本發(fā)明屬于細(xì)胞分化領(lǐng)域，涉及一種使用過氧化氫促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的方法。
背景技術(shù)：
：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bm-msc）屬于成體干細(xì)胞，在骨代謝過程中bm-msc定向分化為成骨細(xì)胞，以維持骨形成能力。由于其再生潛能及免疫調(diào)節(jié)特性，bm-msc已成為組織工程和再生醫(yī)學(xué)中重要的種子細(xì)胞來源。如何提高bm-msc成骨分化能力一直都是相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點。長期以來過氧化氫都被認(rèn)為抑制成骨分化。但有學(xué)者發(fā)現(xiàn)過氧化氫是血管硬化時平滑肌細(xì)胞鈣化的促進(jìn)因素。由此可推測過氧化氫在bm-msc鈣化時也可能發(fā)揮著積極作用。參考bm-msc成骨分化的四個過程：1.bm-msc接收成骨誘導(dǎo)信號，合成成骨相關(guān)酶類；2.分化為成骨前體細(xì)胞并快速增殖；3.合成分泌細(xì)胞外基質(zhì)；4.細(xì)胞外基質(zhì)礦化沉積。發(fā)明人嘗試在成骨分化晚期加入過氧化氫促進(jìn)成骨，取得了良好效果。技術(shù)實現(xiàn)要素：要解決的技術(shù)問題：本發(fā)明公布了一種使用過氧化氫促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的方法，一直以來過氧化氫都被認(rèn)為抑制成骨分化，許多研究使用抗氧化劑以期促進(jìn)成骨。但過氧化氫對于成骨并非是完全有害的，本發(fā)明利用過氧化氫促進(jìn)成骨分化，并揭示了作用機(jī)制。技術(shù)方案：一種使用過氧化氫促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的方法，包括以下步驟：（1）使用完全培養(yǎng)液培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，每三天換液，觀察細(xì)胞的密度變化；（2）待細(xì)胞密度大于90%后加入成骨誘導(dǎo)液進(jìn)行誘導(dǎo)；（3）在誘導(dǎo)13~15天后加入過氧化氫，繼續(xù)誘導(dǎo)成骨分化即可。進(jìn)一步的，所述的一種使用過氧化氫促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的方法，所述的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞取自成年人。進(jìn)一步的，所述的一種使用過氧化氫促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的方法，步驟（1）中所述的完全培養(yǎng)液組中包括α-mem、胎牛血清和抗生素，其中α-mem和胎牛血清的體積比9:1，抗生素濃度為10~200u/ml。進(jìn)一步的，所述的一種使用過氧化氫促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的方法，步驟（2）中所述的成骨誘導(dǎo)液為抗壞血酸、地塞米松和β甘油磷酸鈉的混合物，成骨誘導(dǎo)液為在完全培養(yǎng)基中加入50ug/ml抗壞血酸，100nm地塞米松，10mmβ甘油磷酸鈉。進(jìn)一步的，所述的一種使用過氧化氫促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的方法，步驟（3）中所述的過氧化氫的濃度為40~60um。有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的特點為：公布了一種使用過氧化氫促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的方法并揭示了作用機(jī)制。本結(jié)果說明了氧化氫對于成骨并非是完全有害的，在適當(dāng)時機(jī)加入過氧化氫可促進(jìn)成骨分化。本發(fā)明為成骨相關(guān)研究提供了新方向。附圖說明圖1為對比例1促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的茜素紅染色光鏡圖（標(biāo)尺：100um）；圖2為對比例1促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的鈣結(jié)界定量值比較；圖3為對比例1成骨標(biāo)志基因表達(dá)；圖4為實施例1促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的茜素紅染色光鏡圖（標(biāo)尺：100um）；圖5為實施例1促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的鈣結(jié)節(jié)定量值比較；圖6為實施例1成骨標(biāo)志基因表達(dá)；圖7為對比例2在誘導(dǎo)不同天數(shù)后sirt1基因表達(dá)；圖8為對比例2在誘導(dǎo)不同天數(shù)后sirt1蛋白表達(dá)；圖9為對比例3促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的茜素紅染色光鏡圖（標(biāo)尺：100um）；圖10為對比例3促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的鈣結(jié)界定量值比較；圖11為對比例3成骨標(biāo)志基因表達(dá)。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的解釋說明，但具體實施例并不對本發(fā)明作任何限定。除非特別說明，實施例中所涉及的試劑、方法均為本領(lǐng)域常用的試劑和方法。實施例1骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)蘇在175cm2培養(yǎng)瓶中，加入20ml完全培養(yǎng)基，置于37℃，5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于培養(yǎng)板，待細(xì)胞密度大于90%后加入成骨誘導(dǎo)液，每三天換液。細(xì)胞在誘導(dǎo)14天后加入25、50、100um過氧化氫，21天后進(jìn)行成骨分化鑒定。對比例1骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)蘇在175cm2培養(yǎng)瓶中，加入20ml完全培養(yǎng)基，置于37℃，5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于培養(yǎng)板，待細(xì)胞密度大于90%后加入成骨誘導(dǎo)液，每三天換液。細(xì)胞誘導(dǎo)全程加入25、50、100um過氧化氫，21天后進(jìn)行成骨分化鑒定。對比例2骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)蘇在175cm2培養(yǎng)瓶中，加入20ml完全培養(yǎng)基，置于37℃，5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于培養(yǎng)板，待細(xì)胞密度大于90%后加入成骨誘導(dǎo)液，每三天換液。在誘導(dǎo)第7、14、21天進(jìn)行通路檢測。對比例3骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)蘇在175cm2培養(yǎng)瓶中，加入20ml完全培養(yǎng)基，置于37℃，5%co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于培養(yǎng)板，待細(xì)胞密度大于90%后加入成骨誘導(dǎo)液，每三天換液。細(xì)胞在誘導(dǎo)14天后加入50um過氧化氫和10mm尼克酰胺混合物（sirt1特異性抑制劑），誘導(dǎo)21天后進(jìn)行成骨分化鑒定。實驗方法：a.成骨分化鑒定（1）茜素紅染色和鈣結(jié)節(jié)定量pbs清洗待測細(xì)胞3次，4%多聚甲醛室溫固定15分鐘，pbs清洗3次，12孔板每孔加入300ul茜素紅染液，室溫染色15分鐘，pbs清洗3次，olympus倒置顯微鏡采集圖像。拍照后，每孔加入200ul5%高氯酸，室溫放置10分鐘，溶解液轉(zhuǎn)移至96孔板，酶標(biāo)儀檢測420nm波長吸光值，每組檢測6個復(fù)孔取平局值。（2）rt-pcr鑒定成骨標(biāo)志基因表達(dá)pbs清洗培養(yǎng)板中待測細(xì)胞2次，12孔板每孔加入300ultrizol，室溫下吹打混勻后放入1.5mlep管。按每毫升trizol加200ul的比例加入氯仿，充分震蕩后室溫靜置15分鐘，12000g4℃離心12分鐘。吸取上層無色透明清液至另一ep管，按每毫升trizol加400ul的比例加入異丙醇，充分震蕩后室溫靜置10分鐘，12000g4℃離心8分鐘，可見ep管底少量羽毛狀rna沉淀。棄上清液，加入適量75%乙醇，震蕩ep管，懸浮rna沉淀，8000g4℃離心5分鐘，棄上清液，室溫風(fēng)干30分鐘，無rna酶水重懸沉淀，60℃放置10分鐘。取少量樣品稀釋10倍后加入384孔板，酶標(biāo)儀測260nm、280nm波長吸光值，rna濃度=(a260/a280)*2ug/ul。使用revertaidfirststrandcdnasynthesiskit(thermo)試劑盒逆轉(zhuǎn)錄rna。反應(yīng)體系：（1ug/rna濃度）待測rna、1uloligo（dt）18prinmer、4ul5x逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、1ulribolockrnaseinhibitor、2ul10mmdntpmix、1ulreveraidm-mulvreversetranscriptase，以無rna酶水補(bǔ)齊20ul。反應(yīng)條件：設(shè)定pcr儀反應(yīng)條件為42℃下60分鐘，70℃下5分鐘，4℃下60分鐘。使用itap?universalsybr?greensupermixkit(bio-rad)試劑盒進(jìn)行rt-pcr檢測。引物序列如表1表1.primersusedforreal-timert-pcrgeneforwardprimersequence(5′–3′)reverseprimersequence(5′–3′)gapdhagaaaaacctgccaaatatgatgactgggtgtcgctgttgaagtcbglapgagccccagtcccctaccgacaccctagaccgggccgt反應(yīng)體系：cdna稀釋10倍后，按4ul、10ul、0.5ul、0.5ul、5ul體積混合待測cdna、sybrgreen、上游引物、下游引物、無rna酶水。反應(yīng)條件：設(shè)定pcr儀反應(yīng)條件為95℃3分鐘，95℃10秒，60℃30秒，65℃5秒，進(jìn)行40個循環(huán)?；蛳鄬Ρ磉_(dá)量計算公式為χ=2?δδct，δδct=δe–δc，δe=ctexp?ctgapdh，δc=ctct1?ctgapdh。b.sirt1通路檢測（1）rt-pcr檢測sirt1基因表達(dá)rt-pcr操作步驟同上。引物序列如表2表2.primersusedforreal-timert-pcrgeneforwardprimersequence(5′–3′)reverseprimersequence(5′–3′)gapdhagaaaaacctgccaaatatgatgactgggtgtcgctgttgaagtcsirt1gcgggaatccaaaggataatctgttgcaaaggaaccatga（2）westernblot檢測sirt1蛋白表達(dá)蛋白提?。捍郎y細(xì)胞收集在1.5mlep管中，加入細(xì)胞裂解液、蛋白抑制劑，充分混勻，冰上裂解30分鐘，12000g離心15分鐘，吸取上清液，bca法測定蛋白濃度。制膠：玻璃板夾入制膠卡夾中，加入10%sds-page分離膠，待分離膠聚合后，用濾紙吸凈殘液，加入濃縮膠后立即將梳子插入，待濃縮膠凝固后小心取出梳子。電泳：取等質(zhì)量的蛋白樣品加入等體積2x上樣緩沖液。電泳儀中加入足量電泳液后，將膠固定在電泳儀并小心加樣。加樣完畢后設(shè)置起始電壓60v開始電泳，待樣品全部進(jìn)入分離膠后將電壓調(diào)至160v，至溴酚藍(lán)剛跑至分離膠末端即可終止電泳。撬開玻璃板，輕輕刮去濃縮膠，將分離膠放于3層濾紙上，蓋上硝酸纖維素膜，再加3層濾紙，60v轉(zhuǎn)膜2小時。免疫反應(yīng)：室溫下，先用封閉液將膜封閉1小時，吸除封閉液，加入5ml稀釋一抗，4℃搖床過夜孵育。取出膜，用pbst清洗3次，加入5ml稀釋二抗，室溫下孵育2小時，清洗后加入化學(xué)發(fā)光劑室溫放置5分鐘，在暗室中用x線膠片曝光顯影。條帶光密度值通過imagej軟件（nationalinstitutesofhealth,bethesda,md,usa）進(jìn)行分析，待測蛋白相對表達(dá)量=待測蛋白光密度值/內(nèi)參光密度值。根據(jù)以上結(jié)果可得知，在誘導(dǎo)全程加入過氧化氫會抑制成骨分化，而在誘導(dǎo)14天以后加入過氧化氫則促進(jìn)成骨分化。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，成骨誘導(dǎo)時伴隨著骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞內(nèi)sirt1表達(dá)自發(fā)上調(diào)，過氧化氫對成骨分化的促進(jìn)作用與sirt1的表達(dá)量正相關(guān)。當(dāng)前第1頁12