本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種重組腺相關(guān)病毒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

阿爾茲海默癥(alzheimer’sdisease,ad)是一種漸進(jìn)性神經(jīng)退行疾病，又稱原發(fā)性老年癡呆癥。ad的臨床癥狀主要表現(xiàn)為漸進(jìn)性記憶障礙、認(rèn)知功能障礙和語言障礙等，是一種嚴(yán)重影響患病者社交與生活、給家庭和社會(huì)帶來沉重負(fù)擔(dān)的疾病。ad患者主要的病理特征為腦內(nèi)觀察到大量的老年斑(senileplaque,sp)和神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillarytangle,nft)，相應(yīng)地，ad病發(fā)目前最流行的是aβ淀粉樣蛋白級聯(lián)假說和tau蛋白異常磷酸化導(dǎo)致的神經(jīng)纖維纏結(jié)假說。

根據(jù)上述發(fā)病機(jī)理假說，近年來研究者對ad開發(fā)出不少新的藥物和治療方法，目前臨床上的治療方法主要有：影響膽堿系統(tǒng)功能藥物(包括膽堿酯酶抑制劑、ach受體激動(dòng)劑)；腦血循環(huán)改善劑；腦代謝激活劑；糾正鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)、抗氧化、抗炎藥物；神經(jīng)營養(yǎng)因子等。這些藥物治療機(jī)制不明確，也不確定是否產(chǎn)生確切療效，一部分甚至有很大的毒副作用。此外，這些藥物大多只能緩解ad的表面癥狀，不能防止ad的迅速發(fā)展。而某些在基礎(chǔ)研究中表現(xiàn)出防治ad作用的藥物，又因?yàn)椴灰淄高^血腦屏障而預(yù)測不到應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種重組腺相關(guān)病毒及其應(yīng)用。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種重組腺相關(guān)病毒，所述重組腺相關(guān)病毒由selp-h基因與腺病毒基因重組而成。

進(jìn)一步地，所述腺病毒為9型重組腺相關(guān)病毒載體。

進(jìn)一步地，所述重組腺相關(guān)病毒基因中攜帶有綠色熒光蛋白基因。

進(jìn)一步地，所述重組腺相關(guān)病毒的堿基序列為如seqidno.1所示。

本發(fā)明還提供了上述所述的重組腺相關(guān)病毒的應(yīng)用，所述應(yīng)用為將所述重組腺相關(guān)病毒用于制備防治阿爾茨海默癥的藥物或保健品。

進(jìn)一步地，所述藥物或保健品中所述重組腺相關(guān)病毒的含量為500-2000pfu/ml。

進(jìn)一步地，所述藥物或保健品用于調(diào)控阿爾茨海默癥患者腦內(nèi)金屬離子的濃度。

進(jìn)一步地，所述金屬離子包括cu²⁺、zn²⁺和fe²⁺，所述cu²⁺的濃度為200-400μmol/l，所述zn²⁺的濃度為500-1500μmol/l，所述fe²⁺的濃度為500-1500μmol/l。

本發(fā)明還提供了上述所述的重組腺相關(guān)病毒的應(yīng)用，所述應(yīng)用為將所述重組腺相關(guān)病毒用于制備調(diào)控動(dòng)物腦內(nèi)金屬離子的含量的片劑、注射劑、膠囊劑、顆粒劑、丸劑、微丸、散劑、滴丸劑、湯劑、糖漿劑、合劑、煎膏劑或浸膏劑劑型的藥物或保健品。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，有益效果在于：本發(fā)明實(shí)施例提供的重組腺相關(guān)病毒，由selp-h基因與腺病毒基因重組而成，所述重組腺相關(guān)病毒可在動(dòng)物腦內(nèi)特定區(qū)域穩(wěn)定表達(dá)。重組腺相關(guān)病毒可以提高動(dòng)物腦內(nèi)尼氏小體的數(shù)量；降低患ad動(dòng)物腦內(nèi)gsk3β和磷酸化的蛋白水平，同時(shí)提高pp2a的表達(dá)量；提高神經(jīng)突觸相關(guān)蛋白的表達(dá)量。本發(fā)明實(shí)施例提供的重組腺相關(guān)病毒通過以上作用，起到調(diào)控腦內(nèi)多種金屬離子的含量和分布。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例2提供的重組腺相關(guān)病毒在小鼠海馬區(qū)的感染效果的結(jié)果示意圖；

圖2是本發(fā)明實(shí)施例3提供的morris水迷宮檢測的selp-h對ad模型小鼠的空間探索和記憶能力的影響的結(jié)果示意圖；

圖3是本發(fā)明實(shí)施例4提供的以硫黃素t染色檢測的selp-h對ad模型小鼠腦內(nèi)老年斑數(shù)量的影響的結(jié)果示意圖；

圖4是本發(fā)明實(shí)施例5提供的以尼氏染色檢測的selp-h對ad模型小鼠腦內(nèi)神經(jīng)元功能的影響的結(jié)果示意圖；

圖5是本發(fā)明實(shí)施例6提供的通過icp-ms檢測的selp-h對ad模型小鼠腦內(nèi)金屬離子含量的影響的結(jié)果示意圖，其中圖5a是關(guān)于鋅離子，圖5b是關(guān)于鐵離子，圖5c是關(guān)于錳離子，圖5d是關(guān)于釩離子。

圖6是本發(fā)明實(shí)施例7提供的通過xrf檢測selp-h對ad模型小鼠腦內(nèi)金屬離子含量和分布的影響的結(jié)果示意圖；

圖7是本發(fā)明實(shí)施例8提供的以免疫印跡檢測selp-h對ad模型小鼠腦內(nèi)tau蛋白過度磷酸化狀況的影響(gsk3β，pp2a，磷酸化tau)的結(jié)果示意圖，其中圖7a是與tau蛋白磷酸化相關(guān)的蛋白的wb條帶，圖7b是對ad模型小鼠腦內(nèi)對ptau404的影響的結(jié)果示意圖，圖7c是對ad模型小鼠腦內(nèi)對ptau-422的影響的結(jié)果示意圖，圖7d是對ad模型小鼠腦內(nèi)對gsk3β的影響的結(jié)果示意圖，圖7e是對ad模型小鼠腦內(nèi)對pp2a的影響的結(jié)果示意圖；

圖8是本發(fā)明實(shí)施例9提供的以免疫印跡檢測selp-h對ad模型小鼠腦內(nèi)突觸相關(guān)蛋白及腦源性生長因子(bdnf)的影響的結(jié)果示意圖，其中圖8a是突觸功能相關(guān)蛋白的wb條帶，圖8b是對ad模型小鼠腦內(nèi)對psd95的影響的結(jié)果示意圖，圖8c是對ad模型小鼠腦內(nèi)對synaptophysin-1的影響的結(jié)果示意圖，圖8d是對ad模型小鼠腦內(nèi)對bdnf的影響的結(jié)果示意圖。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

本發(fā)明實(shí)施例提供了一種重組腺相關(guān)病毒，所述重組腺相關(guān)病毒由selp-h基因與腺病毒基因重組而成。

本發(fā)明實(shí)施例提供的重組腺相關(guān)病毒，由selp-h基因與腺病毒基因重組而成，所述重組腺相關(guān)病毒可在動(dòng)物腦內(nèi)特定區(qū)域穩(wěn)定表達(dá)。重組腺相關(guān)病毒可以提高動(dòng)物腦內(nèi)尼氏小體的數(shù)量；降低患ad動(dòng)物腦內(nèi)gsk3β和磷酸化的蛋白水平，同時(shí)提高pp2a的表達(dá)量；提高神經(jīng)突觸相關(guān)蛋白的表達(dá)量。本發(fā)明實(shí)施例提供的重組腺相關(guān)病毒通過以上作用，起到調(diào)控腦內(nèi)多種金屬離子的含量和分布。

具體地，所述腺病毒為9型重組腺相關(guān)病毒載體(recombinantadeno-associatedvirus9,raav9)。

具體地，所述重組腺相關(guān)病毒的堿基序列如下：

aggtttcagagcatattcctgtttatcaacaagaagaaaaccaaacagatgtctggactcttttaaatggaagcaaagatgacttcctcatatatgatagatgtggccgtcttgtatatcatcttggtttgcctttttccttcctaactttcccatatgtagaagaagccattaagattgcttactgtgaaaagaaatgtggaaactgctctctcacga。

具體地，所述重組腺相關(guān)病毒基因中攜帶有綠色熒光蛋白基因。

本發(fā)明實(shí)施例還提供了上述所述的重組腺相關(guān)病毒的應(yīng)用，所述應(yīng)用為將所述重組腺相關(guān)病毒用于制備防治阿爾茨海默癥的藥物或保健品。

具體地，所述藥物或保健品中所述重組腺相關(guān)病毒的含量為500-2000pfu(plaque-formingunit，空斑形成單位)/ml，優(yōu)選1000pfu/ml。

具體地，所述藥物或保健品用于調(diào)控阿爾茨海默癥患者腦內(nèi)金屬離子的濃度。所述金屬離子包括cu²⁺、zn²⁺和fe²⁺，所述cu²⁺的濃度為200-400μmol/l，優(yōu)選393μmol/l，所述zn²⁺的濃度為500-1500μmol/l，優(yōu)選1055μmol/l，所述fe²⁺的濃度為500-1500μmol/l，優(yōu)選940μmol/l。

經(jīng)本研究表明，腦內(nèi)金屬離子代謝失衡與ad的發(fā)病密切。如cu²⁺和zn²⁺，可以誘導(dǎo)aβ聚集形成淀粉樣斑塊。此外具有氧化還原能力的金屬離子如cu²⁺可與aβ相互作用，產(chǎn)生ros并引起氧化應(yīng)激作用，進(jìn)而造成神經(jīng)元功能喪失，加劇ad的病理損傷。cu²⁺和zn²⁺誘導(dǎo)的aβ聚集是可逆的，比如aβ的聚集和解聚可以被金屬螯合劑如氯碘羥喹等調(diào)控。調(diào)節(jié)腦內(nèi)金屬離子代謝時(shí)可以選擇螯合能力適中的螯合劑，這樣能在不擾亂體內(nèi)其他金屬離子平衡的同時(shí)達(dá)到調(diào)節(jié)目的。

本發(fā)明實(shí)施例還提供了上述所述的重組腺相關(guān)病毒的應(yīng)用，所述應(yīng)用為將所述重組腺相關(guān)病毒用于制備調(diào)控動(dòng)物腦內(nèi)金屬離子的含量的片劑、注射劑、膠囊劑、顆粒劑、丸劑、微丸、散劑、滴丸劑、湯劑、糖漿劑、合劑、煎膏劑或浸膏劑劑型的藥物或保健品。

以下通過具體實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步說明。

實(shí)施例1制備重組腺相關(guān)病毒

一、所用試劑：

1.293細(xì)胞；

2.重組好的腺病毒質(zhì)粒；

3.3.paci限制性內(nèi)切酶；

4.質(zhì)粒回收相關(guān)試劑；

5.細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染相關(guān)試劑；

6.tbs：10mmtris,0.9％nacl，ph8.1；

7.40％cscl：28.45gcscl溶于42.7ml的tbs中，4度保存；

8.15％cscl：9.085gcscl溶于47.69ml的tbs中，4度保存；

9.beckman離心管：14*89mm，sw41轉(zhuǎn)頭；

10.polybrene(sigma)，10mg/ml；

11.透析袋：spectrumco.(成卷供應(yīng)，帶少量甘油，硫化物與重金屬)，mw＝8000～14400；

12.滅菌甘油。

二、操作流程：

1.293細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前24小時(shí)接種于1或2個(gè)60mm培養(yǎng)盤中，使之在轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞匯合率為50-70％；

2.在轉(zhuǎn)染前，用paci處理目的質(zhì)粒(一般一個(gè)60mm細(xì)胞盤需要6μgdna)。處理后質(zhì)粒用乙醇沉淀并重懸于20μl無菌水中；

3.用pei或其他轉(zhuǎn)染試劑將6μgpaci處理過的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞；

4.8個(gè)小時(shí)后移去混合液，加入4mldmem完全培養(yǎng)液(10％cbs，1％pen/strep)；

5.在轉(zhuǎn)染后7到10天用細(xì)胞刮(而不是胰酶)將細(xì)胞從瓶中刮下并移入50ml錐形管。離心后將細(xì)胞重懸于2.0mlpbs或全培液中。于液氮中凍結(jié)細(xì)胞，37℃水浴中溶解，劇烈振蕩。此步驟共進(jìn)行4次。注意保存時(shí)不要反復(fù)凍融，可保存于-20℃；

6.將293細(xì)胞以50-70％的匯合率鋪于60mm培養(yǎng)盤中，以30-50％的體積比加入含病毒上清液。在感染后2-3天即可看到明顯的細(xì)胞裂解或cpe現(xiàn)象；

7.在有1/3到1/2的細(xì)胞脫離漂浮時(shí)，通常是感染后3-5天收集病毒?？蛇M(jìn)一步通過westernblot或pcr(5μl病毒上清加上10μlpcr-gradeproteasek，55℃消化1小時(shí)，然后煮沸樣品5min，離心后取1-2μl進(jìn)行pcr反應(yīng))證實(shí)重組腺病毒的存在；

8.按步驟5的方法收集病毒上清。在這種情況下一般至少可收集到10⁷infectiousparticles/ml的病毒。每輪的擴(kuò)增應(yīng)能提高一個(gè)數(shù)量級的梯度；

9.為了進(jìn)一步擴(kuò)增，將步驟8獲得的病毒上清進(jìn)一步感染100mm培養(yǎng)盤的細(xì)胞，按步驟5的方法收集病毒，并進(jìn)而將其感染150mm細(xì)胞培養(yǎng)盤中的293細(xì)胞，以獲得足夠量的病毒；

10.將15％cscl和40％cscl加入beckman離心管中制備cscl梯度溶液；

11.將最終富集病毒顆粒的病毒上清滴加于cscl梯度溶液上；

12.超速離心，30000rpm，4度離心16個(gè)小時(shí)；

13.離心后，應(yīng)有兩條帶。位置較高，顏色較弱的條帶主要為腺病毒空殼，不具感染能力；位置較低，顏色較亮的條帶含有我們需要收集的活病毒顆粒。用16號針頭將這一條帶收集；

14.在tbs中透析一小時(shí)，隨后在含有10％甘油的tbs中透析兩次，每次一小時(shí)；

15.將純化的腺病毒分裝于ep管中；

16.在eppendorfbiophotometer中測量透析液中的總蛋白量，1μg病毒蛋白相當(dāng)于4×10⁹病毒顆粒；

17.長期保存于-70度中，短期可保存于4度，切忌反復(fù)凍溶；

18.由于腺病毒對不同細(xì)胞株的感染效率存在差異，且考慮到病毒顆粒的細(xì)胞毒副作用，通常通過梯度感染的方法確定所需的病毒用量。以相對細(xì)胞數(shù)1：1，10：1，100：1，1000：1的病毒顆粒感染靶細(xì)胞；加入相對培養(yǎng)液體積1：1000的polybrene。在37度下平板離心30分鐘；

19.感染8～12小時(shí)后換液。將含有病毒的培養(yǎng)液小心移入含有消毒液的廢液缸中，加入適量全培液；獲得重組腺相關(guān)病毒。

實(shí)施例2通過腦立體定位注射含selp-h基因的重組腺相關(guān)病毒到小鼠海馬ca3區(qū)

將3月齡模型小鼠用10％水合氯醛(3.5mg/kg)腹腔注射麻醉，并固定于立體定位儀上，剪去頭部毛發(fā)，75％酒精消毒處理，沿頭頂正中線縱行切開頭皮，實(shí)驗(yàn)組用微量注射器注射2μl的帶selp-h及綠色熒光蛋白基因的重組腺相關(guān)病毒raav9-gfp-selp-h，(坐標(biāo)為x＝±2.30mm，y＝-2.18mm，z＝-2.10mm)，注射時(shí)間4min，注射速度0.5μl/min?？瞻讓φ战M采用同樣方法射等量的對照腺病毒raav9-gfp。術(shù)后繼續(xù)飼養(yǎng)，術(shù)后1個(gè)月、3個(gè)月分別殺鼠以腦組織的熒光強(qiáng)度確定蛋白表達(dá)情況。

圖1是重組腺相關(guān)病毒在小鼠海馬區(qū)的感染效果的結(jié)果示意圖。從圖1中可以看出，重組腺相關(guān)病毒中攜帶綠色熒光蛋白基因。注射1個(gè)月后的鼠腦切片顯示出海馬區(qū)有高亮的綠色熒光，表明raav的感染效果良好。注射后3個(gè)月熒光勉強(qiáng)可見，說明還有細(xì)微的表達(dá)量，但是水平已經(jīng)很低，raav的表達(dá)時(shí)間可持續(xù)到注射3個(gè)月。

實(shí)施例3morris水迷宮檢測selp-h對ad模型小鼠的空間探索和記憶能力的影響

實(shí)驗(yàn)小鼠：分為四組，一組為7月齡注射raav9-gfp的野生型小鼠，一組7月齡注射raav9-selp-h的野生型小鼠，一組為7月齡注射raav9-gfp的ad模型小鼠，一組7月齡注射raav9-selp-h的ad模型小鼠。每組20只。

morris水迷宮實(shí)驗(yàn)分為定位航行及空間探索兩部分。其中定位航行歷時(shí)5天，空間探索兩天。定位航行第一天為訓(xùn)練期，將小鼠置于平臺(tái)上適應(yīng)10s，隨后將小鼠從不同象限的對應(yīng)位置面壁放入池內(nèi)，小鼠登上平臺(tái)2s后終止記錄，最長記錄時(shí)間為60s，若小鼠在60s內(nèi)不能上臺(tái)，引導(dǎo)其登上平臺(tái)適應(yīng)10s。定位航行第二天到第五天為檢測期?？臻g探索分為24小時(shí)記憶和72小時(shí)記憶：是從定位航行結(jié)束開始計(jì)時(shí)，將平臺(tái)撤去，記錄小鼠在原平臺(tái)所在象限停留時(shí)間及跨越原平臺(tái)的次數(shù)。

圖2是通過morris水迷宮檢測的selp-h對ad模型小鼠的空間探索和記憶能力的影響的結(jié)果示意圖。水迷宮的訓(xùn)練過程可以評估小鼠的學(xué)習(xí)能力。在定位航行試驗(yàn)中，3×tgad的對照組小鼠從第一天至第五天的訓(xùn)練中，測得的逃避潛伏期均比野生型小鼠長，并在第一天和第五天表現(xiàn)出有顯著性(^#p<0.05，^##p<0.01；n＝20)；而接受selp-h治療的3×tgad小鼠在注射后4個(gè)月，即7月齡時(shí)，其在不同檢測時(shí)間點(diǎn)逃避潛伏期均表現(xiàn)出下降，并在第二天與對照組相比具有顯著性(*p<0.05；n＝20)，甚至略略優(yōu)于野生型小鼠的表現(xiàn)。從圖2中可以看出，隨著學(xué)習(xí)天數(shù)增加，小鼠的逃避潛伏期時(shí)長在下降。兩組非轉(zhuǎn)基因的野生型小鼠的逃避潛伏期整體低于轉(zhuǎn)基因的ad模型小鼠。加了selp-h表達(dá)的ad模型鼠逃避潛伏期整體低于對照組，并在第2天和第5天表現(xiàn)出顯著性(ng：非轉(zhuǎn)基因的野生型；tg：轉(zhuǎn)基因的ad模型小鼠)。由此說明，本發(fā)明實(shí)施例提供的重組腺相關(guān)病毒可以顯著提高患ad動(dòng)物的空間探索和記憶能力。

實(shí)施例4以硫黃素t染色檢測selp-h對ad模型小鼠腦內(nèi)老年斑數(shù)量的影響

取小鼠新鮮大腦組織于4％多聚甲醛固定24小時(shí)，30％蔗糖脫水48小時(shí)以上，以oct包埋于20℃中切成16μm的冰凍切片。切片自來水洗后入蒸餾水，置入1％硫磺素t染液浸染30min，迅速蒸餾水洗，用抗熒光淬滅封片劑。在熒光顯微鏡下經(jīng)488nm波長的光源激發(fā)，觀察陽性染色并拍照。

圖3是以硫黃素t染色檢測的selp-h對ad模型小鼠腦內(nèi)老年斑數(shù)量的影響的結(jié)果示意圖。如圖所示，染老年斑中，ad模型小鼠的陽性染色數(shù)量要多于野生型。提高selp-h表達(dá)的ad模型小鼠的陽性染色變少了(ng：非轉(zhuǎn)基因的野生型；tg：轉(zhuǎn)基因的ad模型小鼠)?？梢?，與野生型兩組相比，ad對照組有更高的老年斑含量。而加入selp-h干預(yù)后的ad鼠，其老年斑的含量變少了，觀察起來更加像是野生型，所以selp-h可以減少ad模型小鼠腦內(nèi)老年斑數(shù)量。由此可以確定，本發(fā)明實(shí)施例提供的重組腺相關(guān)病毒可以起到減少患ad動(dòng)物的老年斑的作用。

實(shí)施例5以尼氏染色檢測selp-h對ad模型小鼠腦內(nèi)神經(jīng)元功能的影響

取小鼠新鮮大腦組織于4％多聚甲醛固定24小時(shí)，30％蔗糖脫水48小時(shí)以上，以oct包埋于20℃中切成16μm的冰凍切片。切片自來水洗后入蒸餾水，尼氏(nissl)染色液染色染色15分鐘。蒸餾水洗滌2次(每次數(shù)秒鐘即可)。95％乙醇約5秒。換用新鮮的95％乙醇再脫水2分鐘。二甲苯透明5分鐘。換用新鮮的二甲苯，再透明5分鐘。用中性樹膠劑封片，顯微鏡下觀察，細(xì)胞呈現(xiàn)斑駁的藍(lán)紫色染色。

尼氏小體是神經(jīng)元發(fā)揮正常生理功能的必要結(jié)構(gòu)，圖4是以尼氏染色檢測的selp-h對ad模型小鼠腦內(nèi)神經(jīng)元功能的影響的結(jié)果示意圖。如圖所示，野生型兩組的小鼠海馬形態(tài)清晰，細(xì)胞排列整齊，神經(jīng)元的形態(tài)正常，尼氏體明顯。而ad模型小鼠海馬形態(tài)受損，組織結(jié)構(gòu)松散，神經(jīng)元明顯缺失，尼氏體分布稀疏。而經(jīng)過selp-h治療后的ad小鼠，保留的尼氏體數(shù)量非常明顯地增多，甚至比野生型更加稠密，海馬的形態(tài)也十分清晰。可見，ad模型小鼠中的尼氏小體相比起野生型更少，提高selp-h表達(dá)的ad小鼠的尼氏小體增多了(ng：非轉(zhuǎn)基因的野生型；tg：轉(zhuǎn)基因的ad模型小鼠)。從圖4中可以看出，selp-h增加了ad模型小鼠腦內(nèi)尼氏小體數(shù)量的結(jié)果。由此可以看出，本發(fā)明實(shí)施例提供的重組腺相關(guān)病毒可以促進(jìn)ad動(dòng)物腦內(nèi)神經(jīng)元功能。

實(shí)施例6icp-ms檢測selp-h對ad模型小鼠腦內(nèi)金屬離子含量的影響

所有器皿及消化罐均須先以20％硝酸浸泡24小時(shí)，然后用自來反復(fù)沖洗，最后用超純水沖洗干凈。

殺鼠取腦組織，稱取一定量質(zhì)量的組織，置于玻璃試管中，加入90μl純硝酸在60℃中處理25小時(shí)。用超純水定容到5ml，蓋上密封蓋，放入微波消解儀中，微波消解儀功率和加熱時(shí)間調(diào)至最佳程序，消解結(jié)束后，冷卻至室溫，混勻，使用icp-ms檢測樣品中cu，fe，zn等金屬離子。同時(shí)做試劑空白對照。

圖5是通過icp-ms檢測的selp-h對ad模型小鼠腦內(nèi)金屬離子含量的影響的結(jié)果示意圖。如圖所示，在ad模型小鼠中，海馬區(qū)zn、fe等金屬離子濃度發(fā)生了紊亂，表現(xiàn)明顯不同于野生型。與野生型對比，ad模型鼠的海馬中的zn離子、fe離子、mn離子及v離子水平顯著更高，而在selp-h的治療之后顯著下降了。提高了selp-h表達(dá)之后，金屬離子的濃度趨向于恢復(fù)到野生型的狀態(tài)。由此可知，本發(fā)明實(shí)施例提供的重組腺相關(guān)病毒可以起到調(diào)控ad動(dòng)物腦內(nèi)金屬離子濃度的作用，從而可以起到治療ad的效果。

實(shí)施例7xrf檢測selp-h對ad模型小鼠腦內(nèi)金屬離子含量和分布的影響

實(shí)驗(yàn)小鼠通過腹腔乙醚麻醉，處死。取腦組織以4％的多聚甲醛24小時(shí)以上，30％的蔗糖脫水48小時(shí)。oct包埋后以冷凍切片機(jī)進(jìn)行冠狀切片，厚度50μm。將切片貼到3m膠帶備用。樣品采用上海第三代同步輻射光源bll5u1(硬x微聚焦及應(yīng)用光束線)試驗(yàn)站的sr-xrf進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)時(shí)，樣品放置在7軸樣品臺(tái)上，7軸樣品臺(tái)的x、y、z掃描時(shí)的精度可達(dá)0.1μm。采用光學(xué)顯微鏡對樣品進(jìn)行定位，掃描整個(gè)海馬區(qū)及部分皮層區(qū)。儀器工作條件為：入射光能量12.0kev，與樣品成45度角，光斑大小調(diào)節(jié)為100μm×100μm，步長(x、y兩個(gè)方向)為100μm。每點(diǎn)掃描時(shí)間為2s，si(li)探測器采集熒光。采用geopixe(csiro,australia)軟件從能量分散圖譜提取各種金屬元素在每個(gè)象素點(diǎn)的熒光計(jì)數(shù)，并以igorpro(wavemetrics,usa)軟件作圖。

圖6是通過xrf檢測的selp-h對ad模型小鼠腦內(nèi)金屬離子含量和分布的影響的結(jié)果示意圖。如圖所示，與野生型兩組小鼠相比，銅在ad鼠海馬區(qū)的分布更少。而selp-h治療后的ad模型鼠腦內(nèi)銅的含量顯著回復(fù)，表現(xiàn)更加趨近于野生型。與銅在小鼠腦內(nèi)的分布不一樣，鋅在齒狀回和海馬區(qū)有明顯的分布，且在ad模型鼠的海馬區(qū)有高度的富集，類似地，selp-h的治療減輕了ad鼠腦中鋅的富集。鐵的分布在整個(gè)鼠腦中都比較均勻，而且四組間的表現(xiàn)并沒有很大差異。從圖中可以看出，ad鼠異于野生型小鼠，而提高selp-h表達(dá)能使這種異常變小(wg：野生型；wp：野生型+selp-h；ag：ad模型小鼠；ap：ad模型小鼠+selp-h)。這進(jìn)一步證實(shí)了本發(fā)明實(shí)施例提供的重組腺相關(guān)病毒可以起到調(diào)控ad動(dòng)物腦內(nèi)金屬離子濃度的作用，從而可以起到治療ad的效果。

實(shí)施例8以免疫印跡檢測selp-h對ad模型小鼠腦內(nèi)tau蛋白過度磷酸化狀況的影響(gsk3β,pp2a,磷酸化tau)

1、以注射raav9-selp-h的小鼠腦組織為實(shí)驗(yàn)組，以注射raav9-gfp的小鼠腦組織對照組。

2、制作蛋白勻漿，提蛋白。

3、蛋白定量。

4、進(jìn)行sds-聚丙烯酸胺凝膠電泳。

5、切膠轉(zhuǎn)膜。

6、5％脫脂牛奶封閉。

7、用相應(yīng)的一抗孵育。

8、二抗孵育。

9、顯影并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

圖7是以免疫印跡檢測的selp-h對ad模型小鼠腦內(nèi)tau蛋白過度磷酸化狀況的影響(gsk3β，pp2a，磷酸化tau)的結(jié)果示意圖。如圖所示，與野生型(wt)相比ad鼠的海馬區(qū)中ptau-404、ptau-422均顯著上升，在經(jīng)過selp-h治療之后顯著下降。對圖7a中g(shù)sk3β條帶的定量分析，與野生型(wt)相比ad鼠的海馬區(qū)中g(shù)sk3β顯著上升，在經(jīng)過selp-h治療之后顯著下降；對圖7a中pp2a條帶的定量分析，與野生型(wt)相比ad鼠的海馬區(qū)中g(shù)sk3β顯著下降，在經(jīng)過selp-h治療之后顯著上升。ad模型小鼠中，gsk3β和磷酸化的蛋白水平會(huì)相比起野生型提高，而pp2a的表達(dá)量則降低，提高selp-h表達(dá)可以緩解這些情況。可見，本發(fā)明實(shí)施例提供的重組腺相關(guān)病毒可以起到降低患ad動(dòng)物腦內(nèi)gsk3β和磷酸化的蛋白水平，同時(shí)提高pp2a的表達(dá)量。

實(shí)施例9以免疫印跡檢測selp-h對ad模型小鼠腦內(nèi)突觸相關(guān)蛋白及腦源性生長因子(bdnf)的影響

方法同實(shí)施例8。

圖8是以免疫印跡檢測的selp-h對ad模型小鼠腦內(nèi)突觸相關(guān)蛋白及腦源性生長因子(bdnf)的影響的結(jié)果示意圖。如圖所示，對圖8a中psd95條帶的定量分析，與野生型(wt)相比ad鼠的海馬區(qū)中psd95顯著下降，在經(jīng)過selp-h治療之后顯著上升；對圖8a中synaptophysin-1條帶的定量分析，與野生型(wt)相比ad鼠的海馬區(qū)中synaptophysin-1顯著上升，在經(jīng)過selp-h治療之后顯著下降；對圖8a中bdnf條帶的定量分析，與野生型(wt)相比ad鼠的海馬區(qū)中bdnf顯著上升，在經(jīng)過selp-h治療之后顯著下降。與野生型相比，在ad模型小鼠中，神經(jīng)突觸相關(guān)蛋白表達(dá)量降低了，而提高selp-h表達(dá)能逆轉(zhuǎn)這種狀況，同時(shí)selp-h的提高還能促進(jìn)bdnf的表達(dá)?？梢?，本發(fā)明實(shí)施例提供的重組腺相關(guān)病毒可以起到提高患ad動(dòng)物神經(jīng)突觸相關(guān)蛋白表達(dá)量，此外還能促進(jìn)bdnf的表達(dá)。這進(jìn)一步證實(shí)了本發(fā)明實(shí)施例提供的重組腺相關(guān)病毒可以起到治療ad的效果。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>深圳大學(xué)

<120>一種重組腺相關(guān)病毒及其應(yīng)用

<130>1

<160>1

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>219

<212>dna

<213>人工序列

<223>重組腺相關(guān)病毒的堿基序列

<400>1

aggtttcagagcatattcctgtttatcaacaagaagaaaaccaaacagatgtctggactc60

ttttaaatggaagcaaagatgacttcctcatatatgatagatgtggccgtcttgtatatc120

atcttggtttgcctttttccttcctaactttcccatatgtagaagaagccattaagattg180

cttactgtgaaaagaaatgtggaaactgctctctcacga219