本發(fā)明涉及一種細(xì)胞擴增方法，具體涉及一種nk細(xì)胞體外擴增方法，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：nk細(xì)胞是一群表型為cd3-，cd56+的細(xì)胞亞群，其殺傷活性無mhc限制，不依賴于抗體，被稱為自然殺傷細(xì)胞。nk細(xì)胞通常含有大量穿孔素和顆粒酶b，當(dāng)激活靶向細(xì)胞的時候，nk細(xì)胞通過釋放穿孔素和顆粒酶b來攻擊靶細(xì)胞。nk細(xì)胞在人血液中含量極低(單個核細(xì)胞的5％-10％)，因此在臨床應(yīng)用上受到很大的限制，需要進行體外擴增。當(dāng)前，nk細(xì)胞培養(yǎng)體系中大都是通過添加il-2、il-15、il-18等介素類刺激細(xì)胞的生長，通過一段時間的培養(yǎng)，效果上不僅擴增倍數(shù)不足，而且所得nk細(xì)胞的純度也不能滿足需求。此外，通過飼養(yǎng)細(xì)胞來培養(yǎng)，在數(shù)量和純度上有很好的效果，但是飼養(yǎng)本身就存在一定的風(fēng)險，因此不能作為最佳選擇。技術(shù)實現(xiàn)要素：為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種能夠提高效應(yīng)細(xì)胞的含量和細(xì)胞的總擴增量的nk細(xì)胞體外擴增方法。為了實現(xiàn)上述目標(biāo)，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：一種nk細(xì)胞體外擴增方法，其特征在于，包括以下步驟：step1：配制主要成分為50ng/ml抗cd3單克隆抗體+50ng/ml抗cd16單克隆抗體的試劑a，配制主要成分為300iu/mlil-2的試劑b，配制主要成分為20ng/mlil-12+20ng/mlil-15的試劑c，準(zhǔn)備淋巴細(xì)胞分離液40ml作為試劑d；step2：取試劑a于t-175培養(yǎng)瓶包被，4℃過夜；step3：取50ml-100ml外周血，離心，離心所得細(xì)胞留step4使用，取血清，將所得血清于56℃滅火30min，冷析1h，再離心，取血清4℃保存?zhèn)溆茫籹tep4：取兩支離心管，每支離心管中加20ml試劑d，將step3所得細(xì)胞用d-pbs重懸并調(diào)整至50ml，分別向每支裝有20ml試劑d的離心管中緩緩添加25ml重懸細(xì)胞液，利用密度梯度離心法收集pbmc；step5：將step4收集的pbmc用d-pbs清洗2遍，將清洗后的pbmc按照1×106/ml-2×106/ml重懸于100mlx-vivo15培養(yǎng)基中，然后加入試劑b和試劑c，同時添加step3所得自體血清5ml，置于二氧化碳培養(yǎng)箱孵育；step6：第3天補加x-vivo15培養(yǎng)基150ml，補加試劑b和試劑c各150ul，補加step3所得自體血清5ml；step7：第6天補加x-vivo15培養(yǎng)基250ml，補加試劑b和試劑c各250ul，然后分別轉(zhuǎn)移至2個培養(yǎng)袋中，每個培養(yǎng)袋加step3所得自體血清5ml；step8：第9天分別在兩個培養(yǎng)袋補加x-vivo15培養(yǎng)基350ml，補加試劑b和試劑c各350ul，每個培養(yǎng)袋加step3所得自體血清5ml；step9：第12天分別在兩個培養(yǎng)袋補加x-vivo15培養(yǎng)基400ml，補加試劑b和試劑c各400ul，每個培養(yǎng)袋添加step3所得自體血清5ml；step10：第14天收集細(xì)胞，取樣做質(zhì)檢和流式。前述的nk細(xì)胞體外擴增方法，其特征在于，在step3中，外周血的離心條件為：2000rpm離心10min。前述的nk細(xì)胞體外擴增方法，其特征在于，在step3中，冷析后的血清的離心條件為：3500rpm離心15min。前述的nk細(xì)胞體外擴增方法，其特征在于，在step4中，密度梯度離心法的離心條件為：1500rpm離心30min。前述的nk細(xì)胞體外擴增方法，其特征在于，在step5中，pbmc的清洗方法為：1350rpm離心5min。本發(fā)明的有益之處在于：用主要成分為50ng/ml抗cd3單克隆抗體+50ng/ml抗cd16單克隆抗體的試劑a包被培養(yǎng)瓶，將細(xì)胞種植到該培養(yǎng)瓶中之后，在孵育的第1天至第3天這個過程中，抗cd3單克隆抗體和抗cd16單克隆抗體對細(xì)胞進行刺激，使細(xì)胞分泌相關(guān)的因子，提高了所需表型細(xì)胞的百分比，所以在體外培養(yǎng)時提高了效應(yīng)細(xì)胞的含量和細(xì)胞的總擴增量，即提高了nk細(xì)胞的擴增倍數(shù)和純度。附圖說明圖1是常規(guī)組的流式圖；圖2是實驗組的流式圖；圖3是常規(guī)組與實驗組的增值曲線對比圖。具體實施方式以下結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明作具體的介紹。本發(fā)明的nk細(xì)胞體外擴增方法，其包括以下步驟：step1、配制試劑1、試劑a試劑a的主要成分為50ng/ml抗cd3單克隆抗體+50ng/ml抗cd16單克隆抗體，其配制方法為：于超凈臺中分別取100ng抗cd3單克隆抗體和100ng抗cd16單克隆抗體，然后用2ml注射用水溶解，即配制成所需試劑a，即配即用。2、試劑b試劑b的主要成分為300iu/mlil-2，其配制方法為：于超凈臺中取li-2一支(100萬iu)，然后用3.3mlx-vivo15培養(yǎng)基溶解，即配制成所需試劑b，按照所需要量進行分裝，-20℃保存。3、試劑c試劑c的主要成分為20ng/mlil-12+20ng/mlil-15，其配制方法為：于超凈臺中分別取400ugil-12和400ugil-15，然后用2mlx-vivo15培養(yǎng)基溶解，即配制成所需試劑c，按照需求量進行分裝，-20℃保存。4、試劑d試劑d是淋巴細(xì)胞分離液，準(zhǔn)備40ml。step2、包被取試劑a于t-175培養(yǎng)瓶包被，4℃過夜。step3、處理外周血取50ml-100ml外周血，3500rpm離心15min，離心所得細(xì)胞留step4使用，取血清，將所得血清于56℃滅火30min，冷析1h，再離心，取血清4℃保存?zhèn)溆谩tep4：收集pbmc將step3所得細(xì)胞用d-pbs重懸，調(diào)整至50ml。取兩支離心管，每支離心管中加20ml試劑d，分別向每支裝有20ml試劑d的離心管中緩緩添加25ml重懸細(xì)胞液，這個過程不能破壞分層。利用密度梯度離心法收集pbmc，1500rpm離心30min。step5、孵育及補加營養(yǎng)物質(zhì)和刺激物將step4收集的pbmc用d-pbs清洗2遍，1350rpm離心5min，將清洗后的pbmc按照1×106/ml-2×106/ml重懸于100mlx-vivo15培養(yǎng)基中，然后加入試劑b和試劑c，同時添加step3所得自體血清5ml，置于二氧化碳培養(yǎng)箱孵育。第3天補加x-vivo15培養(yǎng)基150ml，補加試劑b和試劑c各150ul，補加step3所得自體血清5ml。第6天補加x-vivo15培養(yǎng)基250ml，補加試劑b和試劑c各250ul，然后分別轉(zhuǎn)移至2個培養(yǎng)袋中，每個培養(yǎng)袋加step3所得自體血清5ml。第9天分別在兩個培養(yǎng)袋補加x-vivo15培養(yǎng)基350ml，補加試劑b和試劑c各350ul，每個培養(yǎng)袋加step3所得自體血清5ml。第12天分別在兩個培養(yǎng)袋補加x-vivo15培養(yǎng)基400ml，補加試劑b和試劑c各400ul，每個培養(yǎng)袋添加step3所得自體血清5ml。第14天收集細(xì)胞，取樣做質(zhì)檢和流式。常規(guī)組的流式圖如圖1所示。實驗組的流式圖如圖2所示。對比圖1和圖2可知：cd3-、cd56+的效應(yīng)細(xì)胞比例有很大的提高，說明nk細(xì)胞的純度得到了很大的提高。常規(guī)組和實驗組的增值數(shù)據(jù)如表1所示。常規(guī)組和實驗組的增值曲線對比圖如圖3所示。表1常規(guī)組和實驗組的增值數(shù)據(jù)孵育天數(shù)常規(guī)組實驗組d00.5×1080.5×108d33.2×1085.1×108d66.7×10811.4×108d914.5×10823.8×108d1230.6×10849.8×108d1468.6×108106.8×108通過表1和圖3可知：實驗組相對常規(guī)組在擴增量上有顯著的提高，說明nk細(xì)胞的擴增倍數(shù)得到了提高。需要說明的是，上述實施例不以任何形式限制本發(fā)明，凡采用等同替換或等效變換的方式所獲得的技術(shù)方案，均落在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁12