專利名稱：人工皮膚黑色素瘤組織的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人工皮膚黑色素瘤組織制作方法，特別是涉及以人皮膚角質(zhì)形成細胞、 黑色素瘤細胞及基質(zhì)材料制作皮膚黑色素瘤組織的方法。
技術(shù)背景惡性黑素瘤(malignantmelanoma， MM)是由皮膚和其它器官的黑素細胞系統(tǒng)所發(fā)生的 一種惡性程度相當高的腫瘤，容易發(fā)生轉(zhuǎn)移， 一般黑色素瘤患者預后較差，進展期患者平均生 存期僅有6 9個月，是一種嚴重威脅人們健康和生命的疾病。近年來，在全球范圍內(nèi)該病的 發(fā)病率呈逐年上升趨勢， 一般認為可能是由于對紫外線暴露增加的原因，也可能是多種因素 綜合作用導致的結(jié)果。目前，人們對惡性黑素瘤的發(fā)病原因和機制仍然不甚清楚，從而帶來 了診斷和治療的困難。為此，引起了醫(yī)學領(lǐng)域的高度關(guān)注，國內(nèi)外科學家對其發(fā)病機制、診斷 、治療方法的篩選，療效的驗證及腫瘤轉(zhuǎn)移的機制及其防治等諸多黑素瘤所涉及的相關(guān)因素 進行了大量研究和探索。圍繞這些問題的研究和實驗以往大多是在動物體內(nèi)進行的(Habib FA，Lobocki C， Ezhuthachan R， et al. Interferon (alpha)2b inhibits the murine melanoma cell line Cloudman S91 in vivo but not in vitro: a model for studying tumor cell-cytokine interactions/discussion. Am Surg 2001 ;67(3) :257-260; 牟霞， 陸洪光，等.B16小鼠惡性黑色素瘤模型的建立中華皮膚科雜志2004;37(10) :613 )。動物試驗 會造成大量動物死亡，并且實驗費用較高，實驗周期較長，消耗較大。近年來隨著人們普遍增 長的對動物的保護意識，用替代性人工腫瘤組織和器官等生物活組織材料進行黑素瘤的研究 成為必然。顯然，組織工程腫瘤器官的研究對于最終了解腫瘤的形成機制、腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn) 移，以及探索抗腫瘤方法或藥物都有可預期的廣闊前景及潛在的理論和實際應用價值。最近該領(lǐng)域的相關(guān)進展包括MaaserK(MolBiolcell， 1999; 10: 3067 — 3079)等報道用 異種來源的牛皮膚膠原構(gòu)建三維膠原基質(zhì)，并在此基礎(chǔ)上種植惡性黑色素瘤細胞取得成功。 EvesP (BritishJDermatol 2000; 140;210-22)等用人的去細胞的真皮組織(de-印idermized acellularhumandermis ，簡稱DED)作為基質(zhì)材料，體外培養(yǎng)黑色素瘤組織取得成功。我們用 人的去表皮的真皮組織(humande-印idermizedhumandermis ，簡稱HDED)接種MV3黑色素瘤種 子細胞體外構(gòu)建黑色素瘤體外模型取得成功(陸洪光;彭琳琳:一種黑色素瘤體外模型的制作 方法，申請?zhí)?00710201275. 1)。以往技術(shù)報告和發(fā)明在一定程度上提供了體外研究皮膚黑
色素瘤的組織器官模型，然而均在不同程度上存在一些不足，尚待進一步改進和完善1、 Maaser K所構(gòu)建的黑色素瘤組織選用的基質(zhì)材料是用異種牛皮提取的膠原，與人體組 織存在差異。2、 盡管EvesP用人的去細胞的真皮組織(DED)作為基質(zhì)材料，然而也有一些技術(shù)問題值得 商榷，比如(1)DED制作比較復雜，用lmol/L氯化鈉處理6 8小時后的真皮表面基底膜成分未有 檢測說明；(2)黑色素瘤種子細胞專屬于Ghanem's實驗室，來源受限；(3)在黑色素瘤種子細 胞種植過程中，為防止種子細胞脫離，需用特定金屬環(huán)固定，給實際操作帶來了不便，并且不 能確保種子細胞粘付于DED。3、 2007年我們提出的發(fā)明申請"一種黑色素瘤體外模型的制作方法"(申請?zhí)?200710201275. 1)，克服了以往技術(shù)的不足，制作出一種以人工皮膚為基質(zhì)材料的惡性黑色素 瘤體外模型，并實施用于腫瘤的侵襲性和轉(zhuǎn)移的研究，顯示了制作方法簡便、易操作、可重復性強、便于觀察、干預和調(diào)控性強等特點。但該模型存在種子細胞單一(僅有黑色素瘤細胞 ，缺乏表皮種子細胞)的情況，在憑估黑素瘤與表皮相互作用過程等有關(guān)的腫瘤形成機制時，缺 乏一定的表皮組織學支撐。這是因為皮膚由表皮，真皮及皮下組織組成。表皮在皮膚的最外層，主要由角質(zhì)形成細胞 (keratinocyte)及產(chǎn)生的角蛋白構(gòu)成。角質(zhì)形成細胞與表皮其它細胞(如黑素細胞，朗格漢斯 細胞)形成皮膚天然保護屏障，使人體免受各種有害物入侵，維持人體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定等方面起 重要作用。而原發(fā)性皮膚黑素瘤大多發(fā)生于表皮和真皮交界處， 一般來說瘤細胞在此處增生 ，形成微小瘤灶，穿過基底膜侵入真皮。因此，需要一種體外構(gòu)建的理想的皮膚黑色素瘤組織，該組織應當反映并呈現(xiàn)在體皮膚 黑色素瘤在表皮、基底膜及真皮的組織學特性。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種人工皮膚黑色素瘤組織的制作方法，以制作一 種以人皮膚角質(zhì)形成細胞及基質(zhì)材料的人工皮膚生長環(huán)境，其上接種惡性黑色素瘤細胞，構(gòu)建 人工皮膚黑色素瘤組織，為今后的抗腫瘤研究提供可以摸擬在體環(huán)境的人工皮膚黑色素瘤活 組織，以克服現(xiàn)有技術(shù)的存在的不足。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的基本方案是首先建立含有基底膜成分的三維基質(zhì)材料，即 人的去表皮的真皮組織(humande-印idermizedhumandermis ，簡稱HDED)，按照3: l的細胞比 例先后將角質(zhì)形成細胞、MV3惡性黑色素瘤細胞種植于HDED表面，通過液下培養(yǎng)和空氣一液 面培養(yǎng)相聯(lián)合的方式，使角質(zhì)形成細胞及黑色素瘤細胞在HDED生長，進一步構(gòu)建出含有人皮膚
角質(zhì)形成細胞的皮膚惡性黑色素瘤組織，最后用組織學及免疫組化技術(shù)方法觀察皮膚惡性黑 色素瘤組織生長情況。人的去表皮的真皮組織制備取健康成人皮膚標本，用PBS清洗標本表面附著物，常規(guī) 消毒，去除標本皮下脂肪組織層，制成lXlcm2的皮片，浸于56。CPBS中30分鐘，然后去除標 本表皮，將去除表皮的標本置于聚乙烯塑料瓶中，將塑料瓶密封后迅速置入液氮中5分鐘， 取出后室溫放置30分鐘，依此連續(xù)10個循環(huán)后，即得HDED基質(zhì)材料。人角質(zhì)形成細胞制備健康男性包皮環(huán)切術(shù)后的包皮。將新鮮標本浸入D-Hanks緩沖液 中，4"C保存?zhèn)溆茫?小時內(nèi)使用。將包皮在無菌條件下用PBS (含100u/ml青霉素和100u/ml 鏈霉素)沖洗5遍，眼科剪去除皮下脂肪組織，將包皮剪成約2mmX5mm皮條，浸入2. 5mg/ml Dispase酶中，4"C過夜，共消化16-17個小時。次日取出，PBS沖洗，分離表皮，用O. 25%胰 蛋白酶-O. 0P/。EDTA室溫下消化2 3min，含10。/。FBS的DMEM-F12 (3: 1)終止消化。離心 (1000r/min， 5min)，棄上清，PBS重混懸細胞，再離心，棄上清。K-SFM混懸，細胞計數(shù)板計 數(shù)，KC細胞密度為(5-6) X105/ml，接種于細胞培養(yǎng)瓶中。細胞培養(yǎng)箱中孵育(5%C02， 37°C )，24小時后首次換液。后2 3天換液一次。培養(yǎng)細胞達到70%-80%融合狀態(tài)時用0. 25%胰蛋 白酶-0. OP/。EDTA消化傳代，按(1-2) X 105/1111接種。人工皮膚黑色素瘤組織制備將HDED置于經(jīng)滅菌處理過的六孔板上，將濃度為2X 10Vml角質(zhì)形成細胞懸液接種于HDED表面，置于37。C、 5%(]02環(huán)境中孵育2小時，后加6. 7X 10"ml黑色素瘤細胞懸液于HDED面(角質(zhì)形成細胞/黑色素瘤細胞為3: 1)，細胞培養(yǎng)箱中靜 置3小時后，每孔加入5ml的完全培養(yǎng)基，進行液下培養(yǎng)，3天后改為氣液界面培養(yǎng)，37°C、 5%(]02環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)，每3天換液一次，連續(xù)培養(yǎng)12-15天，取出，進行黑素瘤組織學檢査上述所用的HDED基質(zhì)材料制備后放于-7(TC冰柜中無菌儲藏備用，應用前-7(TC， -20°C ，-4°C，室溫，依次解凍。在接種前浸于完全培養(yǎng)基中，在37'C、 57。C02環(huán)境中浸泡24小時 ，以便種子細胞接種后生長。上述角質(zhì)形成細胞培養(yǎng)基是角質(zhì)形成細胞無血清培養(yǎng)基(KC-SFM)，購于Gibco公司。由于角質(zhì)形成細胞要求量較大，為使角質(zhì)形成細胞增量生長，在角質(zhì)形成細胞無血清培養(yǎng) 基中加添加重組表皮生長因子和牛垂體提取物(Bovine Pituitary Extract, BPE)。上述過程中，取2-3代培養(yǎng)的角質(zhì)形成細胞，用胰酶常規(guī)消化下來后，用完全培養(yǎng)基制 成單細胞懸液，接種時角質(zhì)形成細胞懸液濃度為2Xl()5/ml，根據(jù)應用時實際情況進行細胞 濃度調(diào)整。
上述所用的黑色素瘤細胞是MV3黑色素瘤細胞。MV3黑素瘤細胞來源人的黑色素瘤的淋巴 結(jié)轉(zhuǎn)移灶細胞，是一個具有高度侵襲性的細胞株。黑色素瘤細胞培養(yǎng)基是RPMI-1640培養(yǎng)基 ，購于Gibco公司。由于黑色素瘤細胞要求量較大，在進行黑色素瘤細胞接種前，先進行黑色素瘤細胞的增量 生長培養(yǎng)，培養(yǎng)方法是將黑色素瘤細胞接種于加10。/。胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基/F12營養(yǎng)液( 3: 1)的完全培養(yǎng)基中，于37。C、 5%(]02環(huán)境中培養(yǎng)，每2天換液一次，待細胞長至80%融 合狀態(tài)時吸去完全培養(yǎng)基，以PBS液清洗兩遍，加入0.25%胰蛋白酶，輕搖培養(yǎng)瓶，消化貼 壁細胞l分鐘后加入完全培養(yǎng)基終止消化，吹打培養(yǎng)瓶壁上細胞，將含有細胞的混合液以800 轉(zhuǎn)/分的速度離心5分鐘收集黑色素瘤細胞，重懸于完全培養(yǎng)基中制成細胞懸液，分成3 4份 接種于無菌培養(yǎng)瓶中，于37。C、 5%(]02環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)至細胞的貼壁率為85%以上。人工皮膚黑色素瘤的完全培養(yǎng)基是DMEM培養(yǎng)基與F12營養(yǎng)液以3: l比例混合，加新鮮 10%胎牛血清制成。所述培養(yǎng)的黑色素瘤細胞，用胰酶常規(guī)消化下來后，用完全培養(yǎng)基制成單細胞懸液，接 種時濃度為6. 7X104/ml，根據(jù)應用時實際情況進行細胞濃度調(diào)整。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明在黑色素瘤制作過程中加入人皮膚角質(zhì)形成細胞，從而構(gòu)建了 更為貼近人皮膚微環(huán)境的黑色素瘤組織，經(jīng)組織學方法觀察顯示黑色素瘤細胞侵襲性生長更 加顯著，在HDED表面及真皮附屬器管腔內(nèi)中形成明顯瘤灶或瘤團，符合惡性黑色素瘤細胞在 人體皮膚真皮內(nèi)浸潤分布特點，并且反映黑素瘤組織細胞的標記物呈陽性反應，說明本發(fā)明 構(gòu)建的人工皮膚黑色素瘤組織能夠呈現(xiàn)在體皮膚黑色素瘤在表皮、基底膜及真皮的某些組織 學特性。
具體實施方式
具體實施例方式本發(fā)明用人皮膚角質(zhì)形成細胞及去表皮的真皮組織，其上接種惡性黑 色素瘤細胞，構(gòu)建人工皮膚黑色素瘤組織，其制作方法如下取健康成人皮膚標本，常規(guī)消毒，用眼科剪小心去除皮下脂肪組織層。將剩余組織制成 lXlcm2的皮片后浸于56。CPBS液中30分鐘。取出后用鑷子小心的撕去表皮。將去表皮的真皮 組織置于聚乙烯塑料瓶中，將其迅速置入液氮中5分鐘，取出后室溫放置30分鐘，再置入液 氮中5分鐘，依此方式連續(xù)10個循環(huán)后，即得HDED基質(zhì)材料。經(jīng)此處理后的HDED中細胞成分 被殺死，含有基底膜成分。接種前首先將HDED進行預處理，方法是浸于DMEM中，在37。C、 5%(]02環(huán)境中浸泡2處 待用；角質(zhì)形成細胞為取自健康男性包皮環(huán)切術(shù)后的包皮，通過Dispase酶分離表皮，胰蛋白 酶消化等步驟，得到表皮細胞懸液，用K-SFM角質(zhì)形成細胞培養(yǎng)基，在細胞培養(yǎng)箱中孵育 (5%C02， 37°C)角質(zhì)形成細胞，培養(yǎng)細胞達到70%-80%融合狀態(tài)時用0.25%胰蛋白酶 -0. 0P/。EDTA消化傳代。選2-3代角質(zhì)形成細胞進行接種，接種時將HDED置于經(jīng)滅菌處理過的 六孔板上，將濃度為2X10Vml角質(zhì)形成細胞懸液接種于HDED表面，置于37。C、 5%(]02環(huán)境中 孵育2小時，后加6. 7X 1()4/ml黑色素瘤細胞懸液于HDED面(使角質(zhì)形成細胞/黑色素瘤細胞為 3: 1)，細胞培養(yǎng)箱中靜置3小時后，每孔加入5ml的完全培養(yǎng)基，進行液下培養(yǎng)，3天后改為 氣液界面培養(yǎng)，37°C、 5%(]02環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)，每3天換液一次，連續(xù)培養(yǎng)12-15天后取出， 進行黑素瘤組織學及免疫組化學檢査。本發(fā)明對經(jīng)過如上方法制得的人工皮膚黑色素瘤組織學及免疫組化檢測1. 常規(guī)石蠟切片10%甲醛溶液固定標本，4'C過夜，梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟 ，包埋，石蠟連續(xù)切片，4ym，烘干。2. 蘇木素-伊紅染色組織切片浸于二甲苯、95%酒精中脫蠟，各兩次，5分鐘/次。蘇 木素浸染15min，流水沖洗，鹽酸酒精分化片刻，流水沖洗，氨水返藍片刻，流水沖洗，伊 紅酒精染色片刻，流水沖洗，選片，95%酒精分化兩次，5分鐘/次。烘干后封片。3. 免疫組化染色采用EnVision二步法測定S-100蛋白和HMB45的表達。脫蠟，熱修復 。蒸餾水漂洗，置于PBS中。滴加3%的11202阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，孵育10min。蒸餾水漂洗 ，置于TBS漂洗10min， 一抗(分別為兔抗人S-100和鼠抗人HMB45)孵育60min， TBS漂洗 10min。 二抗(分別為羊抗兔和羊抗鼠)孵育30min， TBS漂洗10min。 DAB顯色，蒸餾水漂洗 ，蘇木素復染，封片。人工皮膚黑色素瘤組織學及免疫組化檢測結(jié)果如下1. 蘇木素-伊紅染色結(jié)果在光學顯微鏡下觀察到MV3黑色素瘤細胞在HDED表面形成大小 不等的瘤灶，其間間雜少許角質(zhì)形成細胞。黑素瘤細胞穿過基底膜侵入真皮組織，在HDED底 面及側(cè)面，瘤細胞呈單個細胞的彌散狀浸潤。細胞核深染，瘤細胞核分裂多見，增殖明顯。在 皮膚附屬器管腔內(nèi)，瘤細胞呈帶狀、環(huán)形附著于管壁上，部分區(qū)域穿過管壁進入附屬器周邊 真皮組織。2. S-100蛋白免疫組化染色人工皮膚黑色素瘤組織中黑色素瘤細胞漿和胞膜均染成棕 黃色，顯示黑色素瘤S-100蛋白陽性表達。3. HMB45免疫組化染色人工皮膚黑色素瘤組織中黑色素瘤細胞漿和胞膜呈淺棕黃色， 顯示黑色素瘤HMB45弱陽性表達。結(jié)論蘇木素-伊紅染色顯示在HDED表面，附屬器管腔內(nèi)有大量黑素瘤細胞形成的瘤團
、瘤灶。并且黑素瘤細胞穿過基底膜侵入真皮組織內(nèi)，細胞核深染，瘤細胞核分裂多見，增殖 明顯。形態(tài)學的結(jié)果表明人工皮膚黑色素瘤組織構(gòu)建成功。S-100和HMB-45在醫(yī)學臨床上是用于診斷黑色素瘤的組織標記物。本發(fā)明顯示體外構(gòu)建的人工皮膚黑色素瘤組織表達s-ioo蛋白與HMB45，說明該發(fā)明構(gòu)建的黑色素瘤組織能夠反映在體黑素瘤的組織學標記特征。
權(quán)利要求
權(quán)利要求1一種人工皮膚黑色素瘤組織的制作方法，其特征在于首先在去表皮真皮組織上接種人皮膚角質(zhì)形成細胞和黑色素瘤細胞；然后采用液下培養(yǎng)和空氣—液面培養(yǎng)相聯(lián)合的方式，使角質(zhì)形成細胞及黑色素瘤細胞在HDED生長，構(gòu)建出含有人皮膚角質(zhì)形成細胞的皮膚惡性黑色素瘤組織；最后用組織學及免疫組化技術(shù)方法觀察皮膚惡性黑色素瘤組織生長情況。
2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的人工皮膚黑色素瘤組織的制作方法，其特征 在于在去表皮真皮組織上接種人皮膚角質(zhì)形成細胞與黑色素瘤細胞的比例為3: 1。
3.根據(jù)權(quán)利要求l所述的人工皮膚黑色素瘤組織的制作方法，其特征 在于液下培養(yǎng)和空氣一液面培養(yǎng)相聯(lián)合的方式是在5。/。C02、 37。C無菌條件下進行的，其操 作過程如下將HDED置于經(jīng)滅菌處理過的六孔板上，將濃度為2X105/ml角質(zhì)形成細胞懸液 接種于HDED表面，置于37。C、 5呢C02環(huán)境中孵育2小時，后加6. 7X 104/ml黑色素瘤細胞懸液于 HDED面，細胞培養(yǎng)箱中靜置3小時后，每孔加入5ml的完全培養(yǎng)基進行液下培養(yǎng)，3天后改為氣 液界面培養(yǎng)，37°C、 5 7。C02環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)，每3天換液一次，連續(xù)培養(yǎng)12-15天，取出后即 進行黑素瘤組織學檢査。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的人工皮膚黑色素瘤組織的制作方法，其 特征在于所述的黑色素瘤細胞是MV3黑色素瘤細胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求l所述的人工皮膚黑色素瘤組織的制作方法，其特征 在于去表皮真皮組織制備方法如下取健康成人皮膚標本，用PBS清洗標本表面附著物， 常規(guī)消毒，去除標本皮下脂肪組織層，制成lXlcm2的皮片，浸于56。CPBS中30分鐘，然后去 除標本表皮，將去除表皮的標本置于聚乙烯塑料瓶中，將塑料瓶密封后迅速置入液氮中5分 鐘，取出后室溫放置30分鐘，依此連續(xù)10個循環(huán)后，即得HDED基質(zhì)材料。
6.根據(jù)權(quán)利要求l所述的人工皮膚黑色素瘤組織的制作方法，其特征 在于人皮膚角質(zhì)形成細胞制備方法如下首先取健康男性包皮環(huán)切術(shù)后的包皮，將新鮮標 本浸入D-Hanks緩沖液中，4"C保存?zhèn)溆茫?小時內(nèi)使用；其次將包皮在無菌條件下用PBS沖洗 5遍，剪除皮下脂肪組織，并剪成約2mmX5mm皮條，浸入O. 25% Dispase酶中，4'C共消化16 -17個小時，次日取出后PBS沖洗，分離表皮，用0.25%胰蛋白酶-0.0P/。EDTA室溫下消化2 3min，含10。/。FBS的DMEM-F12 (3: 1)終止消化；然后進行離心(1000r/min， 5min)及棄上清 操作，PBS重混懸細胞，再離心、棄上清，使K-SFM混懸，細胞計數(shù)板計數(shù)，KC細胞密度為 (5-6) X105/ml，接種于細胞培養(yǎng)瓶中；置于細胞培養(yǎng)箱中孵育，24小時后首次換液，后2 3天換液一次，培養(yǎng)細胞達到70%-80%融合狀態(tài)時用0. 25%胰蛋白酶-0. OP/。EDTA消化傳代，按 (1-2) X105/ml接種。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的人工皮膚黑色素瘤組織的制作方法，其 特征在于所述接種的角質(zhì)形成細胞濃度為2X 105/ml，黑素瘤細胞濃度為6. 7X 104/ml。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的人工皮膚黑色素瘤組織的制作方法，其特征 在于所述的完全培養(yǎng)基是DMEM培養(yǎng)基與F12營養(yǎng)液以3: l比例混合，加新鮮10%胎牛血清配 制。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的人工皮膚黑色素瘤組織的制作方法，其特征 在于所述的HDED基質(zhì)材料制備后放于-7(TC冰柜中無菌儲藏備用，應用前-7(TC， -20°C， -4°C，室溫，依次解凍；在接種前浸于完全培養(yǎng)基中，在37'C、 5 7。C02環(huán)境中浸泡24小時。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種人工皮膚黑色素瘤組織制作方法，包括人皮膚角質(zhì)形成細胞及黑色素瘤細胞培養(yǎng)，生物基質(zhì)材料制備(HDED)，分別先后在生物基質(zhì)材料上接種人皮膚角質(zhì)形成細胞和黑色素瘤細胞，通過液下培養(yǎng)、空氣-液面孵育相聯(lián)合的方式，用一定的培養(yǎng)基在5％CO₂、37℃無菌條件下，培育和構(gòu)建皮膚黑色素瘤組織，用組織學及免疫組化技術(shù)方法觀察皮膚惡性黑色素瘤組織生長情況。本發(fā)明構(gòu)建了更為貼近人皮膚微環(huán)境的黑色素瘤組織，經(jīng)組織學方法觀察顯示黑色素瘤細胞侵襲性生長顯著，在HDED表面及真皮附屬器管腔內(nèi)中形成明顯瘤灶或瘤團，符合惡性黑色素瘤細胞在人體皮膚真皮內(nèi)浸潤分布特點，并反映黑素瘤組織細胞的標記物呈陽性反應。
文檔編號C12N5/08GK101392238SQ20081030550
公開日2009年3月25日 申請日期2008年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月12日
發(fā)明者卜曉琳, 陸洪光 申請人:陸洪光