膠質(zhì)母細胞瘤、非小細胞肺癌、乳腺癌或卵巢癌的腫瘤細胞的靶向殺傷作用更強，尤其對egfrviii突變的上述腫瘤細胞的殺傷作用更加顯著。

提高淋巴細胞活性的方法

在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提出了一種提高淋巴細胞活性的方法，本發(fā)明實施例的淋巴細胞攜帶嵌合抗原受體，根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法包括:使所述淋巴細胞的細胞表面或細胞內(nèi)免疫檢查點被沉默，細胞表面或細胞內(nèi)免疫檢查點、淋巴細胞、嵌合抗原受體是如前所定義的。根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明實施例的淋巴細胞活性包括淋巴細胞體外增殖能力，在腫瘤病人體內(nèi)的增殖和生存能力以及淋巴細胞在腫瘤病人體內(nèi)的殺傷能力的至少一種。根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明實施例的淋巴細胞的細胞表面或細胞內(nèi)免疫檢查點被沉默，淋巴細胞被活化、增生性反應(yīng)上調(diào)、細胞因子分泌增多、抗調(diào)亡能力增強。本發(fā)明實施例的淋巴細胞在體外擴增和增殖、對腫瘤細胞的靶向殺傷作用顯著增強。

下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的方案進行解釋。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下面的實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體技術(shù)或條件的，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻所描述的技術(shù)或條件(例如參考j.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實驗指南》，第三版，科學(xué)出版社)或者按照產(chǎn)品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實施例1

本發(fā)明實施例中所用到的細胞系和基本實驗技術(shù)如下所述：

慢病毒的產(chǎn)生和人t淋巴細胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)

產(chǎn)生復(fù)制缺陷的慢病毒載體，并將慢病毒載體離心收集用于人t淋巴細胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)。下面簡要介紹慢病毒載體的產(chǎn)生、收集的實驗過程：將293t細胞鋪在底面積為150-平方厘米的細胞培養(yǎng)皿中，并根據(jù)說明書，使用express-in(購自openbiosystems/thermoscientific,waltham,ma)對293t細胞進行病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)。每盤細胞加入15μg的慢病毒轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒、5μg的pvsv-g(vsv糖蛋白表達質(zhì)粒)、10μg的pcmvr8.74質(zhì)粒(gag/pol/tat/rev表達質(zhì)粒)和174μl的express-in(濃度為1μg/μl)。分別于24小時和48小時收集上清，并使用超速離心機在28,000rpm(離心機轉(zhuǎn)子為beckmansw32ti，購自beckmancoulter,brea,ca)的條件下離心2小時。最后用0.75ml的rpmi-1640培養(yǎng)基對病毒質(zhì)粒沉淀進行重懸。

從健康志愿者供體上分離人原代t淋巴細胞。人t淋巴細胞培養(yǎng)在rpmi-1640培養(yǎng)基中并使用抗cd3和cd28的單克隆抗體包被的珠(購自invitrogen,carlsbad,ca)進行刺激激活。人t淋巴細胞激活后的18～24小時，采用自旋-接種的方法對t淋巴細胞進行轉(zhuǎn)導(dǎo)，轉(zhuǎn)導(dǎo)過程如下所述：在24-孔板中，每孔鋪有0.5×10⁶t淋巴細胞，向每孔細胞中加入0.75ml的上述重懸的病毒上清和polybrene(濃度為8μg/ml)。細胞和病毒質(zhì)粒的混合液在臺式離心機(購自sorvallst40；thermoscientific)中離心，離心條件是室溫，2500rpm，時間為90分鐘。人重組白細胞介素-2(il-2；購自novartis,basel,switzerland)每隔2～3天加入t淋巴細胞培養(yǎng)液中，il-2的終濃度為100-iu/ml,在t淋巴細胞培養(yǎng)過程中，保持細胞的密度為0.5×10⁶～1×10⁶/ml。一旦被轉(zhuǎn)導(dǎo)的t淋巴細胞出現(xiàn)休眠，例如細胞生長速度變慢和細胞變小，其中，細胞生長速度和大小是通過coultercounter(購自beckmancoulter)評估的，或被轉(zhuǎn)導(dǎo)的t淋巴細胞在某個計劃的時間點上，t淋巴細胞即可用來做功能分析。

本申請的實施例中所用的流式細胞儀為bdfacscantoii(購自bdbiosciences)，并且流式細胞分析數(shù)據(jù)使用flowjoversion7.2.5軟件(購自treestar,ashland,or)進行分析。

測定細胞因子的分泌

在質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)后的2-7天，非轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)導(dǎo)了嵌合抗原受體質(zhì)粒的t細胞(細胞個數(shù)是1×10⁶/孔)與egfrviii-u87腦瘤細胞共培養(yǎng)，實驗過程中改變不同的效靶細胞比例。應(yīng)用特定的酶聯(lián)免疫吸附測定法(細胞因子酶聯(lián)免疫吸附測試劑盒，購自r&dsystems,inc.,minneapolis,mn,usa)檢測細胞上清液中細胞因子的產(chǎn)量。上述細胞上清液取自培養(yǎng)了24小時、48小時和72小時之后的細胞的上清，測定結(jié)果用來衡量有代表性的細胞因子(干擾素-γ)(ifnγ)的產(chǎn)量。

簡要測定過程如下：酶標(biāo)板中加入100微升/孔的作為一系列標(biāo)準(zhǔn)對照的細胞因子稀釋溶液(如ifnγ)或待測細胞上清溶液，并將酶標(biāo)板在室溫下放置2小時。2小時后吸棄酶標(biāo)板中溶液并用400微升的洗液潤洗酶標(biāo)板，潤洗四次。潤洗后，向酶標(biāo)板每個孔中加入200微升的酶聯(lián)抗細胞因子抗體。繼續(xù)在室溫下放置2個小時，之后向每孔中加入200微升的底物溶液。加入底物溶液后，將酶標(biāo)板在室溫下放置30分鐘，之后，向每孔中加入50微升的終止反應(yīng)液。在30分鐘內(nèi)測定酶標(biāo)板每孔的光密度。酶標(biāo)儀設(shè)置在450nm。

鉻釋放實驗

實施例中應(yīng)用4–小時⁵¹鉻釋放法分析評估抗egfrviii嵌合抗原受體t細胞(抗egfrviiicart淋巴細胞)的細胞毒活性。具體步驟如下：目標(biāo)測試細胞用⁵¹cr在37攝氏度下標(biāo)記1小時。標(biāo)記后，用含有10％胎牛血清(fcs)的rpmi培養(yǎng)基潤洗細胞。潤洗后，將細胞重懸在相同的培養(yǎng)基中，重懸細胞的濃度是1×10⁵/ml。轉(zhuǎn)導(dǎo)后t細胞以不同的效靶細胞比值(e：t)加入目標(biāo)測試細胞懸浮液中，并將細胞種在96-孔中，每孔體積是200微升。將細胞在37度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時。4小時后，從每孔中取出30微升的上清放于計數(shù)器的96-微孔板進行計數(shù)分析。分析儀器是頂級計數(shù)nxt微閃爍計數(shù)器(購自packardbioscience)。所有計數(shù)孔中效應(yīng)細胞的數(shù)目是基于t細胞總數(shù)來計算的。被標(biāo)記的目標(biāo)測試細胞是egfrviii-u87腦瘤細胞。

實施例2構(gòu)建共表達沉默細胞免疫檢查點shrna和抗egfrviii嵌合抗原受體的載體

本實施例中，發(fā)明人將編碼有抗人egfrviii的單鏈抗體的序列、4-1bb胞內(nèi)段和t細胞受體組合的ζ-鏈序列克隆到含有ef-1啟動子的慢病毒載體(lentiviralvector)上，克隆過程中，選擇的限制性酶切是xbai和noti雙酶切,以及noti和xhoi雙酶切,通過酶切、連接、篩選和目的質(zhì)粒的擴增，生成表達抗egfrviii嵌合抗原受體的慢病毒質(zhì)粒(lv-egfrviiicar)。包含u6啟動子和人pd1-shrna(ipd1)或cbl-b-shrna(icbl-b)的序列被克隆進 lv-egfrviiicar載體質(zhì)粒,構(gòu)建成lv-egfrviiicar/ipd1或lv-egfrviiicar/icbl-b。.圖1是慢病毒載體的示意圖，包含編碼抗egfrviii嵌合抗原受體的序列,u6andh1啟動子序列,pd1-shrna或cbl-b-shrna序列?？筫gfrviii嵌合抗原受體的序列在啟動子ef-1的啟動調(diào)控下，ctla4,pd1或者cbl-bshrna序列在啟動子u6或h1的啟動調(diào)控下。

實施例3共表達pd1-shrna和抗egfrviii嵌合抗原受體的t淋巴細胞具有細胞增殖能力更高的特點

在本實施例中，外周血淋巴細胞取自不記名供血者。外周血淋巴細胞通過梯度離心進行分離，梯度離心機為ficoll-hypaque。在t淋巴細胞激活因子磁珠cd3/cd28(購自invitrogen,carlsbad,ca)存在下，被激活的t淋巴細胞經(jīng)過慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)、體外擴增培養(yǎng)，方法如實施例1所述。在慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)后的2-7天，轉(zhuǎn)導(dǎo)的t細胞(細胞個數(shù)是1×10⁶/孔)與egfrviii-u87腦瘤細胞共培養(yǎng)，4天后，細胞數(shù)目前由流式儀檢測。實驗結(jié)果如圖2所示。圖2結(jié)果表明，轉(zhuǎn)導(dǎo)了lv-egfrviii-car/ipd1的t淋巴細胞比轉(zhuǎn)導(dǎo)了lv-egfrviii-car或空載lv-gfp的t淋巴細胞的細胞數(shù)顯著增加。標(biāo)注代表每3個孔的平均值±sd。(p<0.05；lv-egfrviii-car/ipd1vs.lv-egfrviii-car).

實施例4共表達pd1-shrna和抗egfrviii嵌合抗原受體的t淋巴細胞具有細胞因子分泌更多的特點

在t淋巴細胞激活因子磁珠cd3/cd28存在下，被激活的t淋巴細胞經(jīng)過慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)、體外擴增培養(yǎng)，方法如實施例1所述。在慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)后的2-7天，轉(zhuǎn)導(dǎo)的t細胞(細胞個數(shù)是1×10⁶/孔)與egfrviii-u87腦瘤細胞共培養(yǎng)，4天后，具有細胞因子分泌由elisa檢測。實驗結(jié)果如圖3所示。圖3結(jié)果表明，轉(zhuǎn)導(dǎo)了lv-egfrviii-car/ipd1的t淋巴細胞比轉(zhuǎn)導(dǎo)了lv-egfrviii-car或空載lv-gfp的t淋巴細胞分泌更多的ifnγ。(p<0.05；lv-egfrviii-car/ipd1vs.lv-egfrviii-car).這說明轉(zhuǎn)導(dǎo)了lv-egfrviii-car/ipd1的t淋巴細胞比轉(zhuǎn)導(dǎo)lv-egfrviii-car的t淋巴細胞的產(chǎn)生細胞因子能力顯著提高。

實施例5共表達pd1-shrna和抗egfrviii嵌合抗原受體的t淋巴細胞腫瘤細胞溶解能力增強。

在本實施例中，外周血淋巴細胞取自不記名供血者。外周血淋巴細胞通過梯度離心進行分離，梯度離心機為ficoll-hypaque。t淋巴細胞與t細胞激活因子磁珠cd3/cd28(購自 invitrogen,carlsbad,ca)在5％co2、37攝氏度下孵育培養(yǎng)72小時，培養(yǎng)基是加有2mmol/l谷氨酰胺,10％高溫滅活的胎牛血清(fcs)(購自sigma-aldrichco.)和100u/ml的青霉素/鏈霉素雙抗的rpmi培養(yǎng)基1640(購自invitrogengibcocat.no.12633-012)。激活培養(yǎng)72小時后，用洗液潤洗細胞，將磁珠洗去。將t細胞種在鋪有重組纖連蛋白片段(fnch-296；retronectin)細胞培養(yǎng)皿上，并用慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo),轉(zhuǎn)導(dǎo)慢病毒分別為lv-egfrviiicar/ipd1,lv-egfrviiicar,或空載(lv-gfp)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程如實施例1所述。轉(zhuǎn)導(dǎo)后的t細胞培養(yǎng)在rpmi-1640培養(yǎng)基中并用重組人類il-2因子(100ng/ml；購自r&dsystems)進行誘導(dǎo)擴增7-10天，然后進行功能測試實驗。發(fā)明人測量轉(zhuǎn)導(dǎo)了不同慢病毒的t細胞(效應(yīng)細胞)對egfrviii突變的腦膠質(zhì)瘤靶細胞的殺傷作用，效靶細胞比例是10：1或1:1，測量方法采用標(biāo)準(zhǔn)4–小時⁵¹鉻釋放法，4–小時⁵¹鉻釋放法如實施例1所述。結(jié)果如圖4所示。如圖4所示,共表達抗egfrviii嵌合抗原受體和pd1-shrna(ipd1)的t淋巴細胞比單獨表達抗egfrviii嵌合抗原受體的t淋巴細胞,可更為有效的殺死egfrviii突變的腦瘤靶細胞?？蛰d慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的t淋巴細胞(對照lv-gfpt淋巴細胞)對egfrviii突變的腦瘤細胞無明顯殺傷作用。統(tǒng)計數(shù)據(jù)代表三個孔的平均值±sem。

實施例6共表達cbl-b-shrna和抗egfrviii嵌合抗原受體的t細胞，共表達pd1-shrna，cbl-b-shrna和抗egfrviii嵌合抗原受體的t細胞,共表達pd1-shrna，ctla4-shrna和抗egfrviii嵌合抗原受體的t細胞的細胞，溶解能力增強并且具有細胞因子分泌更多和細胞增殖更強的特點。

在本實施例中，發(fā)明人還考察了共表達cbl-b-shrna和抗egfrviii嵌合抗原受體的t細胞、共表達2個shrna(pd1-shrna和cbl-b-shrna或pd1-shrna和ctla4-shrna)和抗egfrviii嵌合抗原受體的t細胞的腫瘤溶解能力、細胞因子分泌能力和細胞增殖能力。實驗過程與實施例3，4和5相同。上述t細胞比單獨表達抗egfrviii嵌合抗原受體的t細胞的細胞溶解能力增強，細胞因子分泌更多和細胞增殖更強。共表達2個shrna(pd1-shrna和ctla4-shrna或pd1-shrna和cbl-b-shrna)和抗egfrviii嵌合抗原受體的t細胞比共表達1個shrna(pd1-shrna或cbl-b-shrna)和抗egfrviii嵌合抗原受體的t細胞的細胞溶解能力更強，細胞因子分泌更多和細胞增殖更強。

在本說明書的描述中，參考術(shù)語“一個實施例”、“一些實施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點包含于本發(fā)明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術(shù)語的示意性表述不必須針對的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點可以在任一個或多個實施例或示例中以合適的方式結(jié)合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領(lǐng) 域的技術(shù)人員可以將本說明書中描述的不同實施例或示例以及不同實施例或示例的特征進行結(jié)合和組合。

盡管上面已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，可以理解的是，上述實施例是示例性的，不能理解為對本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的范圍內(nèi)可以對上述實施例進行變化、修改、替換和變型。