本發(fā)明涉及分子生物學技術領域，尤其是涉及bancr過表達型人皮膚黑色素瘤穩(wěn)轉細胞株及其制備方法和應用。

背景技術：

遺傳學的“中心法則”描述了遺傳信息從dna通過rna到相應蛋白質的信息流途徑。幾十年來，傳統(tǒng)觀點認為dna是遺傳物質的儲存載體，基因要通過其表達的相應蛋白質來發(fā)揮作用。隨著人類基因組計劃的順利完成，人們發(fā)現(xiàn)僅僅一小部分基因為蛋白編碼基因，而90％以上的人類基因都已經(jīng)發(fā)生了轉錄，這表明眾多數(shù)量的轉錄本是不編碼蛋白質的，這部分轉錄本被稱為“非編碼rna”(non-codingrna,ncrna)。起初，ncrna被認為是轉錄“噪音”，然而近年來越來越多的研究表明ncrna在維持正常細胞生理功能及疾病發(fā)生發(fā)展過程中均發(fā)揮著多樣化的調節(jié)作用?；趎crna的主要生物學功能，可將其大致分為結構性和調節(jié)性兩大類ncrna。結構ncrna在蛋白質翻譯過程中發(fā)揮重要作用，包括轉移rna(transferrna，trna)，核糖體rna(ribosomalrna，rrna)，小核rna(smallnuclearrna，snrna)和核仁小rna(smallnucleolarrna，snorna)；調節(jié)ncrna包括小干擾rna(smallinterferingrna，sirna)，微小rna(microrna，mirna)，piwi蛋白相互作用的rna(piwi-interactingrnas,pirnas)和長鏈非編碼(longnoncodingrna，lncrna)。lncrna長度在200個核苷酸以上，大部分lncrna被視為缺乏蛋白質編碼的能力，極小部分lncrna被證實可以編碼一些小肽段。研究發(fā)現(xiàn)lncrna可通過表觀遺傳、轉錄和轉錄后及代謝等多層面參與蛋白編碼基因和非蛋白編碼基因的表達調控。lncrna在正常細胞分化、發(fā)育及人類疾病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，包括惡性腫瘤。

惡性黑素瘤是來源于皮膚和其他器官黑色素細胞的腫瘤，惡性度高、轉移發(fā)生早，死亡率高，中晚期患者的5年生存率僅10％左右。近年來，中國人群惡性黑色素瘤發(fā)病率上升較快，深入研究其致病機制，具有重要的臨床意義和現(xiàn)實意義。黑色素瘤的發(fā)生是遺傳和環(huán)境因素長期相互作用的結果，如皮膚長時間暴露在陽光下，又如癌基因的活化與抑癌基因的失活。已知40-70％的黑色素瘤與癌基因braf的活化有關，其中brafv600e(exon15的1799位t→a，擷氨酸→谷氨酸)在中國人群的黑色素瘤中突變率高達83.3％。研究發(fā)現(xiàn)，靶向應用brafv600e抑制劑，如vemurafenib、sorafenib、trametinib和dabrafenib對惡性黑色素瘤的治療有較好療效。盡管如此，惡性黑色素瘤的復發(fā)和耐藥性的產(chǎn)生仍然是制約黑色素瘤臨床治療取得長足進步的兩大瓶頸。只有深入研究黑色素瘤發(fā)生發(fā)展機制，才可能為臨床治療黑色素瘤提供有力的指導和理論依據(jù)。

braf活化的非編碼rna(braf-activatednon-proteincodingrna，bancr)是一種與黑色素瘤發(fā)生發(fā)展密切相關的lncrna。該基因定位于染色體9q21.11，含4個外顯子，bancr是來自內含子的轉錄產(chǎn)物，長約693nt，在brafv600e突變的黑色素瘤細胞及黑色素瘤組織中高表達。體內外研究發(fā)現(xiàn)bancr可通過激活erk1/2和jnkmapk信號轉導通路參與黑色素瘤細胞的增殖調控，但是bancr與mapk信號轉導通路之間的關系尚未完全闡明。此外，研究還發(fā)現(xiàn)bancr可通過調控cxcl11基因的表達參與黑色素瘤細胞的遷移。鑒于bancr在惡性黑色素瘤中的表達具有組織特異性及穩(wěn)定性，可作為潛在的腫瘤診斷和腫瘤靶向治療的生物學標記物。

然而，在目前的國內外關于bancr和黑色素瘤相關性研究的報道中，均沒有將bancr過表達的人a375穩(wěn)定轉染細胞系作為進行黑色素瘤探索研究的實驗體系。

因此，特提出本發(fā)明。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種bancr過表達型人皮膚黑色素瘤穩(wěn)轉細胞株及其構建方法和應用，以彌補現(xiàn)有技術中的不足，為研究bancr在人黑色素瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的作用及機制提供研究基礎。

本發(fā)明提供了一種bancr過表達型人皮膚黑色素瘤穩(wěn)轉細胞株。

另外，本發(fā)明還提供了一種bancr過表達型人皮膚黑色素瘤穩(wěn)轉細胞株的構建方法，所述構建方法包括以下步驟：

(1)將bancr基因插入慢病毒載體系統(tǒng)中的表達載體中，得到攜帶有bancr基因的重組慢病毒載體；

(2)將所述攜帶有bancr基因的重組慢病毒載體與慢病毒載體系統(tǒng)中的包裝質?；旌希D染包裝細胞，得到攜帶有bancr基因的重組慢病毒；

(3)將所述攜帶有bancr基因的重組慢病毒轉染人皮膚黑色素瘤細胞，進行篩選和鑒定，得到所述bancr過表達型人皮膚黑色素瘤穩(wěn)轉細胞株。

進一步的，步驟(3)中，所述篩選采用抗生素或者流式細胞儀。

進一步的，步驟(3)中，所述鑒定采用熒光顯微鏡觀察和/或熒光定量pcr反應；所述熒光定量pcr反應包括提取待鑒定細胞的總rna，反轉錄為cdna，以所述cdna為模板進行熒光定量pcr。

進一步的，所述熒光定量pcr的引物為：

bancr-fo：5’-ctcgctttcactttatggattc-3’(seqidno：1)；

bancr-re：5’-gggtcaggggtctcttcag-3’(seqidno：2)。

進一步的，

所述熒光定量pcr的反應體系為：2×real-timepcrmastermix10μl，20μmbancr-fo0.1μl，20μmbancr-re0.1μl，cdna模板2μl，5u/μlrtaqdnapolymerase0.4μl，ddh2o補充至20μl；

所述熒光定量pcr的反應條件為：95℃3min預變性；95℃30s變性，62℃40s退火，共40個循環(huán)。

另外，本發(fā)明還提供了按照所述的構建方法得到的bancr過表達型人皮膚黑色素瘤穩(wěn)轉細胞株在建立黑色素瘤細胞模型、建立黑色素瘤動物模型、研究黑色素瘤發(fā)病機理以及研發(fā)治療黑色素瘤藥物中的應用。

本發(fā)明提供了bancr過表達型人皮膚黑色素瘤穩(wěn)轉細胞株，其構建方法是通過慢病毒系統(tǒng)將目的基因整合到宿主細胞中，并通過篩選和鑒定最終獲得了能夠高效、穩(wěn)定的過表達bancr基因的人皮膚黑色素瘤穩(wěn)轉細胞株。該細胞株可用于探究bancr與腫瘤的相關性及其機理，為深入研究bancr與人黑色素瘤發(fā)生、發(fā)展的可能機制提供一種可靠的研究基礎。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明具體實施方式或現(xiàn)有技術中的技術方案，下面將對具體實施方式或現(xiàn)有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實施方式，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為質粒lv5的物理圖譜；

圖2為pcr擴增的目的基因bancr的測序結果圖；

圖3a為重組慢病毒感染a375細胞的光學圖片(100×)；

圖3b為重組慢病毒感染a375細胞的熒光圖片(100×)

圖4為a375-nc-96h擴增曲線；

圖5為a375-bancr-oe-96h擴增曲線；

圖6為基因gapdh熔解曲線；

圖7為基因bancr熔解曲線；

圖8為qrt-pcr檢測瞬時轉染96h后a375細胞中bancr的表達結果圖；

圖9為空白對照組細胞圖片(200×)；

圖10為加入1μg/mlpuromycin一周后的細胞圖片(200×)；

圖11為加入2μg/mlpuromycin一周后的細胞圖片(200×)；

圖12為加入4μg/mlpuromycin一周后的細胞圖片(200×)；

圖13為qrt-pcr檢測穩(wěn)轉細胞株中bancr的表達結果圖。

具體實施方式

下面將結合實施例對本發(fā)明的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

本發(fā)明提供了一種bancr過表達型人皮膚黑色素瘤穩(wěn)轉細胞株，該細胞株是攜帶有bancr基因的人皮膚黑色素瘤細胞(a375細胞，來自于購自中國科學院上海生命科學研究所細胞資源中心)。

本發(fā)明還提供了bancr過表達型人皮膚黑色素瘤穩(wěn)轉細胞株的構建方法，包括以下步驟：

(1)將bancr基因插入慢病毒載體系統(tǒng)中的表達載體中，得到攜帶有bancr基因的重組慢病毒載體；

(2)將攜帶有bancr基因的重組慢病毒載體與慢病毒載體系統(tǒng)中的包裝質粒混合，轉染包裝細胞，得到攜帶有bancr基因的重組慢病毒；

(3)將攜帶有bancr基因的重組慢病毒轉染人皮膚黑色素瘤細胞，進行鑒定和篩選，得到bancr過表達型人皮膚黑色素瘤穩(wěn)轉細胞株。

在一個優(yōu)選的實施方式中，步驟(1)中的表達載體可以為lv5載體；步驟(2)中的包裝質粒為pgag/pol、prev和pvsv-g；步驟(3)中的鑒定采用熒光定量pcr法；步驟(3)中的篩選為采用1μg/mlpuromycin篩選一周，能夠正常存活的即為bancr過表達型人皮膚黑色素瘤穩(wěn)轉細胞株。

為了有助于更清楚的理解本發(fā)明的內容，現(xiàn)結合具體的實施例，對本發(fā)明提供的bancr過表達型人皮膚黑色素瘤穩(wěn)轉細胞株的構建方法進行詳細介紹。如無特別說明，實施例中應用的試劑為市售常規(guī)試劑。

實施例1bancr過表達型人皮膚黑色素瘤穩(wěn)轉細胞株的構建方法

一、人lncrnabancr基因全序列合成

選取lv5(lv5質粒的物理圖譜如圖1所示)作為過表達載體，設計合成人lncrnabancr基因序列(seqidno：7)所需的pcr引物，通過oligo在線軟件設計(http://www.oligo.net/)，上下游引物分別加上lv5載體上noti和nsii兩側同源序列，用于載體的亞克隆(引物由上海吉瑪制藥技術有限公司合成)，設計的引物如下：

bancr-f：

5’-agggttccaagcttaagcggccgcattcccttactttcttaataaac-3’(seqidno：3)

bancr-r：

5’-gatccatccctaggtagatgcattttttttttttttaggatttttta-3’(seqidno：4)

將合成的引物稀釋成50μm后，進行pcr反應，反應體系如下：人lncrnabancr模版1μl，10×pfubuffer(+mg²⁺)5μl，dntp1μl，上下游引物各1μl，ddh2o41μl，pfudnapolymerase0.3μl。循環(huán)條件如下：95℃3min(1cycle)；94℃30sec，55℃30sec，72℃30sec(30cycles)；72℃5min(1cycle)。pcr反應完成后，利用agarose電泳并切膠回收人lncrnabancr基因片段。

二、重組慢病毒載體構建

lv5載體雙酶切，在無菌的0.2mlep反應管，取lv5載體15μl，用noti和nsii雙酶切，酶切體系按照說明書配制，混勻后，37℃反應2h。并通過agarose電泳及dna凝膠回收試劑盒回收載體lv5。利用entryonestepcloningkit，將擴增回收好的片段，重組克隆到線性化的lv5載體中，反應體系如下：5×ceentrybuffer4μl，lv51μl，人lncrnabancr2μl，exnaseentry2μl，ddh2o11μl。使用移液器上下吹打上述混合物數(shù)次，輕輕混勻各組分。置于37℃反應30min。反應完成后立即將反應管置于冰水浴中，冷卻5min備用。

三、重組過表達載體轉化dh5α感受態(tài)細胞并鑒定

重組連接產(chǎn)物的轉化，將裝有感受態(tài)細胞的離心管冰上放置4min，待感受態(tài)細胞解凍后，加入10μl重組連接產(chǎn)物，輕柔混勻內容物，在冰中放置30min。將離心管放到預加溫到42℃的水浴鍋中放好的試管架上，放置90s，不要搖動離心管?？焖賹㈦x心管轉移到冰浴中，使細胞冷卻3min。向每支離心管加入800μllb培養(yǎng)基(不含抗生素)，然后將離心管轉移到37℃搖床，250rpm，培育45min使細菌復蘇。取200μl培育后的細胞均勻涂布于含50μg/mlampicillinlb平板上。等平板上液體被吸收后，將平板倒置于37℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)16h。從培養(yǎng)好的平板上挑取4個單獨、飽滿的菌落，置于含有5ml(含50μg/mlampicillin)lb培養(yǎng)基的試管中，將上述試管置于細菌搖床中培養(yǎng)，37℃，250rpm，培養(yǎng)16h。將培養(yǎng)好的菌液，用質粒小提試劑盒(天根生化，dp104-02)抽提質粒，將抽提好的質粒進行雙酶切鑒定。酶切37℃，1h后電泳，在目的條帶大小對應區(qū)域有酶切得到的條帶對應的克隆即為陽性克隆。取200μl陽性克隆對應的菌液送測序，并將剩余的菌液用甘油保存。將測序結果與目的基因序列進行比對，正確無誤，顯示重組載體構建成功，如圖2所示。此外，用保存的甘油菌液接菌lb培養(yǎng)基，進行大量質粒抽提，得到足夠量的重組過表達載體。

四、慢病毒包裝、收集及滴度檢測

病毒包裝：將對數(shù)生長期的293t細胞接種至15cm培養(yǎng)皿，加入18ml含10％fbs的dmem培養(yǎng)液，混勻后置于37℃，5％co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。次日，在一支無菌的5ml離心管中加入1.5ml無血清dmem，按比例加入含目的序列的重組過表達載體和包裝質粒(pgag/pol、prev、pvsv-g)，混勻，取另一支無菌的5ml離心管，加入1.5ml無血清dmem，再加入300μlrnai-mate，混勻，室溫放置5min后將兩管混合，室溫放置20～25min。除去15cm培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，加入8ml無血清的dmem培養(yǎng)液。將轉染混合物逐滴加入15cm培養(yǎng)皿中，輕輕地前后搖晃培養(yǎng)皿以混勻復合物，在37℃，5％co2培養(yǎng)箱中溫育4-6h。吸棄轉染液，加入18ml含10％fbs的dmem培養(yǎng)液，37℃，5％co2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)72h。

病毒收集：將培養(yǎng)皿中細胞上清液吸到50ml離心管中，4℃，4000rpm，4min。低速離心后，將離心管上清液倒入50ml注射器內，用0.45μm過濾器過濾。濾液在離心機中進行超速離心，4℃，20000rpm，2h。將濃縮液收集分裝至凍存管中。分裝的病毒液貼上標簽，-80℃冰箱保存。

病毒滴度檢測：取對數(shù)生長期的293t細胞，按3×10⁴個細胞/孔的濃度接種于96孔板，混勻后于37℃，5％co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。次日，將慢病毒原液10μl，用10％fbs的dmem培養(yǎng)液十倍稀釋3-5個梯度。吸去96孔板中的培養(yǎng)液，每孔加入100μl稀釋的病毒液，同時設立空白對照組，于37℃，5％co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。吸棄96孔板中的稀釋病毒液，每孔加入100μl10％fbs的dmem培液，于37℃，5％co2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)72h。通過熒光顯微鏡或facs計數(shù)熒光細胞，結合稀釋倍數(shù)計算病毒滴度。

五、慢病毒感染a375細胞

取對數(shù)生長期的a375細胞，按2.5×10⁵個細胞/孔的濃度接種于24孔板中，加入500μl完全培養(yǎng)液，37℃，5％co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜；次日，制備病毒稀釋液(dmem培養(yǎng)基400μl+終濃度5μlg/mlpolybrene)，將慢病毒原液按1:9加入到稀釋液中，配制三種不同濃度的病毒液，分別加入到各組對應的培養(yǎng)孔中，同時建立對照(blank,negative)，37℃，5％co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。12-24h移去細胞侵染后的病毒液，加入500μl完全培養(yǎng)液，37℃，5％co2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24-48h，在熒光倒置顯微鏡下觀察結果。培養(yǎng)48h后，熒光倒置顯微鏡下可見絕大多數(shù)細胞呈現(xiàn)較強的綠色熒光，提示重組慢病毒載體成功感染a375細胞，結果如圖3b所示。另外，圖3a為重組慢病毒感染a375細胞的非熒光的普通光學圖片。

六、實時熒光定量pcr檢測瞬時轉染后細胞內目的基因的表達量

細胞總rna提取：瞬時轉染96h后的細胞用depc處理的pbs漂洗一次，加入400μlrna裂解液重懸細胞；在裂解液中加入400μl異丙醇和30μl磁珠，顛倒混勻，室溫放置10分鐘，放置于磁力架上待磁珠完全吸附后吸棄液體，500μlrna抽提去蛋白液洗滌磁珠；再向離心管中加入500μl80％乙醇重懸磁珠，重復上述洗滌步驟1次，第二次洗滌待磁珠完全吸附后充分吸棄液體(不要有殘留)，室溫晾干5-10min；在無rna酶的1.5ml離心管用移液器配置以下dnasei反應液，將離心管從磁力架上取下，向離心管中加入75μldnasei反應液，移液器吹打重懸磁珠，37℃孵育15min，每隔5分鐘輕彈管底懸浮磁珠，以防磁珠成團。加入700μlrna抽提去蛋白液重懸磁珠，再加500μl80％乙醇重懸磁珠；待磁珠完全吸附后吸棄液體，室溫晾干2min。向離心管中加入50-100μl洗脫液eb，56℃孵育5分鐘，將離心管重新放置于磁力架上，待磁珠完全吸附后小心將總rna溶液轉移至新的離心管，放入-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

逆轉錄合成cdna：取總rna2ng-2μg，用reversetranscriptasem-mlv逆轉錄酶，按說明合成cdna。具體步驟：先在總rna中加入2μl隨機引物，加水(depc處理)補足至15μl，混勻，70℃溫育混合物5min后，冰上驟冷。再依次加入5×reactionbuffer4μl，10mmdntpsmix0.8μl，mmlvrtasernaseh(100u)0.5μl，42℃溫育45min，最后85℃加熱10min滅活反轉錄酶終止反應后冰上冷卻。反應液用作pcr模板。

熒光定量pcr：按說明書配置反應體系，上機進行pcr擴增和檢測。反應總體系為20μl，分別是2×real-timepcrmastermix10μl，上下游引物(20μm)各0.1μl，cdna模板2μl，rtaqdnapolymerase(5u/μl)0.4μl，用滅菌水補足至20μl。

其中，bancr基因熒光定量pcr引物序列如下：

bancr-fo：5’-ctcgctttcactttatggattc-3’(seqidno：1)

bancr-re：5’-gggtcaggggtctcttcag-3’(seqidno：2)

另外，還設計了gapdh基因的對照實驗組，其中gapdh基因熒光定量pcr引物序列如下：

gapdh-fo：5’-catgagaagtatgacaacagcct-3’(seqidno：5)

gapdh-re：5’-agtccttccacgataccaaagt-3’(seqidno：6)

反應條件95℃，3min預變性；循環(huán)內95℃，30s變性，62℃退火40s，共40個循環(huán)，并在每個循環(huán)延伸末收集熒光信號，繪制擴增曲線(圖4、5)，圖4、5分別顯示陰性對照病毒和過表達病毒瞬時轉染a375細胞96h后目的基因bancr的擴增曲線。40個循環(huán)后設置反應步驟(95℃15s，60℃30s，95℃15s)，并且對60℃到95℃升溫過程進行全程熒光信號收集，繪制熔解曲線(圖6、7)，圖6、7分別顯示基因gapdh和bancr的熔解曲線，可見上述兩個基因的熔解曲線僅顯示單一峰，說明設計的基因引物合格，無非特異擴增。用bio-radcfxmanagerversion1.6軟件進行數(shù)據(jù)分析，分析結果如圖8所示。

七、人lncrnabancr過表達的a375-bancr-oe穩(wěn)轉細胞株篩選及鑒定

最小致死濃度摸索：將處于對數(shù)生長期的a375細胞按1.5×10⁵細胞/孔的濃度接種于24孔培養(yǎng)板中，混勻后于37℃，5％co2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。完全培養(yǎng)基稀釋puromycin至4μg/ml，兩倍倍比稀釋，最小濃度為0.25μg/ml。將上述不同濃度的藥物換入24孔板中，同時設置blank孔，一周后觀察結果。用觀察到的細胞全部死亡孔中的最小濃度作為穩(wěn)篩株的篩選濃度。實驗結果表明，與空白對照組細胞(圖9)相比，在各細胞培養(yǎng)孔中分別加入濃度為1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml的puromycin一周后均可導致細胞全部死亡(如圖10、11和12所示)，故選擇1μg/ml的藥物濃度最為最小致死濃度。

a375-bancr-oe穩(wěn)轉細胞株的篩選：經(jīng)慢病毒侵染的a375細胞培養(yǎng)96h后，棄培養(yǎng)基，換含有1μg/mlpuromycin的抗性培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，持續(xù)篩選一周，然后用含0.5μg/mlpuromycin的抗性培養(yǎng)基繼續(xù)篩選培養(yǎng)。篩選獲得的細胞連續(xù)傳代3次以上，在熒光倒置顯微鏡下可見90％以上的細胞均表達較強的綠色熒光。

a375-bancr-oe穩(wěn)轉細胞株的鑒定：熒光定量pcr檢測a375-bancr-oe穩(wěn)轉細胞內bancrmrna表達水平，總rna提取、逆轉錄合成cdna和熒光定量pcr過程同前。鑒定結果如圖13所示。

此外，圖4和5中，橫坐標為“cyclenumber”，縱坐標為“deltarn”；圖6和圖7中，橫坐標為“temperature”，縱坐標為“-(df/dt)”。

另外，本發(fā)明還提供了bancr過表達型人皮膚黑色素瘤穩(wěn)轉細胞株的應用，該菌株能夠穩(wěn)定、高效的表達bancr基因，能夠作為黑色素瘤細胞模型，用于研究黑色素瘤的發(fā)病機理，或者用于篩選治療黑色素瘤的藥物。此外，用該細胞感染實驗動物后，能夠獲得bancr過表達的實驗動物，得到黑色素瘤動物模型，同樣能夠用于研究黑色素瘤的發(fā)病機理，或者用于篩選治療黑色素瘤的藥物。

最后應說明的是：以上各實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案，而非對其限制；盡管參照前述各實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，本領域的普通技術人員應當理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分或者全部技術特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應技術方案的本質脫離本發(fā)明各實施例技術方案的范圍。

sequencelisting

<110>昆明醫(yī)科大學

<120>bancr過表達型人皮膚黑色素瘤穩(wěn)轉細胞株及其制備方法和應用

<130>2017

<160>7

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

ctcgctttcactttatggattc22

<210>2

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

gggtcaggggtctcttcag19

<210>3

<211>47

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

agggttccaagcttaagcggccgcattcccttactttcttaataaac47

<210>4

<211>47

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

gatccatccctaggtagatgcattttttttttttttaggatttttta47

<210>5

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

catgagaagtatgacaacagcct23

<210>6

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

agtccttccacgataccaaagt22

<210>7

<211>688

<212>dna

<213>智人種(homosapiens)

<400>7

attcccttactttcttaataaactcgctttcactttatggattcaactgtaattctttct60

tgtgtgagatccaagaaccttcttgtagggtctggattgggacccttttctggtaacatc120

ttcctggtgaccatgaagggacaatactgaagagacccctgaccctaaggaaatagactg180

cagcaccaatgggccaactttggggcgatcatcttgcccagaaacatcatgttgaaactc240

ttggtcagaggttggatgaaagctgacagggtccatccaggagcaagtttgagccttgcc300

agttccattttgggtgctgagtggagtggcgactatagcaaacctgtgatctctggctgc360

tgctcagaagaaacaagagggagggatgaataatgtaaaactctggatcaatattctaat420

tctgagcctctattggaatcagctagcaaccacatatcagcttggtttcaacagtttccc480

agttcatgctgctgagaagttcagagtcaaacctgaatctcacctctgcaaagagcacag540

gactccatggcaaacgttgtatatacgcaagtcatccctggcaccacattgatttactgc600

accaggctttcttcattgtgatgatgttctctctcttttctaaaaaaaaaataaaaataa660

aatttaaaaaatcctaaaaaaaaaaaaa688