本發(fā)明涉及人免疫球蛋白及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是涉及一種靜注呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白及其制備方法。
背景技術(shù)：
：呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytialvirus，rsv)為副粘病毒科,肺炎病毒屬,是有包膜的單鏈負鏈rna病毒。rsv病毒是兒童呼吸道感染最重要的病毒病原,其早期感染癥狀與許多病原類似，嚴重危害兒童健康。rsv感染是冬春季嬰幼兒住院的主要原因之一。據(jù)who報告，全球每年大約有6400萬人感染rsv，其中死亡16萬。最新的一項研究表明，每年的11月至次年4月，5歲以內(nèi)因急性呼吸道感染住院的患兒中20％與rsv感染有關(guān)。rsv感染發(fā)病呈全球性，局部可暴發(fā)流行，已成為世界性的公共衛(wèi)生問題。呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白rsv-igg因能特異中和呼吸道合胞病毒，臨床上主要用其降低高危人群的住院率，包括小于6周齡嬰兒、1歲以內(nèi)早產(chǎn)兒、2歲以內(nèi)患有支氣管肺發(fā)育不良或患先天性心臟病的幼兒、老人及免疫抑制病人。普通人群中的呼吸道合胞病毒自然感染率可達90％以上，篩選并采集含高效價呼吸道合胞病毒igg抗體的血漿，采用高效的分離純化方法制備呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白藥物，對于預(yù)防因呼吸道合胞病毒引起的重癥感染具有不可替代的臨床應(yīng)用價值。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明就是針對上述存在的缺陷而提供一種靜注呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白及其制備方法，可以有效預(yù)防因呼吸道合胞病毒感染誘發(fā)的嬰幼兒呼吸道感染。本發(fā)明的一種靜注呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白及其制備方法技術(shù)方案為，該靜注呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白其中和抗體效價不小于1：3000，純度大于等于98％，蛋白含量為40～60mg/ml。該靜注呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白劑型為液體制劑，劑型規(guī)格為50ml/瓶或100ml/瓶。所述的一種靜注呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白的制備方法，包括以下步驟：(1)微量中和試驗法篩選rsv中和抗體效價大于等于1：300的原料血漿；(2)將篩選出的原料血漿混合制備成血漿供試品，所述血漿供試品的rsv中和抗體效價滴度大于等于1：600；(3)將所述血漿供試品按照低溫乙醇工藝蛋白分離方法，分離提取免疫球蛋白組份，經(jīng)壓濾、層析、超濾、低ph孵育滅活、配制后分裝得到產(chǎn)品。步驟(1)中所述微量中和試驗法具體包括如下步驟：①樣品稀釋將血漿樣本用細胞維持液預(yù)先進行1：10稀釋后56℃滅活30分鐘；在96孔深孔板中加入540ul細胞維持液，然后加入滅活后的血漿樣本60ul，震蕩混勻備用；打開足夠量的96孔細胞板，標(biāo)明病毒回滴用板和樣品試驗板，并在各樣品試驗板上標(biāo)示該板試驗樣品的編號；在樣品試驗板的各樣品孔中加入33.3ul細胞維持液,病毒回滴孔與陰性對照孔加入50ul細胞維持液；將預(yù)先稀釋好的樣品液分別加入到相應(yīng)96孔細胞板的相應(yīng)位置，每孔加樣品16.7μl，每個樣品平行做四孔；②攻擊病毒制備攻擊病毒液：根據(jù)試驗的標(biāo)本數(shù)用維持液制備足量的攻擊病毒液，將應(yīng)用病毒稀釋到100ccid50/0.05ml；除病毒回滴孔與陰性對照孔外，其余各孔中均加入50μl含100ccid50的攻擊病毒液；回滴100ccid50攻擊病毒液：用細胞維持液將攻擊病毒液作10-1、10-2、10-3稀釋，將其攻擊病毒液與其10-1、10-2、10-3濃度的病毒液加入到相應(yīng)的病毒回滴用96孔細胞板孔中，每個稀釋度加10孔，50μl/孔；陰性對照：向陰性對照各孔中再加入50μl細胞維持液；將所有96孔細胞板放入35℃、含有co2體積百分數(shù)為5％的培養(yǎng)箱中和培養(yǎng)1.5小時；③細胞懸液的配制與添加細胞懸液的配制：取足夠量的hep-2細胞，消化后計數(shù)，試驗用細胞懸液濃度應(yīng)為2×105個/ml，配好的細胞液立即使用；細胞懸加：中和培養(yǎng)后每孔加細胞懸液100μl，約2×104個/孔；④培養(yǎng)及觀察統(tǒng)計將完成以上操作的96孔細胞板放置35℃、含有co2體積百分數(shù)為5％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，第5～7天顯微鏡下觀察樣品保護細胞感染病毒的情況，記錄統(tǒng)計；四個重復(fù)樣品孔中有兩孔及以上不發(fā)生病變者即為高效價血漿。所述細胞維持液為體積比為3％的胎牛血清的mem液。步驟(2)為，取經(jīng)步驟(1)中和試驗法測定的中和抗體效價大于1：300的人血漿，2～30℃下融漿，合并混合制備成血漿供試品。步驟(3)具體為，①用生理鹽水調(diào)節(jié)血漿供試品中的血漿蛋白含量至45～50mg/ml，用ph值為4.0的醋酸緩沖液調(diào)節(jié)ph至6.0～6.2，加入95％乙醇調(diào)節(jié)乙醇濃度至20％，反應(yīng)溫度為-5.5～-4.5℃，壓濾分離獲得fi+ii+iii沉淀；②將步驟①獲得的沉淀用10倍體積的低溫注射用水溶解，用ph值為4.0的醋酸緩沖液調(diào)節(jié)ph至5.2，加體積百分比95％乙醇至所述反應(yīng)液中，使最終乙醇體積百分比為14％，使用冷媒控制反應(yīng)液溫度至-5.5～-4.5℃，壓濾分離去沉淀，收集上清液；③用0.1mnaoh調(diào)節(jié)步驟②收集的上清液ph至6.8～7.2，加入95％乙醇調(diào)節(jié)乙醇濃度至25％，反應(yīng)溫度為-7.5～-6.5℃，壓濾分離獲得fii沉淀；④將步驟③獲得的沉淀用10倍體積的低溫注射用水溶解，使用冷媒控制反應(yīng)液溫度至0～1℃，壓濾分離去沉淀，收集上清液；⑤將步驟④收集的上清液過濾后上deae-sepharosefastflow弱陰離子交換層析，反應(yīng)溫度為0～1℃，收集流出液；⑥將步驟⑤收集的流出液用冰醋酸調(diào)節(jié)ph至3.8～4.4，8～10倍超濾透析濃縮得到濃縮液；⑦將步驟⑥獲得的濃縮液用冰醋酸調(diào)ph至3.8～4.0，加入麥芽糖使最終濃度至10％作為保護劑，補加低溫注射用水使蛋白含量為5.5～6.0％，得到原液；⑧將步驟⑦獲得的原液在23～25℃下孵放21天；⑨配制：用注射用水稀釋調(diào)整制品蛋白含量至51～55mg/ml，同時補加麥芽糖至10％，用0.2mol/l鹽酸調(diào)節(jié)ph至3.8～4.4。所述步驟⑨后，進行除菌分裝，經(jīng)0.2μm濾膜過濾除菌，控制過濾壓力不大于0.25mpa，按蛋白含量51～55mg/ml，中和抗體效價大于等于1：3000，50ml/瓶或100ml/瓶的規(guī)格分裝。步驟(1)之前包括以下步驟：a.基于微量中和試驗的流行病學(xué)調(diào)查的方法推算出大致的血漿篩選標(biāo)準(zhǔn)(閾值)：rsv中和抗體效價滴度不小于1：300；b.基于微量中和試驗的混漿驗證的方法確定血漿的篩選標(biāo)準(zhǔn)：rsv中和抗體效價滴度不小于1：300；步驟a所述流行病學(xué)調(diào)查的方法具體包括如下步驟：①樣品稀釋：血漿樣本用細胞維持液預(yù)先進行1：4稀釋后56℃滅活30分鐘；打開足夠量的96孔細胞板，標(biāo)明病毒回滴用板和樣品試驗板，并在各樣品試驗板上標(biāo)示該板試驗樣品的編號；在樣品試驗板的各樣品孔中加入50ul細胞維持液,然后在a1-h1和a7-h7加入樣品，25ul/孔，上下兩孔為重復(fù)，順序為先從上至下，后從左至右；排槍稀釋：1列和7列用排槍混勻吸25ul至下一列，如此稀釋直至6列和12列，最后將25ul棄掉；病毒回滴孔與陰性對照孔加入50ul細胞維持液；所述細胞維持液為體積比為3％的胎牛血清的mem液；②攻擊病毒制備攻擊病毒液：根據(jù)試驗的標(biāo)本數(shù)用維持液制備足量的攻擊病毒液，將應(yīng)用病毒稀釋到100ccid50/0.05ml；除病毒回滴孔與陰性對照孔外，其余各孔中均加入50μl含100ccid50的攻擊病毒液；回滴100ccid50攻擊病毒液：用細胞維持液將攻擊病毒液作10-1、10-2、10-3稀釋，將其攻擊病毒液與其10-1、10-2、10-3濃度的病毒液加入到相應(yīng)的病毒回滴用96孔細胞板孔中，每個稀釋度加10孔，50μl/孔；陰性對照：向陰性對照各孔中再加入50μl細胞維持液；將所有96孔細胞板放入35℃、含有co2體積百分數(shù)為5％的培養(yǎng)箱中和培養(yǎng)1.5小時；③細胞懸液的配制與添加細胞懸液的配制：取足夠量的hep-2細胞，消化后計數(shù)，試驗用細胞懸液濃度應(yīng)為2×105個/ml，配好的細胞液立即使用；細胞懸加：中和培養(yǎng)后每孔加細胞懸液100μl，約2×104個/孔；④培養(yǎng)及觀察統(tǒng)計將完成以上操作的96孔細胞板放置35℃、含有co2體積百分數(shù)為5％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天，第5～7天顯微鏡下觀察樣品保護細胞感染病毒的情況，記錄統(tǒng)計；通過累計加權(quán)平均值的方法推算篩漿標(biāo)準(zhǔn)。步驟b所述的混漿驗證的方法具體包括如下步驟：a.樣品稀釋血漿樣本用細胞維持液預(yù)先進行1：10稀釋后56℃滅活30分鐘；分別取適量體積的經(jīng)推算的篩漿標(biāo)準(zhǔn)以上的血漿樣品于10ml無熱原管中，震蕩混勻記為高效價混合血漿；分別取適量體積的全部血漿樣品于10ml無熱原管中，震蕩混勻記為全混血漿；打開足夠量的96孔細胞板，標(biāo)明病毒回滴用板和樣品試驗板，并在各樣品試驗板上標(biāo)示該板試驗樣品的編號；在樣品試驗板的各樣品孔中加入50ul細胞維持液,然后在a1-a12加入樣品，50ul/孔；排槍稀釋：自上而下排槍混勻吸50ul至下一列，如此稀釋直至h行，最后將50ul棄掉；病毒回滴孔與陰性對照孔加入50ul細胞維持液；所述細胞維持液為體積比為3％的胎牛血清的mem液；以下攻擊病毒、細胞懸液的配制與添加以及細胞的培養(yǎng)條件同步驟a所述流行病學(xué)調(diào)查的方法。本發(fā)明的一種靜注呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白及其制備方法有益效果為：(1)本發(fā)明提供的呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白，rsv中和抗體效價大于等于1:3000，純度大于等于98％，可以針對性的中和呼吸道合胞病毒，是預(yù)防呼吸道合胞病毒感染的有效藥物，具有較大的社會效益和經(jīng)濟效益。(2)本發(fā)明中首次提出了使用流行病學(xué)調(diào)查的方法推算血漿的篩選標(biāo)準(zhǔn)(閾值)以及混漿驗證的方法，使實驗更具備科學(xué)性和可靠性；(3)本發(fā)明中在微量中和試驗中首次提出血漿樣品檢測使用4個重復(fù)，避免了以往中和試驗中2個重復(fù)帶來的過大的偏差，使結(jié)果的準(zhǔn)確性進一步提高；(4)采用國家已有標(biāo)準(zhǔn)的呼吸道合胞病毒株(long株)作為檢測載體，篩選出具有較高滴度的特異性原料血漿，其標(biāo)準(zhǔn)符合《中華人民共和國藥典》2015版中“生物制品生產(chǎn)用血漿”規(guī)定，經(jīng)低溫乙醇壓濾工藝結(jié)合柱層析純化制備出高滴度、高特異性和高純度的呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白。附圖說明：圖1所示為本發(fā)明靜注呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白的制備流程圖。具體實施方式：為了更好地理解本發(fā)明，下面用具體實例來詳細說明本發(fā)明的技術(shù)方案，但是本發(fā)明并不局限于此。實施例11、供血漿者的血漿篩選采集：選擇血漿，所選擇的血漿應(yīng)滿足以下條件：rsv中和抗體效價不小于1：300，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(賴氏法監(jiān)測)不高于35單位；乙型肝炎表面抗原陰性，梅毒陰性，hiv-1/hiv-2抗體陰性，hcv抗體陰性等均合格的原料血漿，低溫冰凍儲存，保存期不超過2年。流行病學(xué)調(diào)查方法包括如下步驟：(1)以人喉癌上皮細胞hep-2作為指示細胞，培養(yǎng)液為含10％(v/v)胎牛血清的mem；(2)將500份血漿樣品用細胞維持液(即為體積百分比3％的胎牛血清的mem液，下同)進行1：4稀釋后，56℃滅活30分鐘。打開65個96孔細胞板，標(biāo)明病毒回滴用板和樣品試驗板，并在各樣品試驗板上標(biāo)示該板試驗樣品的編號；在樣品試驗板的各樣品孔中加入50ul細胞維持液,然后在a1-h1和a7-h7加入樣品，25ul/孔，上下兩孔為重復(fù)，順序為先從上至下，后從左至右；排槍稀釋：1列和7列用排槍混勻吸25ul至下一列，如此稀釋直至6列和12列，最后將25ul棄掉；病毒回滴孔與陰性對照孔加入50ul細胞維持液。(3)取呼吸道合胞病毒rsv(long株)以細胞維持液稀釋至試驗用濃度(即100×ccid50/0.05ml)等量加入供試品板孔中，并同時設(shè)置陽性對照孔、陰性對照孔和病毒回滴孔。病毒(陽性)對照孔：先在板孔中加入細胞維持液50ul/孔，然后加入應(yīng)用病毒液50ul/孔，混勻；細胞(陰性)對照孔：直接加入細胞維持液100ul/孔；病毒回滴孔：先在板孔中加入細胞維持液50ul/孔，然后將應(yīng)用病毒液進行10倍比稀釋后，分別取100～10-3濃度的病毒液加至相應(yīng)病毒回滴孔中，50ul/孔；(4)中和反應(yīng)：將各板混勻后置二氧化碳培養(yǎng)箱中35℃，5％co2孵育進行中和反應(yīng)1.5小時。(5)細胞：細胞懸液的配制：取足夠量的hep-2細胞，消化后計數(shù)，用細胞維持液調(diào)節(jié)試驗用細胞懸液濃度應(yīng)為2×105個/ml，配好的細胞液立即使用或置4℃保存?zhèn)溆谩＜毎麘壹樱褐泻头磻?yīng)時間滿后，每孔加細胞懸液100μl，約2×104個/孔。(6)培養(yǎng)：將完成以上操作的細胞板放置35℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天。第5～7天顯微鏡下觀察樣品保護細胞感染病毒的情況。每次試驗均須有病毒對照和細胞對照，病毒對照必須出現(xiàn)病變，細胞對照必須正常。結(jié)果判定：以能保護50％細胞不出現(xiàn)病變的供試品稀釋度為中和效價。以大于某一中和抗體效價以上所有血漿的中和效價的累積加權(quán)值為全部血漿累積加權(quán)值的6倍以上，則該中和抗體效價即為篩漿標(biāo)準(zhǔn)(閾值)，如表1所示。表1.流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果注：表1中所述效價累積加權(quán)平均值:所對應(yīng)的效價值以上的所有樣本的效價平均值；混漿驗證方法包括如下步驟：a以人喉癌上皮細胞hep-2作為指示細胞，培養(yǎng)液為含10％(v/v)胎牛血清mem；b血漿樣本用細胞維持液預(yù)先進行1：10稀釋后56℃滅活30分鐘；分別取100ul中和效價在1：300以上的血漿樣品于10ml無熱原管中，震蕩混勻記為高效價混合血漿；分別取10ul的全部血漿樣品于10ml無熱原管中，震蕩混勻記為全混血漿；打開4板的96孔細胞板，標(biāo)明病毒回滴用板和樣品試驗板，并在各樣品試驗板上標(biāo)示該板試驗樣品的編號；在樣品試驗板的各樣品孔中加入50ul細胞維持液,然后在a1-a12加入樣品，50ul/孔；排槍稀釋：自上而下排槍混勻吸50ul至下一列，如此稀釋直至h行，最后將50ul棄掉；病毒回滴孔與陰性對照孔加入50ul細胞維持液以下的病毒的添加、中和以及細胞的添加及培養(yǎng)條件同流行性病學(xué)調(diào)查法相同；每次試驗均須有病毒對照和細胞對照，病毒對照必須出現(xiàn)病變，細胞對照必須正常。結(jié)果判定：以能保護50％細胞不出現(xiàn)病變的供試品稀釋度為中和效價。高效價混漿中和抗體效價為全部混漿的6倍以上則推算的篩漿標(biāo)準(zhǔn)(閾值)成立，如表2所示。表2.混漿驗證結(jié)果中和試驗測定方法包括如下步驟：(a)以人喉癌上皮細胞hep-2作為指示細胞，培養(yǎng)液為含10％(v/v)胎牛血清的mem；(b)將血漿樣品用細胞維持液(即為體積百分比3％的胎牛血清的mem液，下同)進行1：10稀釋后，56℃滅活30分鐘。在96孔深孔板中加入540ul細胞維持液，然后加入滅活后的血漿樣本60ul，震蕩混勻備用；取足夠量的細胞板，在樣品板中加入33.3ul/孔細胞維持液，然后加入相應(yīng)的1：100預(yù)稀釋的各樣品液16.7ul/孔，每樣品平行4孔。以下的病毒的添加、中和以及細胞的添加及培養(yǎng)條件同流行性病學(xué)調(diào)查法相同；每次試驗均須有病毒對照和細胞對照，病毒對照必須出現(xiàn)病變，細胞對照必須正常。結(jié)果判定：以能保護50％細胞不出現(xiàn)病變的供試品稀釋度為中和效價。4個重復(fù)樣品孔中有兩孔及兩孔以上不發(fā)生病變即為合格血漿，統(tǒng)計結(jié)果。含高滴度的特異性血漿在投產(chǎn)前進行混合檢測，抗體滴度不低于1∶600，連續(xù)三批混合血漿檢測結(jié)果見表3。表3.連續(xù)三批混合血漿檢測結(jié)果檢測項目2014s012014s022014s03蛋白含量56g/l56g/l57g/lhrsv中和抗體效價1∶7241∶6751∶6752、呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白的制備：(1)將中和抗體效價大于1∶300的300人份血漿，2～30℃下融漿，合并混合，混合后體積為180l，用中和試驗法檢測中和效價為1∶675；(2)用18kg生理鹽水稀釋血漿，用ph值為4.0的醋酸緩沖液6kg調(diào)節(jié)ph至6.01，加入95％乙醇54.4kg至反應(yīng)罐中，調(diào)節(jié)乙醇濃度至20％，反應(yīng)溫度為-4.5℃，壓濾分離獲得20kgfi+ii+iii；(3)將步驟(2)獲得的沉淀用200kg低溫注射用水溶解，用ph值為4.0的醋酸緩沖液2.1kg調(diào)節(jié)ph至5.2，加35kg95％乙醇至所述反應(yīng)液中，使最終乙醇體積百分比為14％，使用冷媒控制反應(yīng)液溫度至-4.5℃，壓濾分離去沉淀，收集上清液280kg；(4)用18kg0.1mnaoh調(diào)節(jié)步驟(3)收集的上清液ph至7.05，加入46.8kg95％乙醇調(diào)節(jié)乙醇濃度至25％，反應(yīng)溫度為-7.0℃，壓濾分離獲得fii沉淀5.2kg；(5)將步驟(4)獲得的沉淀用52kg的低溫注射用水溶解，使用冷媒控制反應(yīng)液溫度至0.1℃，壓濾分離去沉淀，收集上清液72kg；(6)將步驟(5)收集的上清液過濾后上deae-sepharosefastflow弱陰離子交換層析，反應(yīng)溫度為0.6℃，收集流出液75kg；(7)將步驟(6)收集的流穿液用冰醋酸調(diào)節(jié)ph至3.93，10倍超濾透析濃縮至13kg(蛋白含量8.1％、ph：4.25)；(8)將步驟(7)獲得的濃縮液用5ml冰醋酸調(diào)ph至3.93，加入1.8kg麥芽糖使最終濃度至10％作為保護劑，補加3.3kg低溫注射用水使蛋白含量為5.65％，最終體積為18.5kg；(9)將步驟(8)獲得的原液在23～25℃下孵放21天后用納米膜過濾去除病毒；(10)配制：測定納米膜過濾后原液蛋白含量為5.6％，用1.6kg注射用水稀釋調(diào)整制品蛋白含量至52mg/ml，同時補加0.15kg麥芽糖至10％，用20ml0.2mol/l鹽酸調(diào)節(jié)ph至4.05。3、配制后除菌分裝，蛋白含量為52mg/ml，中和抗體效價為1：3300，共分裝375瓶制品，取30瓶制品送質(zhì)量檢定部檢定。4、經(jīng)大規(guī)模試生產(chǎn)制備所得到的樣品，按照企業(yè)修訂的本品制造及檢定規(guī)程和《中華人民共和國藥典》2010版三部的有關(guān)規(guī)定進行檢定上述步驟所得的呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白。結(jié)果見表4。表4.呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白檢驗報告書結(jié)論：本品按靜注呼吸道合胞病毒人免疫球蛋白制造檢定規(guī)程檢驗，結(jié)果符合規(guī)定。實施例2本發(fā)明的靜注呼吸道合胞病毒免疫球蛋白與山東泰邦生物制品有限公司現(xiàn)有靜丙產(chǎn)品以及國外靜丙產(chǎn)品的抗rsv中和抗體效價的對比研究本發(fā)明方法制備的三批靜丙呼吸道合胞病毒免疫球蛋白與山東泰邦生物制品有限公司現(xiàn)有靜丙產(chǎn)品以及法國lfb靜丙產(chǎn)品(clarify)和csl靜丙產(chǎn)品privigen進行抗rsv中和抗體效價的對比研究。中和抗體效價的測定以上述的微量中和試驗的方法測定。表5.中和效價對比研究結(jié)論：本發(fā)明制備的rsv-ivig中和抗體效價是山東泰邦生物制品有限公司現(xiàn)有靜丙及國外靜丙(折算為5％的靜丙)的6倍左右。具有很高的中和呼吸道合胞病毒的能力，是預(yù)防呼吸道合胞病毒感染的有效藥物，具有較大的社會效益和經(jīng)濟效益。以上所述的實施例僅僅是對本發(fā)明的優(yōu)選實施方式進行描述，并非對本發(fā)明的范圍進行限定，在不脫離本發(fā)明設(shè)計精神的前提下，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員對本發(fā)明的技術(shù)方案作出的各種變形和改進，均應(yīng)落入本發(fā)明權(quán)利要求書確定的保護范圍內(nèi)。當(dāng)前第1頁12