本發(fā)明涉及包含小尺寸干細(xì)胞、具體而言為直徑為8μm以下的小干細(xì)胞或其培養(yǎng)液作為活性成分的美白用組合物、該組合物的制備方法及其用途；更具體地，本發(fā)明還涉及直徑為8μm以下的小尺寸干細(xì)胞所持有的極其顯著地減少黑色素的美白功能的用途。

背景技術(shù)：

人的皮膚顏色由黑色素在皮膚內(nèi)部的濃度和分布決定。除了遺傳因素之外，皮膚顏色還受環(huán)境或生理因素(如太陽紫外線、疲勞和壓力)的影響。黑色素是通過使酪氨酸(一種類型的氨基酸)經(jīng)酪氨酸酶的作用轉(zhuǎn)化為DOPA和多巴醌、然后通過進(jìn)行非酶氧化反應(yīng)而合成的。

當(dāng)黑色素超過必要地產(chǎn)生時(shí)，會(huì)出現(xiàn)色素沉著過度(如黃褐斑、雀斑和斑點(diǎn))，導(dǎo)致美學(xué)或健康方面的不良結(jié)果。另外，由于休閑人口的增加，喜歡戶外活動(dòng)的人數(shù)上升，因此對防止由紫外線引起的黑色素沉著的需求有所增長。通過抑制皮膚中的黑色素合成，皮膚色調(diào)變淺，從而可以實(shí)現(xiàn)皮膚美白；此外，可以減輕由紫外線、激素和遺傳因素誘導(dǎo)的皮膚色素沉著過度(如黃褐斑和雀斑)。

迄今為止，美白劑主要是通過發(fā)現(xiàn)通過抑制酪氨酸酶的活性來減少黑色素的量的材料而開發(fā)的，而酪氨酸酶在黑色素合成中起著最重要和最根本的作用。如此開發(fā)的美白材料的實(shí)例包括氫醌、硫醇、曲酸、熊果苷和維生素C等；然而，這些材料未顯示出令人滿意的美白效果，并且長期使用這些材料會(huì)誘發(fā)副作用(如過敏、吸收至皮膚內(nèi)、以及由于快速氧化而使顏色發(fā)生變化)，因此，尋找和開發(fā)材料來替代上述材料的嘗試是材料研究的關(guān)鍵部分。

作為所作努力的一部分，已經(jīng)對使用干細(xì)胞的化妝品組合物進(jìn)行了積極研究，韓國專利公布No.10-0848056(2009年7月23日)公開了一種通過使用來源于脂肪的間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)液來抑制黑色素合成的方法；韓國專利公布No.10-2009-0116659(2009年11月11日)公開了一種美白用化妝品組合物，該組合物包含來源于臍帶血的間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)液，然而，并未實(shí)現(xiàn)令人滿意的美白效果。

因此，本發(fā)明人通過研究出在培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞時(shí)通常存在各種尺寸的細(xì)胞，并隨后考慮到細(xì)胞尺寸影響的可能性，通過對來自各種組織的間充質(zhì)干細(xì)胞依據(jù)尺寸對黑色素量的減少的影響進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)直徑小于或等于一定尺寸的干細(xì)胞顯示極其顯著的美白效果，從而完成了本發(fā)明。

現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)

1.韓國專利公布No.10-0848056(2009年7月23日)

2.韓國專利公布No.10-2009-0116659(2009年11月11日)

非專利文獻(xiàn)

1.Kobayashi T，Urabe K，Winder A，Jimenez-Cervantes C，Imokawa G，Brewington T，Solano F，Garcia-Borron JC，and Hearing VJ.，Tyrosinase related protein 1(TRP1)functions as a DHICA oxidase in melanin biosynthesis.EMBO J.(1994)13，5818-5825

2.Levy Carmit，Khaled Mehdi，David E Fisher.，MITF：master regulator of melanocyte development and melanoma oncogene.，Trends Mol Med.(2006)12(9)，406-414

3.Barbara Bellei，Enrica Flori，Enzo Izzo，Vittoria Maresca，Mauro Picardo.，GSK3βinhibiton Promotes melanogenesis in B16 melanoma cells and normal human melanocytes.Cell.Signal.(2008)20，1750-1761

4.Barbara Bellei，Angela Pitisci，Caterina Catricala，Lionel Larue and Mauro Picardo.，Wnt/β-catenin signaling is stimulated by α-melanocyte-stimulating hormone in melanoma and melanocyte cells：implication in cell differentiation.，Pigment Cell Melanoma Res.(2010)24；309-325

5.Eun-Jung Lee，Yun Sang Lee，Soonho Hwang，Sanghee Kim，Jae Sung Hwang and Tae-Yoon Kim.，N-(3，5-Dimethylphenyl)-3-Methoxybenzamide(A3B5)Targets TRP-2 and Inhibits Melanogenesis and Melanoma Growth.，Journal of Investigative Dermatology(2011)131，1701-1709

在整個(gè)說明書中，參照了若干文獻(xiàn)和專利文件并示出了對它們的引用。通過引用的方式將所引用的文獻(xiàn)及專利文件的公開內(nèi)容整體并入本文，以更清楚地描述本發(fā)明的公開內(nèi)容以及本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的水平。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

技術(shù)問題

本發(fā)明使用使黑色素的量減少、具有極其顯著的美白功能的干細(xì)胞尺寸。

本發(fā)明的主要目的是提供美白用化妝品組合物，所述化妝品組合物包含直徑為8μm以下的小干細(xì)胞或其培養(yǎng)液作為活性成分。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供用于預(yù)防或治療色素沉著過度疾病的藥物組合物，所述藥物組合物包含直徑為8μm以下的小干細(xì)胞或其培養(yǎng)液作為活性成分。

技術(shù)方案

為了解決該問題，本發(fā)明提供了具有小直徑的干細(xì)胞的特定美白功能及其各種用途。

在具體實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了美白用化妝品組合物，所述化妝品組合物包含直徑為8μm以下的小干細(xì)胞或其培養(yǎng)液作為活性成分。

直徑為8μm以下的小干細(xì)胞或其培養(yǎng)液具有減少黑色素量的效力，這是因?yàn)橹睆綖?μm以下的小干細(xì)胞不僅抑制黑素細(xì)胞(產(chǎn)生黑色素的細(xì)胞)中的黑色素合成，從而降低黑色素的表達(dá)水平，并且還促進(jìn)合成的黑色素的降解。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，作為產(chǎn)生黑色素的細(xì)胞，使用Melan-a細(xì)胞或B16F1細(xì)胞。

直徑為8μm以下的小干細(xì)胞可以是選自于由以下細(xì)胞所組成的組中的任何一種或多種干細(xì)胞：胚胎干細(xì)胞以及來源于骨髓、臍帶血、脂肪組織(脂肪)、血液、肝臟、皮膚、胃、胎盤、神經(jīng)、腎上腺、上皮和子宮的人組織成體干細(xì)胞；優(yōu)選地，干細(xì)胞來源于骨髓、臍帶血或脂肪組織(脂肪)，更優(yōu)選為來源于臍帶血的成體干細(xì)胞；例如，干細(xì)胞最優(yōu)選為來源于臍帶血的間充質(zhì)干細(xì)胞。

對于培養(yǎng)液，可將任何適于動(dòng)物細(xì)胞生長的基礎(chǔ)培養(yǎng)基用作基礎(chǔ)培養(yǎng)基，基礎(chǔ)培養(yǎng)基的非限制性實(shí)例可包括最小必需培養(yǎng)基(MEM)、Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)、Roswell Park Memorial Institute培養(yǎng)基(RPMI)和角質(zhì)形成細(xì)胞無血清培養(yǎng)基(K-SFM)。最優(yōu)選地，使用α-最小必需培養(yǎng)基(α-MEM)。

在其它具體實(shí)施方式中，本發(fā)明可提供用于預(yù)防或治療色素沉著過度疾病的藥物組合物，所述藥物組合物包含直徑為8μm以下的小干細(xì)胞或其培養(yǎng)液作為活性成分。具體組成與上文所述的相同。

術(shù)語“色素沉著過度”是指由于黑色素的過度增加，某些部分相對于其它部分變黑或變暗，包括例如黃褐斑、雀斑、老年斑或太陽斑等。

因此，本發(fā)明基于“與混合有各種尺寸的干細(xì)胞的典型的(異質(zhì)的)情況的效果相比，直徑為8μm以下的小干細(xì)胞或其培養(yǎng)液對黑色素量的減少具有最優(yōu)異的效果”這一發(fā)現(xiàn)，提供了由直徑為8μm以下的小干細(xì)胞在抑制黑色素合成并促進(jìn)黑色素降解方面的優(yōu)異能力所誘導(dǎo)的顯著美白功能及其各種用途。

附圖說明

圖1顯示了用來源于各種組織的間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)液對通過α-MSH處理增加了黑色素合成能力的Melan-a細(xì)胞進(jìn)行處理后的黑色素量的測定結(jié)果。

圖2顯示了用來源于各種組織的間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)液對通過α-MSH處理增加了黑色素合成能力的B16F1細(xì)胞進(jìn)行處理后的黑色素量的測定結(jié)果。

圖3是顯示了來源于各種組織的間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)液包含各種尺寸的細(xì)胞的結(jié)果。

圖4顯示了細(xì)胞形態(tài)根據(jù)來源于各種組織的間充質(zhì)干細(xì)胞的尺寸而發(fā)生的變化。

圖5是顯示了根據(jù)尺寸對來源于臍帶血的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)后的培養(yǎng)液中所含的干細(xì)胞的尺寸分布的圖。

圖6是根據(jù)細(xì)胞尺寸對來源于各種組織的間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)液在黑色素量減少方面的效果進(jìn)行觀察而獲得的結(jié)果。

圖7是顯示了根據(jù)尺寸用來源于各種組織的間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)液處理Melan-a細(xì)胞時(shí)的黑色素量的變化程度的圖。

圖8是顯示了根據(jù)尺寸用來源于脂肪組織的間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)液處理Melan-a細(xì)胞時(shí)的黑色素量的變化程度的圖。

圖9是顯示了根據(jù)尺寸用來源于骨髓的間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)液處理Melan-a細(xì)胞時(shí)的黑色素量的變化程度的圖。

圖10是顯示了根據(jù)尺寸用來源于臍帶血的間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)液處理Melan-a細(xì)胞時(shí)的黑色素量的變化程度的圖。

圖11是顯示了根據(jù)尺寸用來源于臍帶血的間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)液處理后黑色素合成受到抑制和降解得以促進(jìn)的結(jié)果。

圖12顯示了通過使用Melan-a細(xì)胞鑒別的與黑色素量減少相關(guān)的分泌蛋白。

圖13是顯示了使用人造皮膚對由來源于臍帶血的間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)液引起的黑色素減少進(jìn)行研究的結(jié)果的圖像。

具體實(shí)施方式

本文使用的術(shù)語定義如下。

術(shù)語“干細(xì)胞”是指可以發(fā)育成任何組織的細(xì)胞。干細(xì)胞的基本特征為以下兩點(diǎn)：首先，細(xì)胞具有重復(fù)分裂以產(chǎn)生自身的自我更新能力；以及細(xì)胞具有能夠根據(jù)環(huán)境分化為具有特定功能的細(xì)胞的多能性。

術(shù)語“間充質(zhì)干細(xì)胞”是從人或哺乳動(dòng)物的組織分離的一類未分化成體干細(xì)胞，可來源于各種組織。在成體干細(xì)胞中，造血細(xì)胞以非貼附狀態(tài)存在，而間充質(zhì)干細(xì)胞主要是貼附細(xì)胞。特別地，所述細(xì)胞可以是臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞、臍帶血來源的間充質(zhì)干細(xì)胞、骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞、脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞、肌肉來源的間充質(zhì)干細(xì)胞、神經(jīng)來源的間充質(zhì)干細(xì)胞、皮膚來源的間充質(zhì)干細(xì)胞、羊膜來源的間充質(zhì)干細(xì)胞和胎盤來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，優(yōu)選臍帶血來源的間充質(zhì)干細(xì)胞。從每種組織分離干細(xì)胞的技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。

術(shù)語“干細(xì)胞的培養(yǎng)液”是指含有通過培養(yǎng)干細(xì)胞獲得的培養(yǎng)基中包含的成分的物質(zhì)，并且用于制備該培養(yǎng)液的干細(xì)胞類型不受限制。例如，用于制備該培養(yǎng)液的干細(xì)胞可以是胚胎干細(xì)胞或成體干細(xì)胞。此外，成體干細(xì)胞可以來源于所有類型組織的成體干細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，通過使用來源于臍帶血的成體干細(xì)胞來制備培養(yǎng)液。

術(shù)語“分化”是指這樣的現(xiàn)象：在細(xì)胞發(fā)生分裂和增殖以生長的期間，細(xì)胞的結(jié)構(gòu)或功能被特定，即形態(tài)或功能發(fā)生變化以發(fā)揮賦予有機(jī)體中每個(gè)細(xì)胞和組織等的作用。通常，該術(shù)語是指將相對簡單的系統(tǒng)劃分為在品質(zhì)上存在差異的兩個(gè)或更多個(gè)分系統(tǒng)的現(xiàn)象。

術(shù)語“培養(yǎng)基”是指用于細(xì)胞離體生長和增殖的混合物，所述培養(yǎng)基包含用于細(xì)胞生長和增殖所必需的因子，例如糖、氨基酸、各種營養(yǎng)物、血清、生長因子和礦物質(zhì)。特別地，本發(fā)明中的培養(yǎng)基是用于干細(xì)胞生長和增殖的培養(yǎng)基。

術(shù)語“基礎(chǔ)培養(yǎng)基(basal medium)”是指包含對于細(xì)胞存活而言必需的糖、氨基酸、水等，但不包含血清、營養(yǎng)物和各種生長因子的混合物。對于本發(fā)明的基礎(chǔ)培養(yǎng)基而言，可以使用人工合成制備的培養(yǎng)基，或者可以使用商業(yè)制備的培養(yǎng)基。商業(yè)制備的培養(yǎng)基的實(shí)例包括但不限于Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)、內(nèi)皮分化培養(yǎng)基(EDM)、最小必需培養(yǎng)基(MEM)、基礎(chǔ)培養(yǎng)基Eagle(BME)、RPMI 1640、F-10、F-12、α-最小必需培養(yǎng)基(α-MEM)、Glasgow最小必需培養(yǎng)基(G-MEM)和Iscove改良Dulbecco培養(yǎng)基。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，使用α-最小必需培養(yǎng)基(α-MEM)。

術(shù)語細(xì)胞的“增殖”或“生長”是指細(xì)胞產(chǎn)生分裂并且同質(zhì)的(homogenous)細(xì)胞發(fā)生擴(kuò)增，使得多細(xì)胞生物體體內(nèi)的細(xì)胞數(shù)目總體來說得以增加。當(dāng)細(xì)胞數(shù)量增加(擴(kuò)增)至一定水平時(shí)，性狀(trait)通常同時(shí)發(fā)生改變(分化)和調(diào)整。

術(shù)語“對照”細(xì)胞、組織、樣品或受試者是與測試細(xì)胞、組織、樣品或受試者類型相同的細(xì)胞、組織、樣品或受試者。

術(shù)語“美白”是指通過抑制黑素細(xì)胞(即決定皮膚顏色的細(xì)胞)的黑色素合成能力或降解所合成的黑色素來防止變黑中所涉及的因素。

術(shù)語“治療”是指獲得有利或期望的臨床結(jié)果的方法。為了本發(fā)明的目的，有利的或期望的臨床結(jié)果的非限制性實(shí)例包括癥狀的緩解、疾病程度的降低、疾病狀態(tài)的穩(wěn)定(即，未惡化)、延遲疾病進(jìn)展或減慢疾病進(jìn)展的速度、疾病狀態(tài)減輕、暫時(shí)性緩解和緩和(部分或整體)，不論是否檢測到疾病?！爸委煛笔侵钢委熜蕴幚砗皖A(yù)防(preventive/prophylaxis)方法這兩者。治療包括已經(jīng)發(fā)生的病癥以及待預(yù)防的病癥所需的治療?！熬徑狻奔膊∫馕吨c未進(jìn)行治療的情況相比，疾病狀態(tài)和/或不期望的臨床跡象的程度降低和/或進(jìn)展的時(shí)間過程被延遲或延長。

術(shù)語“有效量”是指導(dǎo)致有利或期望的臨床或生化結(jié)果的適當(dāng)量。有效量可以施用一次或多次。對于本發(fā)明的目的，抑制性化合物的有效量是暫時(shí)緩解、減輕、穩(wěn)定或回復(fù)疾病狀態(tài)、或推遲或延遲速率的適當(dāng)量。在受體動(dòng)物可以耐受組合物的施用或?qū)⒔M合物施用于動(dòng)物中是合適的這一情況下，該組合物是“藥學(xué)上或生理學(xué)上可接受的”。當(dāng)給藥劑量在生理學(xué)上有意義時(shí)，可提及制劑是以“治療有效量”給予的。在制劑的存在導(dǎo)致受體患者發(fā)生可檢測的變化的情況下，該制劑是生理學(xué)上有意義的。

術(shù)語“約”是指在提及量、水平、值、數(shù)字、頻率、百分比、維度、尺寸、數(shù)量、重量或長度時(shí)，在30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的程度內(nèi)變化的量、水平、值、數(shù)字、頻率、百分比、維度、尺寸、數(shù)量、重量或長度。

在整個(gè)說明書中，除非在上下文中另有說明，否則術(shù)語“包括/包含/含有”(comprise/comprising)應(yīng)當(dāng)被理解為包括建議的步驟或要素、或步驟或要素的組，但不排除任何其它步驟或要素、或步驟或要素的組。

在下文中，將更詳細(xì)地描述本發(fā)明。

本發(fā)明涉及具有小尺寸直徑的干細(xì)胞的特定美白功能的用途。

干細(xì)胞是具有自我復(fù)制能力并能夠分化成兩個(gè)或更多個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞；根據(jù)來源，可以使用胚胎干細(xì)胞或成體干細(xì)胞；在本發(fā)明中，可以優(yōu)選使用來源于各種組織來源的成體干細(xì)胞，例如來源于脂肪、子宮、骨髓、肌肉、胎盤、臍帶血或皮膚(上皮)的組織的干細(xì)胞。特別地，優(yōu)選使用間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)。MSC通常是促進(jìn)造血作用的支持細(xì)胞(基質(zhì))，并具有分化成各種中胚層細(xì)胞(包括骨、軟骨、脂肪細(xì)胞和肌肉細(xì)胞)的能力；此外，MSC可以容易地增殖，同時(shí)保持未分化狀態(tài)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，使用來源于脂肪組織(脂肪)、骨髓和臍帶血的MSC。

最優(yōu)選地，使用來源于臍帶血的MSC。

臍帶血是指分娩后臍帶中的血液，由于臍帶血含有產(chǎn)生白細(xì)胞、紅細(xì)胞和血小板的大量造血細(xì)胞和血管內(nèi)皮祖細(xì)胞，并且具有產(chǎn)生軟骨、骨、肌肉和神經(jīng)的MSC，所以臍帶血具有很高的醫(yī)療價(jià)值。臍帶血的特征在于：造血細(xì)胞以高于骨髓或外周血中造血細(xì)胞的濃度存在；細(xì)胞的成熟度低；并且增殖、自我復(fù)制和分化能力優(yōu)于在骨髓中發(fā)現(xiàn)的造血細(xì)胞。此外，臍帶血可以通過簡單的程序從待丟棄的臍帶獲得、并且就其數(shù)量而言包含許多造血細(xì)胞和干細(xì)胞，因此，本發(fā)明的優(yōu)選方面是使用從來源于人臍帶血的血液分離的MSC。

本發(fā)明所述的干細(xì)胞可以根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行增殖和培養(yǎng)。

可以開發(fā)合適的培養(yǎng)基用于培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞、特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，或可使用可以在實(shí)驗(yàn)室中用動(dòng)物細(xì)胞生長所需的合適成分制備的任何可用的培養(yǎng)基，所述成分例如合成代謝的碳、氮和/或微量營養(yǎng)素。

所述培養(yǎng)基是適合于動(dòng)物細(xì)胞生長的任何合適的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，作為非限制性實(shí)例，通常用于培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括最小必需培養(yǎng)基(MEM)、Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)、Roswell Park Memorial Institute培養(yǎng)基(RPMI)和角質(zhì)形成細(xì)胞無血清培養(yǎng)基(K-SFM)；除了上述培養(yǎng)基之外，可以不受限制地使用本領(lǐng)域中使用的任何培養(yǎng)基。優(yōu)選地，所述培養(yǎng)基可以選自由以下培養(yǎng)基所組成的組：α-MEM培養(yǎng)基(GIBCO)、K-SFM培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基(Welgene)、MCDB 131培養(yǎng)基(Welgene)、IMEM培養(yǎng)基(GIBCO)、DMEM/F12培養(yǎng)基、PCM培養(yǎng)基、M199/F12(混合物)(GIBCO)和MSC擴(kuò)增培養(yǎng)基(Chemicon)?？上蛩龌A(chǔ)培養(yǎng)基中加入微量營養(yǎng)素、氮和碳的合成代謝源(作為非限制性實(shí)例，可以添加血清源、生長因子、氨基酸、抗生素、維生素、還原劑和/或糖源)。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員顯然可以通過選擇或組合最適于來源于各種組織的干細(xì)胞的培養(yǎng)基，通過已知方法適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行培養(yǎng)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，使用α-MEM培養(yǎng)基、K-SFM培養(yǎng)基等。

另外，顯而易見的是，可以基于本領(lǐng)域的常識(shí)，通過適當(dāng)調(diào)節(jié)諸如培養(yǎng)環(huán)境、時(shí)間和溫度等條件來進(jìn)行培養(yǎng)。

在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，在α-MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)MSC，使得細(xì)胞擴(kuò)增至達(dá)到約80-90％的細(xì)胞匯合度，優(yōu)選約90％的匯合度；然后，例如，使用PBS洗滌細(xì)胞，并進(jìn)一步在K-SFM培養(yǎng)基中培養(yǎng)約20-25小時(shí)、優(yōu)選24小時(shí)。術(shù)語“匯合度(％)”在本領(lǐng)域中通常用于表示“每面積的細(xì)胞濃度(飽和度)”，并且是經(jīng)常由本領(lǐng)域技術(shù)人員在實(shí)驗(yàn)中使用的單位，來相對地表示在細(xì)胞培養(yǎng)中每單位面積的細(xì)胞數(shù)(細(xì)胞濃度)。本發(fā)明還包括用于制備8μm以下的小尺寸干細(xì)胞及其培養(yǎng)液的方法。

本發(fā)明還包括用胰蛋白酶對在本發(fā)明所述的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的干細(xì)胞進(jìn)行處理。當(dāng)用胰蛋白酶對培養(yǎng)的干細(xì)胞進(jìn)行處理時(shí)，可以獲得單細(xì)胞形式的干細(xì)胞；在這種情況下，進(jìn)行胰蛋白酶處理抑制了細(xì)胞之間的聚集，使得細(xì)胞具有單細(xì)胞形式，因此，可以使用任何能夠抑制細(xì)胞之間形成聚集的物質(zhì)作為替代品。

本發(fā)明涉及如上所述的干細(xì)胞中直徑為10μm以下、最優(yōu)選8μm以下的小尺寸干細(xì)胞所具有的特別優(yōu)異的美白功能的用途。

特別地，直徑為8μm以下的小尺寸干細(xì)胞的美白功能來自于抑制黑素細(xì)胞(即產(chǎn)生黑色素的細(xì)胞)中黑色素的表達(dá)水平、并促進(jìn)所合成的黑色素的降解，從而從總體上減少黑色素量的效果。

決定人類皮膚顏色的黑色素是由人體中激素平衡的不平衡狀態(tài)、壓力或暴露于紫外線(UV)誘導(dǎo)的。

黑色素主要在被稱為黑素細(xì)胞(存在于位于角質(zhì)層最低部分的基底層中的產(chǎn)生黑色素的細(xì)胞)的皮膚細(xì)胞中產(chǎn)生，并被轉(zhuǎn)運(yùn)到稱為角質(zhì)形成細(xì)胞的上皮細(xì)胞中。黑素細(xì)胞是位于眼睛中間層的葡萄膜中和皮膚表皮的基底層中的細(xì)胞，并通過稱為黑素生成的過程產(chǎn)生皮膚、眼睛和毛發(fā)中觀察到的色素中所包括的黑色素。通常，每1mm²皮膚中存在1000至2000個(gè)黑素細(xì)胞，黑素細(xì)胞占表皮底部表面的5％至10％。黑色素在該位置起重要作用，例如通過在核周圍形成帽狀結(jié)構(gòu)來保護(hù)基因免受UV影響以及通過除去自由基來保護(hù)細(xì)胞中的蛋白質(zhì)。生物體內(nèi)沒有用于降解黑色素的酶，僅僅當(dāng)角質(zhì)形成細(xì)胞從表皮剝離時(shí)，黑色素通過從皮膚上剝離而被除去。

然而，由于遺傳性原因或過繼性原因，產(chǎn)生黑色素的細(xì)胞有時(shí)異常存在于真皮中并導(dǎo)致黑色素過表達(dá)，其可誘導(dǎo)諸如太田痣(ota’s nevus)等癥狀。當(dāng)產(chǎn)生的黑色素超過必要時(shí)，引起色素沉著過度，例如黃褐斑、雀斑和斑點(diǎn)，并且導(dǎo)致美學(xué)上不良的效果。因此，使黑色素合成和表達(dá)正常化或?qū)ζ溥M(jìn)行調(diào)節(jié)是非常重要的，并且可以非常有用地加以利用。

本發(fā)明的直徑為8μm以下的小干細(xì)胞或其培養(yǎng)液的特征主要在于，與存在各種尺寸的干細(xì)胞的典型情況(異質(zhì)性)相比，顯示出顯著的美白效果，這是因?yàn)楸景l(fā)明的干細(xì)胞或其培養(yǎng)液具有優(yōu)異的抑制黑色素合成和促進(jìn)黑色素降解的能力。

本發(fā)明的直徑為8μm以下的小干細(xì)胞通過抑制作為黑色素合成的關(guān)鍵酶的酪氨酸酶的表達(dá)和活性(即，通過參與抑制黑色素生成機(jī)制)而具有優(yōu)異的抑制黑色素合成的能力。已經(jīng)知道干細(xì)胞具有抑制酪氨酸酶活性的能力，然而，尚不知道小尺寸干細(xì)胞具有如此優(yōu)異的能力。

此外，本發(fā)明的直徑為8μm以下的小干細(xì)胞的特征在于參與促進(jìn)已經(jīng)合成的黑色素的降解。

關(guān)于黑色素量的減少，通常已知的由干細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)包括TGF-β2、TNF-α、IFN-γ、ERK-1、ERK-2、酪氨酸酶、IL-1、2、3、4、5、6、10、17、EGF-R、G-CSF、GM-CSF和TRP-1等；然而，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)直徑為8μm以下的小干細(xì)胞進(jìn)一步分泌諸如CD32/Fcg受體II、孕酮受體、鐵蛋白、抗增殖蛋白(prohibitin)、層粘連蛋白B1、血小板反應(yīng)蛋白和C-ERB-4/HER-4等蛋白質(zhì)。已經(jīng)認(rèn)為，從小尺寸干細(xì)胞分泌的這些蛋白質(zhì)導(dǎo)致更優(yōu)異的抑制黑色素合成和促進(jìn)黑色素降解的能力。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，用α-黑素細(xì)胞刺激激素(α-MSH)對用作產(chǎn)生黑色素的細(xì)胞的Melan-a細(xì)胞和B16F1細(xì)胞進(jìn)行處理以誘導(dǎo)黑色素表達(dá)；此外，將來源于各種組織的MSC按尺寸劃分，隨后對其減少黑色素量的效果進(jìn)行觀察。然后，將該效果與已知作為減少黑色素量的最具代表性的物質(zhì)的RSV(白藜蘆醇的抗黑素生成活性，抗黑素生成劑)的效果進(jìn)行比較。

如通常已知的，當(dāng)培養(yǎng)MSC時(shí)，具有各種尺寸的干細(xì)胞共存；當(dāng)提取直徑為8μm以下的小細(xì)胞并培養(yǎng)所得物時(shí)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過抑制酪氨酸酶活性和促進(jìn)自噬，顯示了最顯著的減少黑色素量的效果；同時(shí)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)20μm以上的大尺寸MSC不影響黑色素量的減少。

也就是說，與典型的混合有各種尺寸干細(xì)胞的異質(zhì)性干細(xì)胞培養(yǎng)液以及已知具有優(yōu)異的黑色素減少作用的RSV相比，本發(fā)明的直徑為8μm以下的小干細(xì)胞或其培養(yǎng)液顯示出顯著不同的黑色素量減少程度。

關(guān)于減少黑色素的效果，干細(xì)胞的“尺寸”是最重要的因素，無論干細(xì)胞來源的組織類型(例如脂肪組織、骨髓或臍帶血)如何，直徑為8μm以下的小尺寸干細(xì)胞保持優(yōu)異的黑色素減少效果，特別地，優(yōu)選使用來源于臍帶血的干細(xì)胞。也就是說，在包含來源于臍帶血的直徑為8μm以下的小MSC或其培養(yǎng)液的情況下，抑制黑色素合成和促進(jìn)黑色素降解的能力最為優(yōu)異。

因此，一方面，本發(fā)明涉及包含直徑為8μm以下的小干細(xì)胞或其培養(yǎng)液作為活性成分的美白用化妝品組合物以及制備該組合物的方法。

“化妝品組合物”是包含直徑為8μm以下的小干細(xì)胞的培養(yǎng)液的組合物；作為該組合物的制劑，可使用任何制劑。

可將本發(fā)明的化妝品組合物制備為本領(lǐng)域通常使用的任何制劑，例如，可將組合物配制成溶液劑、混懸劑、乳劑、糊劑、凝膠劑、霜?jiǎng)?、洗劑、粉末劑、皂、含表面活性劑的清潔劑、油、粉狀粉底、乳劑粉底、蠟狀粉底和噴霧劑等形式，但不限于此。更具體地，可將組合物制備為軟化化妝水、營養(yǎng)化妝水、營養(yǎng)霜、按摩霜、精華液、眼霜、清潔霜、清潔泡沫、清潔水、面膜(pack)、噴霧劑或粉末劑的制劑。

在本發(fā)明的制劑是糊劑、霜?jiǎng)┗蚰z劑的情況下，可將動(dòng)物油、植物油、蠟、石蠟、淀粉、黃蓍膠、纖維素衍生物、聚乙二醇、硅氧烷(silicone)、膨潤土、二氧化硅、滑石或氧化鋅等用作載體成分。在本發(fā)明的制劑是粉末劑或噴霧劑的情況下，可將乳糖、滑石、二氧化硅、氫氧化鋁、硅酸鈣或聚酰胺粉末用作載體成分；特別地，對于噴霧劑，可以另外包含推進(jìn)劑，例如氯氟烴、丙烷/丁烷或二甲醚。在本發(fā)明的制劑是溶液劑或乳劑的情況下，將溶劑、增溶劑或乳化劑(例如水、乙醇、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、芐醇、苯甲酸芐酯、丙二醇、1,3-丁二醇油、甘油脂肪族酯、聚乙二醇或脫水山梨糖醇的脂肪酸酯)用作載體成分。在本發(fā)明的制劑是混懸劑的情況下，可將液相稀釋劑(如水、乙醇或丙二醇)、懸浮劑(如乙氧基化異硬脂醇、聚氧乙烯山梨糖醇酯和聚氧乙烯脫水山梨糖醇酯)、微晶纖維素、偏氫氧化鋁、膨潤土、瓊脂或黃蓍膠用作載體成分。在本發(fā)明的制劑是含表面活性劑的清潔劑的情況下，可將脂肪醇硫酸酯、脂肪醇醚硫酸酯、磺基琥珀酸酯單酯、羥乙基磺酸酯、咪唑鎓鹽衍生物(imidazolium derivative)、?；撬峒柞?、肌氨酸酯、脂肪酸酰胺醚硫酸酯、烷基酰胺甜菜堿、脂肪醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物油、羊毛脂衍生物或乙氧基化甘油脂肪酸酯等用作載體成分。

對于包含在本發(fā)明的化妝品組合物中的成分，除了活性成分之外，還可以包含通常在化妝品組合物中使用的成分，例如，可以包含抗氧化劑、穩(wěn)定劑、增溶劑、維生素、染料和芳香劑等常規(guī)助劑和載體。

化妝品組合物的制備可以通過任何通常使用的方法進(jìn)行。

此外，本發(fā)明提供了一種化妝方法，其特征在于，將包含本發(fā)明的直徑為8μm以下的小干細(xì)胞或其培養(yǎng)液的化妝品組合物施用于人皮膚。

本發(fā)明的化妝方法是指將本發(fā)明的化妝品組合物施用于人皮膚的所有化妝方法。換句話說，本領(lǐng)域已知的將化妝品組合物施用到皮膚上的所有方法都包括在本發(fā)明的化妝方法中。本發(fā)明的化妝品組合物可以單獨(dú)或疊加施用，或者與除本發(fā)明以外的其它化妝品組合物共同施用。此外，根據(jù)本發(fā)明的具有優(yōu)異皮膚保護(hù)效果的化妝品組合物可以根據(jù)常規(guī)使用方法使用，并且施用次數(shù)可以根據(jù)使用者的皮膚狀態(tài)或喜好而不同。

在本發(fā)明的化妝品組合物處于皂、含表面活性劑的清潔劑或不含表面活性劑的清潔劑的制劑形式的情況下，組合物可以在施用至皮膚之后被擦除、剝離或用水洗去。在具體實(shí)例中，皂是液體皂、粉末皂、固體皂或油皂；含表面活性劑的清潔制劑是清潔泡沫、清潔水、清潔巾或清潔面膜；并且不含表面活性劑的清潔制劑可以是清潔霜、清潔洗劑、清潔水或清潔凝膠，但不限于此。

在本發(fā)明的另一方面，提供了用于治療或預(yù)防色素沉著過度疾病的藥物組合物，所述藥物組合物包含直徑為8μm以下的小干細(xì)胞或其培養(yǎng)液作為活性成分。

術(shù)語“色素沉著過度”是指由于黑色素的過度增加，皮膚或指甲的某一部分相比其它部分變得更黑或更暗。優(yōu)選地，由色素沉著過度引起的疾病包括但不限于黃褐斑、斑點(diǎn)、老年斑或太陽斑。

包含在本發(fā)明的藥物組合物中的藥學(xué)上可接受的載體是通常在制備過程中使用的載體，包括但不限于乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯膠、磷酸鈣、藻酸鹽、明膠、硅酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、糖漿、甲基纖維素、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂和礦物油等。除了上述成分之外，本發(fā)明的藥物組合物還可以包含潤滑劑、潤濕劑、甜味劑、芳香劑、乳化劑、懸浮劑和防腐劑等。

本發(fā)明的藥物組合物可以口服給藥或胃腸外給藥，對于胃腸外給藥，可通過靜脈內(nèi)輸注、皮下輸注、肌內(nèi)輸注、腹膜內(nèi)輸注和經(jīng)皮給藥進(jìn)行給藥。優(yōu)選根據(jù)待應(yīng)用的疾病種類來決定本發(fā)明的藥物組合物的給藥途徑。例如，由于本發(fā)明的藥物組合物用于治療由黑色素沉著過度引起的皮膚疾病，因此該組合物最優(yōu)選以局部施用方法施用至皮膚中。

在另一個(gè)具體實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了制備藥物組合物和化妝品組合物的方法，該方法包括對直徑為8μm以下的小干細(xì)胞進(jìn)行分離。對于組合物的制備，可以使用任何通常使用的方法；此外，分出(isolating)、培養(yǎng)和分離(separating)直徑為8μm以下的小干細(xì)胞的過程不限于本發(fā)明的方法，而是可以通過使用本領(lǐng)域通常使用的方法來進(jìn)行。

如上所述，根據(jù)本發(fā)明的直徑為8μm以下的小干細(xì)胞或其培養(yǎng)液可以有用地用作開發(fā)用于治療和預(yù)防皮膚色素沉著的功能性化妝品和藥品(衛(wèi)生輔助)的原料。

在本說明書中，雖然對美白用功能性化妝品組合物和用于治療色素沉著過度疾病的藥物組合物進(jìn)行了重點(diǎn)描述，然而，對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員來說顯而易見的是，本發(fā)明可以作為具有美白效果的各種形式的組合物及其使用方法而用于各種應(yīng)用，所述組合物包含直徑為8μm以下的小干細(xì)胞或其培養(yǎng)液作為活性成分。

實(shí)施例

在下文中，將參考實(shí)施例更詳細(xì)地描述本發(fā)明。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯而易見的是，對這些實(shí)施例進(jìn)行描述僅是用于說明本發(fā)明，并且應(yīng)當(dāng)理解的是，本發(fā)明的范圍不限于這些實(shí)施例。

材料和方法

在本發(fā)明中，使用Medipost.Co.(韓國)提供的來源于人臍帶血的間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)?？梢酝ㄟ^收集臍帶血并從臍帶血分離和培養(yǎng)MSC的步驟獲得該細(xì)胞；下面更詳細(xì)地對每個(gè)步驟進(jìn)行描述。

在收集臍帶血的步驟中，對于正常的陰道分娩，在分娩嬰兒后胎盤仍然留在子宮中時(shí)從排出的臍靜脈收集臍帶血；或者對于剖宮產(chǎn)，在分娩嬰兒后胎盤也被排出至子宮外部時(shí)從被排出至子宮外部的臍靜脈收集臍帶血。

在本發(fā)明中，為了從分娩后排出到子宮外部的臍靜脈收集臍帶血，在分娩嬰兒后通過無菌操作方法從連接胎盤和胎兒的臍靜脈收集臍帶血。在固定臍靜脈后，通過使用收集針將臍帶血收集于含有抗凝血?jiǎng)┑哪殠а占?小袋)中。

作為從所收集的臍帶血中分離并培養(yǎng)MSC的方法，可以使用包括韓國注冊專利No.10-0494265中公開的方法在內(nèi)的所有常用方法(Pittinger MF，Mackay AM等，Science，284：143-7,1999；Lazarus HM，Haynesworth SE等，Bone Marrow Transplant，16：557-64,1995)。該方法的示例如下。

通過對收集的臍帶血進(jìn)行離心以分離單核細(xì)胞，然后將所得物洗滌數(shù)次以除去雜質(zhì)。洗滌后，將單核細(xì)胞以合適的密度接種在培養(yǎng)容器上并培養(yǎng)，然后，細(xì)胞增殖形成單層，其中，MSC是通過相差顯微鏡觀察時(shí)具有同質(zhì)性形狀的細(xì)胞，并且以具有紡錘形狀的長細(xì)胞的集落形式增殖。此后，當(dāng)細(xì)胞增殖達(dá)到匯合狀態(tài)時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)以使細(xì)胞增殖至獲得所需數(shù)量的細(xì)胞。

1.產(chǎn)生黑色素的細(xì)胞和干細(xì)胞的培養(yǎng)(黑素細(xì)胞和MSC的培養(yǎng))

B16F1小鼠黑素瘤細(xì)胞系購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，Manassas，VA，USA)，Melan-a黑素細(xì)胞由Dorothy C.Bennett博士提供(St.George's Hospital Medical School，Lodon，UK)。

在37℃下、在5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)B16F1細(xì)胞，作為培養(yǎng)基，使用含有10％胎牛血清(FBS，Invitrogen，Calsbd，CA)和青霉素/鏈霉素(P/S)的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM，Hyclone，Thermoscientific，Logan，UT)。在含有10％FBS、1％P/S和200mM佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA，Sigma，St.Louis，MO)的RPMI 1640培養(yǎng)基(Hyclone)中培養(yǎng)Melan-a細(xì)胞。

此外，在含有10％FBS和1％P/S的α-MEM(GIBCO)中培養(yǎng)在Medipost.Co.(韓國)培養(yǎng)并儲(chǔ)存的來源于臍帶血的間充質(zhì)干細(xì)胞(hUCB-MSC)、來源于骨髓的MSC(BM-MSC)和來源于脂肪的MSC(Adipo-MSC)。

2.樣品組培養(yǎng)液(條件培養(yǎng)液(conditioned media))的制備

由hUCB-MSC、BM-MSC和Adipo-MSC制備樣品組培養(yǎng)液(條件培養(yǎng)液)。

將處于儲(chǔ)存狀態(tài)的細(xì)胞(儲(chǔ)存在LN2槽中)解凍并在37℃下、在5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在含有2％FBS的α-MEM(GIBCO)中培養(yǎng)細(xì)胞，直至細(xì)胞匯合達(dá)到約90％。

然后，用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌細(xì)胞三次，并在不含酚紅的角質(zhì)形成細(xì)胞無血清培養(yǎng)基(K-SFM)中培養(yǎng)24小時(shí)，此后，采收培養(yǎng)液，該過程重復(fù)進(jìn)行3天。然后，將各采收的培養(yǎng)液過濾(Top Filer System，Nunc)，然后在冷藏或冷凍保存后使用所得物。

3.按尺寸制備干細(xì)胞的培養(yǎng)液

如下所述按尺寸進(jìn)行干細(xì)胞的培養(yǎng)液的制備。

將處于儲(chǔ)存狀態(tài)的細(xì)胞(儲(chǔ)存在LN2槽中)解凍并在37℃條件下在5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

在37℃條件下在5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞，將處于儲(chǔ)存狀態(tài)的細(xì)胞(儲(chǔ)存在LN2槽中)解凍和培養(yǎng)后，通過使用8μm和20μm膜過濾器分離并收集小尺寸干細(xì)胞。在該過程中，通過連續(xù)使用20μm膜過濾器并隨后使用8μm膜過濾器獲得直徑為8-20μm的細(xì)胞。

在含有10％FBS的α-MEM(GIBCO)培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，直至細(xì)胞匯合達(dá)到約70％，然后，用PBS洗滌3次。然后，將細(xì)胞在不含酚紅的角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基(K-SFM)中培養(yǎng)24小時(shí)，此后，采收培養(yǎng)液，該過程重復(fù)進(jìn)行3天。過濾采收的培養(yǎng)液(Top Filer System，Nunc)，然后在冷藏或冷凍保存后使用所得物。

4.用于黑色素表達(dá)的處理試劑

為了激活黑色素表達(dá)，用α-黑素細(xì)胞刺激激素(α-MSH，St.Louis，MO，USA)以1μM的濃度對B16F1小鼠黑素瘤細(xì)胞系和Melan-α黑素細(xì)胞進(jìn)行處理。

此外，為了制備比較對照以對黑色素合成的減少程度進(jìn)行比較，使用已知作為減少黑色素量最具代表性的物質(zhì)RSV(白藜蘆醇的抗黑素生成活性，抗黑素生成劑，Sigma，St.Louis，MO，USA)以50μM的濃度進(jìn)行處理。

5.黑色素測定

B16F1黑素瘤細(xì)胞、Melan-a細(xì)胞均從儲(chǔ)存狀態(tài)解凍并開始培養(yǎng)。24小時(shí)后，進(jìn)行24小時(shí)的α-MSH處理；作為減少黑色素合成的效果的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)，使用RSV；為了進(jìn)行比較，將每種培養(yǎng)液處理24小時(shí)。

然后，通過胰蛋白酶處理從細(xì)胞培養(yǎng)板分離和收集細(xì)胞，并通過使用1N NaOH溶解于10％DMSO中的緩沖液在100℃下分離細(xì)胞中的黑色素，持續(xù)30分鐘。

在黑色素分離后，使用ELISA板讀數(shù)器(Victor X3，Perkin Elmer，Waltham，MA，USA)在415nm處測量黑色素量。

6.對取決于干細(xì)胞的來源或尺寸的抑制黑色素合成并促進(jìn)降解的能力進(jìn)行的研究

本發(fā)明人試圖以8μm、8-20μm和20μm的尺寸對來源于骨髓、脂肪組織(脂肪)和臍帶血的MSC進(jìn)行分離，然后嘗試對培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)液使得合成的黑色素量減少的機(jī)制進(jìn)行研究。

6-1黑色素合成抑制實(shí)驗(yàn)

用根據(jù)尺寸劃分的來源于臍帶血的MSC的培養(yǎng)液對用α-MSH處理的黑素細(xì)胞進(jìn)行處理，然后從黑素細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)。

在蛋白質(zhì)樣品緩沖液(62.5mM Tris-HCl，pH 6.8，25％甘油，2％SDS，5％β-巰基乙醇，0.01％溴酚藍(lán))(BioRad，Hercules，CA)中制備每種條件的所有蛋白質(zhì)提取物。然后，用SDS-PAGE對每個(gè)樣品進(jìn)行電泳，并將所得物轉(zhuǎn)移至PVDF膜(BioRad)；此后，使所得物與抗酪氨酸酶抗體(由V.J.Hearing(NIH，Bethesda，MD)提供)在4℃下反應(yīng)過夜。

對于蛋白質(zhì)檢測，使PVDF膜與HRP綴合的二抗(Pierce，Rockford，IL)反應(yīng)，然后通過使用AE-9300Ez-Capture MG Hours Image Saver HR圖像捕獲工具(ATTO，Tokyo，Japan)來研究酪氨酸酶活性。

6-2黑色素降解促進(jìn)實(shí)驗(yàn)

為了研究來源于臍帶血的MSC的培養(yǎng)液是否促進(jìn)通過α-MSH處理而合成的黑色素的降解，對取決于根據(jù)細(xì)胞尺寸劃分的培養(yǎng)液所進(jìn)行的處理的黑素細(xì)胞的自噬現(xiàn)象進(jìn)行了研究。

對于該實(shí)驗(yàn)，通過lipofectamin 2000用pEGFP-LC3載體轉(zhuǎn)染B16F1細(xì)胞，并用G418(1mg/ml)處理7天。將單細(xì)胞滴入96孔板后，對顯示熒光的存活克隆進(jìn)行擴(kuò)增以制備細(xì)胞系，然后使用熒光顯微鏡(IX71，Olympus，Japan)對細(xì)胞進(jìn)行研究。

對于自噬現(xiàn)象，發(fā)生了從GFP-LC3I到GFP-LC3II的轉(zhuǎn)變，當(dāng)發(fā)生向GFP-LC3II的轉(zhuǎn)變時(shí)，可以通過靶向自噬體的點(diǎn)狀GFP-LC3來鑒定GFP-LC3II。為了對自噬現(xiàn)象進(jìn)行研究，在通過顯微鏡觀察的100個(gè)細(xì)胞中，計(jì)數(shù)并測量顯示GFP-LC3點(diǎn)狀的細(xì)胞。作為陽性對照，使用50μM自噬誘導(dǎo)劑RSV(白藜蘆醇)(Sigma，St.Louis，MO)，即抗黑素生成劑。

7.生長因子測定

對于每種MSC，通過使用1％蛋白酶抑制劑混合物(Sigma，St.Louis，Mo)、1％磷酸酶抑制劑混合物(Sigma，St.Louis，Mo)和裂解珠(Fullmoon biosystems，Sunnyvale，CA)來提取蛋白質(zhì)；通過使用抗體陣列分析試劑盒(Fullmoon biosystems，Sunnyvale，CA)來純化出純蛋白。對于蛋白質(zhì)測定，使用微陣列載玻片(Fullmoon biosystems，Sunnyvale，CA)來測量表達(dá)，并使用GenePix 4000B掃描儀(Axon Instrument，USA)、Genowiz4.0^TM(Ocimum Biosolutions，India)和UniProt DB對結(jié)果進(jìn)行分析。

8.3D人造皮膚實(shí)驗(yàn)方法

在對干細(xì)胞培養(yǎng)液在細(xì)胞水平上減少黑色素量的能力進(jìn)行研究后，本發(fā)明人通過使用人造皮膚進(jìn)一步研究了黑色素量的減少。

作為3D人造皮膚，使用MEL-300-B-MelanoDerm組織(MatTek Co.Kr)，在37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱條件下使用EPI-100-LLMM-NMM-NMM-133培養(yǎng)該皮膚。使用作為陰性對照的DW和作為陽性對照的2％曲酸對該皮膚進(jìn)行處理后，用對按尺寸分離的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)而得的每種培養(yǎng)液(條件培養(yǎng)液，CM)對皮膚進(jìn)行處理，用于對比實(shí)驗(yàn)。通過顯微鏡對黑素細(xì)胞的黑色素表達(dá)程度進(jìn)行觀察。

實(shí)施例1：Melan-a黑素細(xì)胞中黑色素量的降低效果

Melan-a細(xì)胞在培養(yǎng)期間產(chǎn)生黑色素，并且當(dāng)黑色素合成被激活時(shí)顯示黑色。當(dāng)細(xì)胞存儲(chǔ)數(shù)即細(xì)胞傳代數(shù)高時(shí)，通過α-MSH處理增加Melan-a細(xì)胞中的黑色素合成。

本發(fā)明人建立了一種系統(tǒng)，其中，通過在1μMα-MSH處理下培養(yǎng)Melan-a細(xì)胞24小時(shí)將黑色素合成能力增加兩倍，并通過用50μM已知為黑色素合成抑制劑和黑色素量減少劑的RSV處理細(xì)胞使黑素細(xì)胞中的黑色素量減少一半。目前為止，在已知抑制黑色素合成和減少黑色素量的物質(zhì)中，已知RSV是最有效的物質(zhì)。

此外，本發(fā)明人通過用含有hUCB-MSC、BM-MSC和Adipo-MSC的培養(yǎng)液處理Melan-a細(xì)胞24小時(shí)來測量黑色素量的變化。

結(jié)果示于圖1中。該結(jié)果由3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)獲得。

如圖1所示，當(dāng)將通過α-MSH處理誘導(dǎo)黑色素合成的對照中的黑色素表達(dá)水平認(rèn)定為是200％的標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，用來源于BM-MSC和Adipo-MSC的培養(yǎng)液處理的情況下的黑色素合成水平為180％，因此黑色素量減少不多。

然而，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，基于α-MSH處理的對照中的黑色素合成水平，來源于hUCB-MSC的培養(yǎng)液使黑色素量相比RSV降低了約2倍、相比對照降低了約4倍。

換句話說，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，對于未根據(jù)細(xì)胞尺寸進(jìn)行分離而混合有各種尺寸的細(xì)胞的典型細(xì)胞培養(yǎng)物的情況，在來源于各種組織來源的干細(xì)胞中，來源于臍帶血的MSC顯示出優(yōu)異的減少黑色素量的能力。

實(shí)施例2：B16F1細(xì)胞中黑色素量的降低效果

此外，本發(fā)明人通過與實(shí)施例1相同的方法在B16F1細(xì)胞中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果示于圖2中。

結(jié)果，當(dāng)將通過α-MSH處理B16F1細(xì)胞誘導(dǎo)黑色素合成后測量的黑色素量認(rèn)定為是200％的標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，黑色素量測量如下：對于RSV處理為120％；對于BM-MSC培養(yǎng)液為180％；對于Adipo-MSC培養(yǎng)液為200％。即，對于來源于骨髓和脂肪組織(脂肪)的MSC的培養(yǎng)液，并無減少黑色素量的效果。

然而，與實(shí)施例1所示相同，對于UCB-MSC培養(yǎng)液處理，觀察到黑色素量為110％；作為上述觀察的結(jié)果，還發(fā)現(xiàn)相比已知為黑色素合成的優(yōu)異抑制物質(zhì)的RSV，UCB-MSC培養(yǎng)液能夠更有效地減少黑色素量。

實(shí)施例3：細(xì)胞尺寸分布和生長模式的研究

對來源于各種組織，即來源于脂肪、骨髓和臍帶血的MSC培養(yǎng)，本發(fā)明人試圖對生長的MSC的尺寸分布進(jìn)行了研究。

結(jié)果，如圖3所示，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，各種尺寸的MSC基本上共同存在于各種組織來源的MSC的培養(yǎng)液中。特別地，在來源于臍帶血的MSC中，當(dāng)細(xì)胞通過細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增時(shí)，細(xì)胞尺寸比從儲(chǔ)存狀態(tài)解凍后立即分析的細(xì)胞更加多樣。除了來源于臍帶血的MSC之外，這些結(jié)果還顯示在來源于骨髓和脂肪的MSC中。

此外，本發(fā)明人觀察到細(xì)胞形態(tài)的變化取決于各種組織來源的MSC的尺寸，結(jié)果示于圖4中。

因此，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，與組織來源無關(guān)，與異質(zhì)性細(xì)胞相比，小尺寸干細(xì)胞在細(xì)胞形態(tài)學(xué)上顯示出較小的變化。

實(shí)施例4：根據(jù)細(xì)胞尺寸分離、培養(yǎng)的細(xì)胞分布的觀察

為了對按直徑分離的干細(xì)胞在培養(yǎng)后是否變回至各種尺寸的細(xì)胞群(即，異質(zhì)性群)進(jìn)行觀察，對在細(xì)胞分離后培養(yǎng)6-7天的MSC的尺寸分布進(jìn)行再次研究。結(jié)果示于圖5中。

圖5A顯示出培養(yǎng)異質(zhì)性細(xì)胞后培養(yǎng)液中包含的干細(xì)胞的尺寸分布；圖5B顯示出在分離和培養(yǎng)直徑為8μm以下的細(xì)胞后的細(xì)胞尺寸分布；圖5C顯示出在分離和培養(yǎng)直徑為8-20μm的細(xì)胞后的細(xì)胞尺寸分布；圖5D顯示出在分離和培養(yǎng)直徑為20μm以上的細(xì)胞后的細(xì)胞尺寸分布。

作為按直徑分離MSC并培養(yǎng)后對細(xì)胞尺寸進(jìn)行分析的結(jié)果，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞沒有變回至各種尺寸的細(xì)胞群(即，異質(zhì)性群)，并且仍僅存在相似尺寸的細(xì)胞。

實(shí)施例5：取決于干細(xì)胞尺寸的黑色素量減少效果

如上所述，按尺寸分離細(xì)胞，然后制備培養(yǎng)液(條件培養(yǎng)液)，用該培養(yǎng)液對已用α-MSH處理以刺激黑色素合成的Melan-a細(xì)胞進(jìn)行處理，并觀察對減少黑色素量的影響。

結(jié)果按各種組織來源示于圖6和圖7中。

首先，以裸眼對按8μm以下、8-20μm和20μm以上的細(xì)胞尺寸劃分的來源于脂肪、骨髓和臍帶血的MSC的培養(yǎng)液的減少黑色素量的效果進(jìn)行觀察，結(jié)果，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，對于8μm以下的小細(xì)胞的培養(yǎng)液，黑色素減少效果增加并且顏色變淺(圖6)。

更具體地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，與用(異質(zhì)性)培養(yǎng)液(其中，干細(xì)胞不經(jīng)尺寸分離培養(yǎng)，即，具有各種尺寸細(xì)胞的干細(xì)胞的培養(yǎng)液)進(jìn)行處理的Melan-a細(xì)胞相比，用直徑為8μm以下的小尺寸細(xì)胞的培養(yǎng)液進(jìn)行處理的黑色素量減少效果增加了約12％(圖7)。

然而，當(dāng)用直徑為20μm以上的大尺寸細(xì)胞的培養(yǎng)液處理Melan-a細(xì)胞時(shí)，與對照沒有顯著差異。這些結(jié)果意味著，具有20μm以上的大尺寸的MSC不顯著影響黑色素量的減少。

此外，與異質(zhì)性群對照相比，直徑為8-20μm的MSC的培養(yǎng)液不顯示顯著的黑色素減少效果(參見圖8-圖10中的p值)。

實(shí)施例6：取決于不同組織來源的MSC的黑色素量減少效果

為了對除了MSC的尺寸之外，組織來源的類型是否也影響黑色素減少能力進(jìn)行研究，本發(fā)明人按尺寸對來源于脂肪、骨髓和臍帶血的MSC進(jìn)行了分離，并對各自的黑色素量減少效果進(jìn)行了測量。

結(jié)果示于圖7-圖10中，來源于脂肪、骨髓和臍帶血的MSC的結(jié)果顯示在圖8-圖10中的單獨(dú)的圖中。

與其它成體干細(xì)胞(例如，脂肪組織、骨髓)的培養(yǎng)液相比，來源于臍帶血的MSC的培養(yǎng)液顯示出優(yōu)異的黑色素量減少效果(圖10)。特別地，來源于臍帶血的MSC的培養(yǎng)液顯示出的黑色素量減少效果是50μM RSV(已知其具有優(yōu)異的黑色素量減少效果)處理的黑色素量減少效果的兩倍。

用來源于骨髓和脂肪的MSC的培養(yǎng)液進(jìn)行相同的實(shí)驗(yàn)(圖8和圖9)，結(jié)果，盡管不如來源于臍帶血的MSC的培養(yǎng)液的黑色素量減少效果(圖10)，但是與異質(zhì)性干細(xì)胞對照相比，8μm以下的細(xì)胞的培養(yǎng)液的處理減少黑色素量的效果相對增加了10％；因此，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，與干細(xì)胞的組織來源類型相比，干細(xì)胞的“尺寸”是美白效果的更重要的決定因素。

實(shí)施例7：抑制黑色素合成和促進(jìn)降解的能力的研究

通過使用本發(fā)明的來源于臍帶血的MSC的培養(yǎng)液，通過酪氨酸酶的western印跡分析對黑色素合成抑制能力進(jìn)行了研究，并通過自噬分析對黑色素降解促進(jìn)能力進(jìn)行了研究，結(jié)果示于圖11中。

如圖11A所示，當(dāng)用來源于臍帶血的MSC的培養(yǎng)液、特別是8μm以下的細(xì)胞的培養(yǎng)液進(jìn)行處理時(shí)，觀察到與陽性對照(即，RSV處理組)的情況相同，黑素細(xì)胞的酪氨酸酶活性受到抑制。

此外，如圖11B所示，當(dāng)用來源于臍帶血的MSC的培養(yǎng)液進(jìn)行處理時(shí)，黑素細(xì)胞的自噬活性顯著增加。此外，當(dāng)用8μm以下的細(xì)胞的培養(yǎng)液進(jìn)行處理時(shí)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，與陽性對照(即，RSV處理組)的情況相似，黑素細(xì)胞中的自噬活性比陰性對照增加40％。

因此，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的8μm以下的來源于臍帶血的MSC的培養(yǎng)液的處理通過抑制黑素細(xì)胞中的酪氨酸酶活性來抑制黑色素合成，并通過自噬活性促進(jìn)黑色素降解，從而減少黑色素的量。

實(shí)施例8：與黑色素量降低相關(guān)的分泌蛋白

當(dāng)對用實(shí)施例1的培養(yǎng)液處理的Melan-a細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，對與黑色素量減少相關(guān)的小尺寸干細(xì)胞的分泌蛋白進(jìn)行了研究(圖12)。通過Fullmoon測定對分泌至培養(yǎng)液中的650蛋白進(jìn)行了分析。

結(jié)果示于下表中。

[表1]

特別地，除了已知蛋白質(zhì)之外，發(fā)現(xiàn)直徑為8μm以下的小干細(xì)胞還進(jìn)一步分泌諸如CD32/Fcg受體II、孕酮受體、鐵蛋白、抗增殖蛋白、層粘連蛋白B1、血小板反應(yīng)蛋白和C-ERB-4/HER-4等蛋白質(zhì)。

因此，認(rèn)為從小尺寸干細(xì)胞分泌的這些蛋白質(zhì)對抑制黑色素合成和促進(jìn)黑色素降解的更優(yōu)異的能力產(chǎn)生影響。

實(shí)施例9：人造皮膚中黑色素量的減少

本發(fā)明人進(jìn)一步用本發(fā)明的來源于臍帶血的MSC的培養(yǎng)液對人造皮膚進(jìn)行了處理，然后對結(jié)果進(jìn)行觀察。

結(jié)果，如圖13所示，觀察到在用本發(fā)明的8μm以下的細(xì)胞的培養(yǎng)液處理的組中，培養(yǎng)液處理5天后，顯示黑色素的細(xì)胞顯著減少。

從這些結(jié)果已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，無論干細(xì)胞的組織來源類型為何，直徑為8μm以下的小干細(xì)胞分泌各種與美白相關(guān)的蛋白質(zhì)，以共同抑制黑色素合成并促進(jìn)黑色素降解，因此顯示出最優(yōu)異的黑色素量減少效果，這與不按尺寸分離即進(jìn)行培養(yǎng)的異質(zhì)性情況相比更為顯著優(yōu)異。此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)液具有20μm以上的大直徑的細(xì)胞時(shí)，對黑色素量的減少?zèng)]有顯著影響，因此干細(xì)胞的美白功能很大程度上受干細(xì)胞尺寸的影響。

工業(yè)實(shí)用性

由于直徑為8μm以下的小干細(xì)胞或其培養(yǎng)液抑制產(chǎn)生黑色素的細(xì)胞中的黑色素表達(dá)并促進(jìn)合成的黑色素降解，從而通過顯著減少黑色素量顯示出優(yōu)異的美白效果，因此該干細(xì)胞及其培養(yǎng)液可用作美白用衛(wèi)生用品和功能性化妝品的原料，因此，本發(fā)明在利用美白的領(lǐng)域中非常有用。