本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種腎臟干細(xì)胞外泌體的制備方法。

背景技術(shù)：

干細(xì)胞治療腎病是近幾年流行起來(lái)的一種治療方法。因干細(xì)胞具有“無(wú)限”增殖，多向分化潛能，具有造血支持，免疫調(diào)控和自我復(fù)制等特點(diǎn)?？勺鳛槔硐氲摹胺N子”細(xì)胞用于病變引起的組織器官損傷修復(fù)。近年來(lái)基礎(chǔ)研究干細(xì)胞治療腎病過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞可分化成腎固有細(xì)胞，腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞等，所以干細(xì)胞移植后對(duì)腎臟功能具有良好的修復(fù)和重建作用，其與微化中藥滲透療法的作用原理相同，所以二者具有相輔相成的作用。

干細(xì)胞治療腎病有特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)：

①具有強(qiáng)大的增殖能力和多向分化潛能，能夠增殖分化并產(chǎn)生大量后代。

②通過(guò)細(xì)胞間的相互作用及產(chǎn)生細(xì)胞因子抑制t細(xì)胞的增殖及其免疫反應(yīng)，從而發(fā)揮免疫重建的功能。

③具有來(lái)源方便，易于分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增和純化，多次傳代擴(kuò)增后仍具有干細(xì)胞特性。

④低免疫原性。因細(xì)胞處于原始狀態(tài)，不易被識(shí)別，所以不存在免疫排斥的特性，沒(méi)有血型匹配問(wèn)題。

⑤長(zhǎng)期傳代不改變生物學(xué)特性?？煞只赡I固有細(xì)胞，肌細(xì)胞，肝細(xì)胞，成骨細(xì)胞，軟骨細(xì)胞等多種細(xì)胞的能力。

⑥具有歸巢性（靶向性——靶向定位）。損傷性信號(hào)可以刺激干細(xì)胞向受損器官，組織的遷移、分化，能夠歸巢到受損病灶，對(duì)于受損的細(xì)胞進(jìn)行修復(fù)。

但是干細(xì)胞的體內(nèi)歸巢特性無(wú)法精準(zhǔn)掌握，在治療中有局限性。所以，尋找高效的安全的腎病的細(xì)胞治療是臨床上迫切的需求。

外泌體其主要來(lái)源于細(xì)胞內(nèi)內(nèi)溶酶體微粒內(nèi)陷形成的多囊泡體，經(jīng)多囊泡體外膜與細(xì)胞膜融合后釋放到胞外基質(zhì)中。外泌體富含膽固醇和鞘磷脂。2007年，valadi等發(fā)現(xiàn)鼠的肥大細(xì)胞分泌的exosome可以被人的肥大細(xì)胞捕獲，并且其攜帶的mrna成分可以進(jìn)入細(xì)胞漿中可以被翻譯成蛋白質(zhì)，不僅僅是mrna，exosomes所轉(zhuǎn)移的microrna同樣具有生物活性，在進(jìn)入靶細(xì)胞后可以靶向調(diào)節(jié)細(xì)胞中mrna的水平。這一發(fā)現(xiàn)使得研究人員對(duì)exosome的研究熱情激增，截止目前已經(jīng)通過(guò)286項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)了41860種蛋白質(zhì)、2838種microrna、3408種mrna。

一類(lèi)外泌體中常見(jiàn)的細(xì)胞質(zhì)蛋白是rabs蛋白，是鳥(niǎo)苷酸三磷酸酶(gtpases,)家族的一種。它可以調(diào)節(jié)外泌體膜與受體細(xì)胞的融合，有文獻(xiàn)報(bào)道稱(chēng)rab4,rab5和rab11主要出現(xiàn)在早期以及回收的核內(nèi)體中，rab7和rab9主要出現(xiàn)在晚期的核內(nèi)體。現(xiàn)有大量的研究發(fā)現(xiàn)外泌體中含有40種rab蛋白，除了rab蛋白，外泌體中富含具有外泌體膜交換以及融合作用的膜聯(lián)蛋白（包括膜聯(lián)蛋白1、2、4、5、6、7、11等）。外泌體膜上富含參與外泌體運(yùn)輸?shù)乃目缒さ鞍准易澹╟d63,cd81和cd9)）、熱休克蛋白家族（(hsp60,hsp70,hspa5,cct2和hsp90以及一些細(xì)胞特異性的蛋白包括a33（結(jié)腸上皮細(xì)胞來(lái)源）、mhc-ⅱ(抗原提呈細(xì)胞來(lái)源)、cd86(抗原提呈細(xì)胞來(lái)源)以及乳凝集素（不成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞）。其它一些外泌體中的蛋白包括多種的代謝類(lèi)的酶（gapdh,烯醇化酶1,醛縮酶1,pkm2,pgk1,pdia3,gstp1,dpp4,ahcy,tpl1,抗氧化蛋白,p4hb,ldh,親環(huán)素a,fasn,mdh1和cnp）、核糖體蛋白（rps3）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子（黑色素瘤分化相關(guān)因子,arf1,cdc42,人類(lèi)紅細(xì)胞膜整合蛋白,slc9a3r1）、粘附因子（mfge8、整合素）、細(xì)胞骨架蛋白以及泛素等。

但目前的外泌體培養(yǎng)過(guò)程復(fù)雜，取材困難，而且取材來(lái)源有限，制約了外泌體技術(shù)治療腎病的發(fā)展和應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種腎臟干細(xì)胞外泌體制備方法，它能克服現(xiàn)有技術(shù)的弊端，提供腎病治療中需要的腎臟干細(xì)胞外泌體。

為了解決背景技術(shù)所存在的問(wèn)題，本發(fā)明是采用以下技術(shù)方案：一種腎臟干細(xì)胞外泌體制備方法，它包含如下步驟：

步驟(一)：無(wú)菌條件下取健康人尿液150-200毫升，采用無(wú)菌塑料瓶密封后送回實(shí)驗(yàn)室；

步驟(二)：500u/ml雙抗的pbs，400×g10分鐘充分漂洗3遍；

步驟(三)：接種在預(yù)用1%明膠鋪底的24孔板中；

步驟(四)：加入2毫升regm培養(yǎng)基中，放置在37℃下，5%co2的飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；

步驟(五)：隔天半量換液，48h后全量換液，以后每?jī)商鞊Q液1次；5-9天能在顯微鏡下觀察到貼壁腎臟干細(xì)胞，半量換液后繼續(xù)培養(yǎng)，三天后換液，腎臟干細(xì)胞已經(jīng)能穩(wěn)定生長(zhǎng)，每三天換液一次，至腎臟干細(xì)胞生長(zhǎng)鋪滿瓶底，即可進(jìn)行傳代；

步驟(六)：傳代時(shí)去除培養(yǎng)基，用pbs緩沖液洗滌貼壁腎臟干細(xì)胞一次，加入1.5-3.5ml的胰酶-edta，在37℃條件下作用3-8min左右，加入等體積含血清的培養(yǎng)基中止消化，吸管輕吹貼壁腎臟干細(xì)胞，使其從瓶壁上脫落下來(lái)形成細(xì)胞懸液，將腎臟干細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，在1000rpm下離心3-8min，棄上清，用適量l-dmem培養(yǎng)基重懸腎臟干細(xì)胞，傳代比例為1:2，置于37℃、5%co2孵箱中培養(yǎng)；

步驟(七)：取出對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腎臟干細(xì)胞上清液，ps（磷脂酰絲氨酸）親和法，將ps與磁珠結(jié)合，利用親和原理捕獲外泌體囊泡外的ps。

本發(fā)明所使用的方法與免疫磁珠法相似，獲得的外泌體形態(tài)完整，純度最高，由于不使用變性劑，不影響外泌體的生物活性，外泌體可用于細(xì)胞共培養(yǎng)和體內(nèi)注射，在-20℃下長(zhǎng)期保存。

采用上述技術(shù)方案后，本發(fā)明具有以下有益效果：

它能克服現(xiàn)有技術(shù)的弊端。具有取材容易、少量組織即可獲取大量腎臟干細(xì)胞、適宜大規(guī)模培養(yǎng)、對(duì)機(jī)體損傷小等優(yōu)點(diǎn)，并且它取材來(lái)源廣泛，體內(nèi)儲(chǔ)備量大，適宜自體移植，它的培養(yǎng)過(guò)程較為簡(jiǎn)單，操作容易，適合在醫(yī)療業(yè)中腎病治療中使用。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施方式僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

本具體實(shí)施方式采用以下技術(shù)方案：一種腎臟干細(xì)胞外泌體制備方法，它包含如下步驟：

步驟一：無(wú)菌條件下取健康人尿液150-200毫升，采用無(wú)菌塑料瓶密封后送回實(shí)驗(yàn)室；

步驟二：500u/ml雙抗的pbs，400×g10分鐘充分漂洗3遍；

步驟三：接種在預(yù)用1%明膠鋪底的24孔板中；

步驟四：加入2毫升regm培養(yǎng)基中，放置在37℃下，5%co2的飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；

步驟五：隔天半量換液，48h后全量換液，以后每2d換液1次，約7天左右能在顯微鏡下觀察到貼壁腎臟干細(xì)胞，半量換液后繼續(xù)培養(yǎng)，三天后換液，腎臟干細(xì)胞已經(jīng)能穩(wěn)定生長(zhǎng)，每三天換液一次，至腎臟干細(xì)胞生長(zhǎng)鋪滿瓶底，即可進(jìn)行傳代；

步驟六：傳代時(shí)去除培養(yǎng)基，用pbs緩沖液洗滌貼壁腎臟干細(xì)胞一次，加入1.5-3.5ml的胰酶-edta，在37℃條件下作用3-8min左右，加入等體積含血清的培養(yǎng)基中止消化，吸管輕吹貼壁腎臟干細(xì)胞，使其從瓶壁上脫落下來(lái)形成細(xì)胞懸液，將腎臟干細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到50ml離心管中，在1000rpm下離心3-8min，棄上清，用適量l-dmem培養(yǎng)基重懸腎臟干細(xì)胞，傳代比例為1:2，置于37℃、5%co2孵箱中培養(yǎng)；

步驟七：取出對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腎臟干細(xì)胞上清液，ps（磷脂酰絲氨酸）親和法，將ps與磁珠結(jié)合，利用親和原理捕獲外泌體囊泡外的ps；該方法與免疫磁珠法相似，獲得的外泌體形態(tài)完整，純度最高；由于不使用變性劑，不影響外泌體的生物活性，外泌體可用于細(xì)胞共培養(yǎng)和體內(nèi)注射，在-20℃下長(zhǎng)期保存。

本發(fā)明能克服現(xiàn)有技術(shù)的弊端。具有取材容易、少量組織即可獲取大量腎臟干細(xì)胞、適宜大規(guī)模培養(yǎng)、對(duì)機(jī)體損傷小等優(yōu)點(diǎn)，并且它取材來(lái)源廣泛，體內(nèi)儲(chǔ)備量大，適宜自體移植，它的培養(yǎng)過(guò)程較為簡(jiǎn)單，操作容易，適合在醫(yī)療業(yè)中腎病治療中使用。

對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實(shí)施例的細(xì)節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。因此，無(wú)論從哪一點(diǎn)來(lái)看，均應(yīng)將實(shí)施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求而不是上述說(shuō)明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。

此外，應(yīng)當(dāng)理解，雖然本說(shuō)明書(shū)按照實(shí)施方式加以描述，但并非每個(gè)實(shí)施方式僅包含一個(gè)獨(dú)立的技術(shù)方案，說(shuō)明書(shū)的這種敘述方式僅僅是為清楚起見(jiàn)，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)將說(shuō)明書(shū)作為一個(gè)整體，各實(shí)施例中的技術(shù)方案也可以經(jīng)適當(dāng)組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的其他實(shí)施方式。