本發(fā)明屬于蛋白檢測
技術領域：
，特別涉及sh2a單克隆抗體雜交瘤細胞，還涉及由該細胞產(chǎn)生的單克隆抗體和單克隆抗體的應用。
背景技術：
：人唾液酸糖蛋白受體(asgpr)僅在肝細胞中表達且負責脫唾液酸糖蛋白從血漿中清除。asgpr由兩個相關的氨基酸序列亞基h1(46kd)和h2(50kd)組成，h2a和h2b為asgpr的h2亞基兩個可變剪接體。h2a和h2b僅在緊鄰跨膜片段的外胞質結構域中額外五肽結構上有區(qū)別，研究顯示，sh2a在緊鄰五肽處裂解為35kd的片段，包括完整的胞外域，為分泌性的，組成受體的可溶形式(sh2a)，申請?zhí)?00480013005.2的專利公開sh2a用作肝病診斷的標記物，申請?zhí)?01310062296.5的專利公開了一種sh2a定量檢測試劑盒，申請?zhí)?01410042011.6的專利公開一種血清sh2a含量的時間分辨免疫熒光分析法及檢測試劑盒，但這些現(xiàn)有技術或多或少都存在一些問題，例如使用的抗體不夠高效，效價不高，檢測的方法和配套的試劑盒靈敏度、特異性等方面還存在著不足。技術實現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)其中一個明的目的在于提供適用于sh2a檢測的單克隆抗體雜交瘤細胞，本發(fā)明提供的單克隆抗體雜交瘤細胞能夠分泌效價高特異性好sh2a單克隆抗體，本發(fā)明提供的sh2a單克隆抗體效價高，特異性好。本發(fā)明的sh2a單克隆抗體特別適于應用于血清sh2a含量的磁微粒化學發(fā)光法檢測試劑盒，該試劑盒使用本發(fā)明提供的兩種sh2a單克隆抗體，并且結合磁微粒法化學發(fā)光法，具有線性范圍寬、穩(wěn)定性好、靈敏度高、特異性強、準確度高、檢測時間短等優(yōu)點。為實現(xiàn)上述技術方案，提供如下技術方案：1.分泌抗sh2a單克隆抗體雜交瘤細胞，保藏號為cctccno.c201751的雜交瘤細胞或保藏號為cctccno.c201750的雜交瘤細胞。2.sh2a單克隆抗體，由所述保藏號為cctccno.c201751的雜交瘤細胞或cctccno.c201750的雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體。3.所述sh2a單克隆抗體的應用，所述sh2a單克隆抗體用于制備sh2a檢測試劑盒。4.sh2a檢測試劑盒，包含：固相載體、生物素標記的sh2a第一單克隆抗體、酶標記的sh2a第二單克隆抗體、發(fā)光底物。本發(fā)明試劑盒相比酶聯(lián)免疫法和時間分辨免疫熒光法具有以下優(yōu)勢：a.將化學發(fā)光技術與免疫磁微粒相結合，提供了一種液相的反應體系，使反應更充分和迅速，反應時間大大縮短，能快速、高通量檢測大批樣品。b.采用化學發(fā)光底物液，具有更高的檢測靈敏度，而且線性范圍更寬。c.使用高特異性的單克隆抗體，使免疫反應的親和力更高，而且單抗的生產(chǎn)批間差異相對較小，更容易保證產(chǎn)品的批間穩(wěn)定。d.主要試劑以工作液的形式提供，檢驗方法方便易行，減少人為操作誤差，具有的更高的準確度和靈敏度，達到了較佳的性能參數(shù)。本發(fā)明提供了一種用于定量檢測sh2a的試劑盒，包括：偶聯(lián)有鏈霉親和素的磁性微粒；生物素標記的sh2a第一單克隆抗體；酶標記的sh2a第二單克隆抗體；sh2a校準品和/或sh2a質控品、金剛烷衍生物發(fā)光底物。在一種實施方式中，上述試劑盒中，所述sh2a第一單克隆抗體和所述sh2a第二單克隆抗體不同，兩者之一是單克隆抗體5a9b8或者單克隆抗體1f2d2，其中單克隆抗體5a9b8是保藏號為cctccno.c201751的雜交瘤細胞分泌的人sh2a特異性單克隆抗體；單克隆抗體1f2d2是保藏號為cctccno.c201750的雜交瘤細胞分泌的人sh2a特異性單克隆抗體。在一種優(yōu)選的實施方式中，上述試劑盒中的所述sh2a第一單克隆抗體與所述sh2a第二單克隆抗體不同，生物素標記sh2a第一單克隆抗體為抗1f2d2單抗，堿性磷酸酶標記的sh2a第二單克隆抗體為抗5a9b8單抗。經(jīng)測定，單克隆抗體5a9b8和單克隆抗體1f2d2的效價均達1：108以上。此外，也可用生物素標記抗5a9b8單抗，堿性磷酸酶標記抗1f2d2單抗，效價試驗效果驗證差異不大。在一種優(yōu)選的實施方式中，與sh2a單克隆抗體免疫結合的抗原選自含有sh2a蛋白或sh2a重組蛋白的被測液，被測液為全血、血漿、血清、尿液、唾液、眼淚、體液、胃液或糞便。在一種優(yōu)選的實施方式中，sh2a重組蛋白為sh2a原核細胞重組蛋白或sh2a真核細胞重組蛋白，編碼sh2a原核細胞重組蛋白的核酸引物序列：上游引物序列如seqidno.1：5’-ggatccgcacagctgcaagccgagctgcg-3’下游引物序列如seqidno.2：5’-gaattctcaggccacctcgccggtggca-3’；編碼sh2a真核細胞重組蛋白的核酸引物序列：上游引物序列如seqidno.3：5’-agcttcgaattcatggctgatatcggatcctcccaaag-3’下游引物序列如seqidno.4:5’-gcccgcggtacctcaggccacctcgccggtggcattcc-3’。在一種實施方式中，上述試劑盒中的sh2a校準品和sh2a質控品是真核細胞表達的重組sh2a蛋白或原核細胞表達的重組sh2a蛋白。比如sh2a校準品或sh2a質控品可以為通過將重組質粒轉染到真核細胞，培養(yǎng)后收集陽性細胞上清，分離出真核表達的sh2a蛋白；也可以通過基因工程的手段及大腸桿菌表達系統(tǒng)獲得的原核sh2a蛋白，編碼sh2a原核細胞重組蛋白的核酸序列由如下引物擴增獲得：上游引物序列如seqno.1：5’-ggatccgcacagctgcaagccgagctgcg-3’下游引物序列如seqno.2：5’-gaattctcaggccacctcgccggtggca-3’；編碼sh2a真核細胞重組蛋白的核酸序列由如下引物擴增獲得：上游引物序列如seqno.3：5’-agcttcgaattcatggctgatatcggatcctcccaaag-3’下游引物序列如seqno.4:5’-gcccgcggtacctcaggccacctcgccggtggcattcc-3’。sh2a校準品可用于制作標準曲線，從而使得sh2a檢測定量化。在一種優(yōu)選的實施方式中，偶聯(lián)有鏈霉親和素的磁性微粒的懸液：生物素標記抗體試劑：堿性磷酸酶標記抗體試劑：金剛烷衍生物發(fā)光底物液體積比為3:6:3:20。在一種優(yōu)選的實施方式中，上述試劑盒中的固相載體為表面帶有氨基或羧基活性基團的超順磁二氧化硅磁珠。磁性微粒呈磁珠懸液形式，即鏈霉親和素磁珠懸液作為磁分離試劑。在一種優(yōu)選的實施方式中，所述磁性微粒是表面帶有活性基團、以二氧化硅為內核的聚合物。所述活性基團可以是氨基、羧基、ida(亞氨基二乙酸)、環(huán)氧基等，優(yōu)選氨基或羧基。在一種優(yōu)選的實施方式中，磁性微粒的粒徑通常是0.1-1微米，表面帶有氨基或羧基活性基團的超順磁二氧化硅磁珠。磁性微粒的平均粒徑可以為0.2-5微米，優(yōu)選0.2-3微米、更優(yōu)選0.5-1微米。如果平均粒徑小于0.1微米，則價格過高，并可能造成上述免疫復合物的分離困難，可能影響sh2a含量的測定精確性；另一方面，如果平均粒徑大于1微米，則不利于檢測體系形成接近均相的反應體系，進而可能影響到sh2a含量的測定精確性。本發(fā)明的試劑盒中的sh2a檢測體系采用酶催化的底物化學發(fā)光法，從而通過進行光電信號檢測而確定樣品中的sh2a含量。在一種實施方式中，上述試劑盒中的酶優(yōu)選是過氧化物酶、堿性磷酸酶，更優(yōu)選的是堿性磷酸酶。堿性磷酸酶的作用底物為能發(fā)生化學發(fā)光的(金鋼烷)-1，2-二氧乙烷及其衍生物，可以選自下組：3-(2-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧環(huán)乙烷二鈉鹽(amppd)、cspd、3-(2-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧環(huán)乙烷(cdp-star)、adp-star。優(yōu)選是amppd。本發(fā)明將化學發(fā)光和磁性微粒結合起來，提供了一種接近均相的反應體系，可以定量檢測出sh2a含量。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的試劑盒具有操作過程簡單、反應時間短、檢測限低、靈敏度高等諸多優(yōu)點，在臨床檢驗中可以根據(jù)sh2a的含量進行肝損傷、肝炎、肝纖維化等肝病的輔助診斷。在本發(fā)明中，術語“磁性微?！薄ⅰ按盼⒘！薄ⅰ按胖椤焙汀按判灶w?！北硎鞠嗤囊饬x，都是指用于將親和素、生物素、抗原/抗體、酶、核酸/寡核苷酸、小分子藥物等固定在其表面的具有超順磁性的膠態(tài)復合材料，可均勻分散于一定基液中，在磁場中富集。附圖說明為了使本發(fā)明的目的、技術方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖進行說明：圖1為sh2a基因片段pcr擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中m為dna分子量標準，1為陰性對照，2和3為pcr擴增產(chǎn)物。圖2為iptg誘導的pet30a-sh2a轉化bl21(de3)細菌裂解上清的sds-page圖，1為蛋白marker，2為未誘導的細菌裂解液，3、4、5為1mmiptg誘導表達的細菌裂解上清。圖3為真核細胞表達蛋白的sds電泳圖，1為蛋白marker，2和3分別為空載體轉染細胞上清和裂解液，4和5分別為表達載體轉染細胞上清和裂解液。圖4為sh2a原核重組蛋白的westernblotting圖，其中1為純化后的sh2a原核重組蛋白，2為未誘導表達的陰性對照。圖5為本發(fā)明血清sh2a含量的磁微?；瘜W發(fā)光法的sh2a標準曲線圖。圖6為以肝硬化患者血清組和正常人血清組測定結果繪制的roc曲線圖。生物材料保藏本發(fā)明中雜交瘤細胞株5a9b8和雜交瘤細胞株1f2d2送中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號分別為cctccno.c201751和cctccno.c201750，地址位于中國武漢武漢大學，保藏日期均為2017年3月29日，分類命名為雜交瘤細胞株5a9b8和雜交瘤細胞株1f2d2。具體實施方式下面將結合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。優(yōu)選實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件進行。材料和試劑：磁性微粒，為磁微粒懸液，濃度為1mg/ml，磁微粒含羧基活性基團，每毫克(mg)磁微粒羧基含量不低于0.05毫摩爾(mmol)。購自河南惠爾納米科技(生物)有限公司，型號：hrcz-04n200?；罨备^氧化物酶(hrp)標記試劑盒，購自北京泰天河生物科技有限公司，型號：md010a。堿性磷酸酶購自日本dojindo公司型號：lk12。2-嗎啉乙磺酸一水合物(mes)：購自上海芃碩生物科技有限公司，貨號：pm105074-500g。碳二亞胺(edc)：購自北京華邁科生物技術有限責任公司，貨號：e046101。吐溫-20：購自生工生物工程(上海)股份有限公司，貨號：t0777-500ml。proclin300：購自閃晶生物公司，型號：zb116。磁力架，購自corning公司?；瘜W發(fā)光型免疫分析儀，安圖生物，型號：lumo。全自動磁微?；瘜W發(fā)光儀，江蘇澤成生物技術有限公司，型號：cia600。其他化學試劑均為分析純，均購自中國醫(yī)藥(集團)上?；瘜W試劑公司。實施例1、sh2a重組蛋白的表達、純化及鑒定1.原核蛋白表達以肝癌組織cdna為模板，以上游引物5’-ggatccgcacagctgcaagccgagctgcg-3’(seqidno.1)和下游引物5’-gaattctcaggccacctcgccggtggca-3’(seqidno.2)為引物，pcr擴增sh2a基因片段(圖1)，切膠回收純化后，連接至克隆載體pcr2.1并進行測序鑒定，再將序列鑒定正確的sh2a基因片段克隆至原核表達載體pet30a(+)中，酶切位點為bamhi和ecori，獲得重組質粒pet30a-sh2a。將重組質粒pet30a-sh2a轉化大腸桿菌bl21(de3)，挑取轉化成功的克隆，37℃培養(yǎng)至od600nm值約0.6，加入1mmiptg繼續(xù)培養(yǎng)3h誘導目的蛋白表達。誘導結束后，超聲裂解菌體，取裂解上清進行sds-page，同時設立未經(jīng)iptg誘導的pet30a空載體轉化的裂解上清為對照，結果顯示，目的蛋白大小為35kd(圖2)，與sh2a原核重組蛋白理論值相符。用his蛋白純化柱純化，獲得sh2a原核重組蛋白。2.真核蛋白表達以重組質粒pet30a-sh2a為模板，以上游引物5’-agcttcgaattcatggctgatatcggatcctcccaaag-3’(seqidno.3)和下游引物5’-gcccgcggtacctcaggccacctcgccggtggcattcc-3’(seqidno.4)為引物，pcr擴增sh2a基因片段，連接至真核表達載體pegfp-n1并進行測序鑒定，酶切位點為ecori和kpni，獲得重組質粒pegfp-n1-sh2a。將重組質粒pegfp-n1-sh2a用lip2000脂質體瞬時轉染293t細胞，72h后收取細胞上清和細胞沉淀，細胞裂解液裂解細胞，取細胞表達上清和細胞裂解上清進行sds-page，同時設立pegfp-n1空載體轉染的細胞上清和裂解上清為對照，結果顯示，目的蛋白大小為35kd(圖3)，與sh2a重組蛋白理論值相符。用his蛋白純化柱純化，獲得sh2a重組蛋白。3.sh2a蛋白活性鑒定用westernblotting方法對sh2a原核重組蛋白的活性進行鑒定。將重組蛋白進行sds-page，利用轉印儀將目的條帶轉印到nc膜上，用含有1％bsa的磷酸鹽緩沖液于4℃封閉過夜，再用含0.5％tween20的磷酸鹽緩沖液洗膜，再加入鼠抗人sh2a抗體于37℃振蕩溫育2小時，洗膜后再加入抗鼠igg酶標二抗振蕩溫育1小時，最后洗膜、ecl顯色，結果顯示，在目的蛋白相應位置處有明顯的特異性條帶(圖4)，而在對照相應位置處無條帶，證明所得sh2a重組蛋白具有良好的生物學活性。實施例2、抗sh2a單克隆抗體的制備1、抗原免疫小鼠取6周齡balb/c雌性小鼠2只，按照以下步驟進行免疫：首次免疫：將sh2a原核重組蛋白溶液與弗式完全佐劑按體積比1:1混合，充分乳化后，于小鼠背部皮下分兩點注射0.1ml(sh2a重組蛋白30μg/只)；第二次免疫：間隔14天后，將sh2a重組蛋白溶液與弗式不完全佐劑按體積比1:1混合，充分乳化后，于小鼠兩側腹股溝部皮下分點共注射0.1ml(sh2a重組蛋白50μg/只)；第三次免疫：間隔14天后，將sh2a重組蛋白溶液與弗式不完全佐劑按體積比1:1混合，充分乳化后，于小鼠兩側肩后部及腹部皮下分點共注射0.1ml(sh2a重組蛋白50μg/只)；末次免疫：間隔10天后，尾靜脈采血elisa檢測血清效價，達到1:10000(表1)后加強免疫(吸光度值明顯大于空白)，于小鼠腹腔注入sh2a重組蛋白溶液0.1ml(sh2a重組蛋白50μg/只)。表1鼠抗血清效價測定2、單克隆抗體的制備末次免疫3天后采血，取脾臟進行細胞融合，利用hat選擇培養(yǎng)基在96孔細胞培養(yǎng)板上選擇雜交瘤細胞，并利用間接elisa方法鑒定產(chǎn)生抗sh2a抗體的細胞。結果獲得9株分泌特異性sh2a抗體的雜交瘤細胞株，分別命名為2b6c6、4c3e3、5e2g8、1c8f2、4a6b7、3f10b1、3d2c2、1f2d2和5a9b8。利用細胞發(fā)酵裝置培養(yǎng)獲得的雜交瘤細胞株，收集細胞培養(yǎng)上清，用proteina-sepharose親和層析柱從細胞培養(yǎng)上清中分離純化抗sh2a單抗。3、抗體效價鑒定采用間接法檢測單克隆抗體的效價。將sh2a原核重組蛋白包被于固相微孔板，濃度為5ug/ml，每孔100ul，以2％bsa的磷酸鹽緩沖液封閉2h，將純化的單克隆抗體(濃度調整到1mg/ml)以磷酸鹽緩沖液先稀釋到10000倍，再繼續(xù)倍比稀釋14個濃度，同時以不加抗體的稀釋液為空白對照，每孔100ul加入微孔板，37℃反應1h，再加入羊抗鼠酶標二抗(1:5000稀釋)，37℃反應1h后，檢測吸光度值(波長450nm)。吸光度值越大，抗體效價越高。結果顯示，2b6c6、5e2g8、3f10b1、1f2d2和5a9b8的效價達到106以上(表2)，可以用于抗體的配對，其中1f2d2和5a9b8可達到108。表2單克隆抗體效價測定(間接elisa法)將雜交瘤細胞株5a9b8和雜交瘤細胞株1f2d2送中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號分別為cctccno.c201751和cctccno.c201750，地址位于中國武漢武漢大學，保藏日期均為2017年3月29日。實施例3、抗sh2a單克隆抗體的配對篩選1.抗體配對篩選采用雙抗夾心法進行兩兩配對實驗。將上述效價較高的5株抗sh2a單抗分別包被在固相微孔板中，抗體濃度為5ug/ml，100ul/孔，以2％bsa的磷酸鹽緩沖液封閉2h，將sh2a原核重組蛋白稀釋到500ng/ml，并繼續(xù)倍比稀釋6個濃度，以稀釋液為空白對照，37℃反應1h，加入辣根過氧化物酶(hrp)標記的除自身以外的其余4株抗sh2a單抗(1:10000)，檢測檢測吸光度值(波長450nm)。結果顯示，抗sh2a單抗1f2d2和5a9b8配對可以檢測到蛋白有明顯的濃度梯度，可以用于建立反應體系(表3)。表3sh2a配對單抗的篩選(雙抗夾心法)實施例4、血清sh2a含量的磁微?；瘜W發(fā)光法檢測試劑盒的構建1、磁微粒試劑(鏈霉親和素磁珠懸液)制備鏈霉親和素磁珠懸液制備包括如下步驟：a.取50mg(1mg/ml)粒徑為0.3μm帶有羧基(或氨基)的二氧化硅磁珠，磁分離去上清，用0.05mol/l、ph4.5的mes緩沖液清洗3次；b.用5ml的0.1mol/l、ph4.5的mes緩沖液重懸磁微粒，濃度為10mg/ml；c.加入5-7.5mg鏈霉親和素，室溫攪拌30min；d.加入20-30μl新鮮配制的10mg/ml的edc水溶液，4℃下攪拌過夜；e.磁分離，去上清，用0.01mol/lpbs洗滌3次；f.用含2％bsa的0.01mol/lpbs(ph＝7.4)室溫封閉2-3小時；g.用含0.5％bsa的0.01mol/lpbs(ph＝7.4)清洗3次；h.用含2％bsa的0.01mol/lpbs(ph＝7.4)配制成1mg/ml的磁珠懸液，用時輕輕搖勻即得，于4℃冰箱保存。2、生物素標記的sh2a第一單克隆抗體制備生物素標記sh2a第一單克隆抗體為抗1f2d2單抗。生物素標記的sh2a第一單克隆抗體制備包括如下步驟：a.取2mg的1f2d2單克隆抗體，用0.1mol/l、ph9.6碳酸鹽緩沖液在2～8℃下攪拌透析6-8小時，中間換一次液；b.按照抗體分子與生物素分子比為1:20的比例在透析后的抗體溶液中加入生物素溶液，并加入dmso至終濃度為10％，混勻；c.緩慢振蕩，37℃避光反應2h；d.加入60-80μl的3mol/l乙醇胺溶液，室溫避光反應30min；f.用0.01mol/lpbs溶液在2～8℃下攪拌透析，5-6小時換一次液，共換液3～4次；g.向透析后的抗體溶液加入等體積甘油，混勻、分裝，使生物素標記的抗1f2d2單抗終濃度為0.5mg/ml，-20℃保存。3、堿性磷酸酶標記的sh2a第二單克隆抗體制備堿性磷酸酶標記的sh2a第二單克隆抗體為抗5a9b8單抗。堿性磷酸酶標記的sh2a第二單克隆抗體制備包括如下步驟：a.取2.5mg堿性磷酸酶(50iu/mg)，加入200ul含1.25％戊二醛的100mm的pb(ph6.8)，混勻，室溫反應過夜；b.4℃條件下，電磁攪動，用50mmpbs(ph7.2)透析12小時，換液4次；c.將1.5mg單克隆抗體以50kd的超濾管置換碳酸鹽緩沖液(ph9.6)，超濾后體積為100ul；d.將活化的堿性磷酸酶加入上述抗體溶液中，混勻，4℃條件下反應24小時；e.加入10ul200mm的賴氨酸溶液，混勻，室溫下反應2小時；f.將上述溶液裝入透析袋，4℃條件下以50mmpbs(ph7.2)透析12小時，換液4次；g.將透析后的溶液10,000rpm離心30min，收集上清，以體積比1:10加入0.5％bsa，制備得到堿性磷酸酶標記的抗5a9b8單抗，抗5a9b8單抗?jié)舛葹?.5mg/ml，-20℃保存。4、sh2a校準品和質控品制備sh2a校準品制備包括如下步驟：a.將sh2a真核細胞重組蛋白以10mmpbs倍比稀釋5個濃度梯度，采用bca蛋白定量試劑盒(碧云天)檢測sh2a真核細胞重組蛋白濃度為2mg/ml；b.用校準品稀釋液將sh2a重組蛋白稀釋至各工作濃度點，分別為0、10ng/ml、30ng/ml、80ng/ml、200ng/ml、500ng/ml，儲存于2-8℃。sh2a質控品制備包括如下步驟：(1)將sh2a真核細胞重組蛋白用校準品稀釋液配制成100ng/ml的質控品工作濃度，儲存于2-8℃。此外，sh2a校準品和質控品還可選自sh2a原核重組蛋白，且與真核細胞重組蛋白效果近似。5、校準品稀釋液的配制根據(jù)配置量，稱取nacl8.0g，kcl0.2g，kh2po40.27g，na2hpo4.12h2o2.9g，bsa10g，加入0.2mlproclin3，蒸餾水定容至1l，用0.25um水性濾膜，真空抽濾。6、洗滌濃縮液的配制洗滌濃縮液配制如下：a.試劑稱量：3.425m氯化鈉、0.0675m氯化鉀、0.05m磷酸二氫鈉、0.2m十二水合磷酸氫二鈉、3.75％吐溫-20，加入蒸餾水并定容至1l；b.定容后的洗滌液用0.45um水性濾膜，真空抽濾，并高壓滅菌。7、發(fā)光底物液的配制根據(jù)配制量，稱取三羥基甲烷(tris)24.23g，十二烷基磺酸鈉(sds)2.0g，3-(2-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧環(huán)乙烷二鈉(amppd)0.1g，吐溫-200.5ml，調ph至9.3±0.2，加蒸餾水至1l，過濾。8、試劑盒組分組分如表4所示。表4試劑盒組分編號組分規(guī)格(50人份)1鏈霉親和素磁珠懸液1.5ml2生物素標記抗體試劑3ml3校準品0.5ml4質控品0.5ml5堿性磷酸酶標記抗體試劑1.5ml6樣本稀釋液2ml7洗滌濃縮液25ml8堿性磷酸酶發(fā)光底物液10ml9說明書1份9、sh2a試劑盒檢測步驟以實施例1-4中所得的試劑、必要的輔助試劑為基礎，可組合成試劑盒。按下述步驟繪制sh2a標準曲線并檢測樣本：(1)將待檢試劑盒在室溫(18～25℃)下平衡30分鐘；(2)配制洗液：用蒸餾水將洗滌濃縮液按1:25稀釋(1ml洗液加24ml蒸餾水)。若濃縮洗液有結晶，可將濃縮洗液置于室溫或37℃，待結晶溶解后再進行稀釋；(3)在反應管中加入25μl待測樣本(或校準品及質控品)，然后加入50μl生物素標記的sh2a抗體、50μl堿性磷酸酶標記的sh2a抗體，混勻，37℃條件下溫育20min；加入20μl霉親和素磁珠懸液試劑，混勻，37℃條件下溫育15min；(4)洗滌：使磁微粒在磁場中沉降，去除上清，加入300μl的洗液，去除磁場，震蕩使磁微粒充分混懸，然后磁分離，去除上清；此步驟重復3-4次；(5)反應管中加入100μl堿性磷酸酶發(fā)光底物液，震蕩，使磁微粒充分混懸，1min內測定各管的光強度。并擬合出標準曲線，進行樣本值的計算，標準曲線見圖5。實施例5、血清sh2a檢測試劑盒的應用1.試劑盒性能指標分析靈敏度：對20次零校準品的測定，取其2倍的標準偏差加上平均值在標準曲線上所對應的濃度，即為分析靈敏度，結果≤1ng/ml(表5)；表5試劑盒靈敏度分析精密度：同一批號試劑盒檢測高低2個濃度水平(高濃度200ng/ml，低濃度30ng/ml)的樣本各10次，批內變異cv％≤10.0％；3個批號試劑盒檢測同一樣本各10次，批間變異cv％≤15.0％(表6)；表6試劑盒精密度線性系數(shù)：r≥0.990；線性范圍：0-500ng/ml(表7)；表7試劑盒線性范圍標準品(ng/ml)123095391332112865105941173954383967523098544768643772632880185789612587321285432200253002521315482454906500359503432840293317655相關系數(shù)r0.9960.9980.995特異性：分別檢測了甲胎蛋白(afp)、癌胚抗原(cea)、糖類抗原15-3(ca15-3)在高濃度下的交叉反應，結果均<1ng/ml，基本沒有干擾(表8)。表8試劑盒特異性潛在交叉反應物檢測結果干擾性甲胎蛋白(afp)200ng/ml0.36ng/ml﹤0.1％癌胚抗原(cea)150ng/ml0.29ng/ml﹤0.1％糖類抗原15-3(ca15-3)5000u/ml0.16ng/ml﹤0.1％2.臨床應用從浙江省第一人民醫(yī)院收集正常人和肝硬化患者的血清樣品各100例，使用本發(fā)明血清sh2a含量的磁微?；瘜W發(fā)光法及其檢測試劑盒，分別檢測肝硬化患者和正常人血清中的sh2a含量。結果顯示，正常人血清中的sh2a平均含量約為47ng/ml，肝硬化患者血清中的sh2a含量約為123ng/ml，顯著高于正常人血清中的sh2a含量。對肝硬化患者血清組和正常人血清組測定結果進行分析，繪制roc曲線，顯示用于區(qū)分肝硬化患者與正常人的截斷點(cut-offpoint)值為87ng/ml，roc曲線下面積為0.939，診斷靈敏度為85％，特異性為95％，(圖6)檢測樣本的反應時間僅需30min左右。而申請?zhí)?01410042011.6的專利公開一種血清sh2a含量的時間分辨免疫熒光分析法及檢測試劑盒的抗體效價為1:16000，roc曲線下面積為0.845，診斷靈敏度為75％，特異性為95.7％，檢測樣本的反應時間需2.5h，可見，本發(fā)明試劑盒在抗體效價和診斷靈敏度、檢測時間方面具有明顯優(yōu)勢。最后說明的是，以上優(yōu)選實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案而非限制，盡管通過上述優(yōu)選實施例已經(jīng)對本發(fā)明進行了詳細的描述，但本領域技術人員應當理解，可以在形式上和細節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權利要求書所限定的范圍。<110>江蘇為真生物醫(yī)藥技術股份有限公司<120>sh2a單克隆抗體雜交瘤細胞及其單克隆抗體和應用<160>4<210>1<211>29<212>dna<213>人工序列<220><223>擴增sh2a基因片段的上游引物<400>1ggatccgcacagctgcaagccgagctgcg29<210>2<211>28<212>dna<213>人工序列<220><223>擴增sh2a基因片段的下游引物<400>2gaattctcaggccacctcgccggtggca28<210>3<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223>擴增sh2a基因片段的上游引物<400>3agcttcgaattcatggctgatatcggatcctcccaaag38<210>4<211>38<212>dna<213>人工序列<220><223>擴增sh2a基因片段的下游引物<400>4gcccgcggtacctcaggccacctcgccggtggcattcc38當前第1頁12