分案聲明

本申請是2011年03月30日提交的申請?zhí)枮?01110078314.x、發(fā)明名稱為“定點(diǎn)單取代聚乙二醇化exendin類似物及其制備方法”的中國專利申請的分案申請。

本發(fā)明涉及一種定點(diǎn)單取代聚乙二醇化exendin類似物、其制備方法和醫(yī)藥用途。

背景技術(shù)：

早在上世紀(jì)60年代，麥金太爾和埃爾里克等人就發(fā)現(xiàn)，口服葡萄糖對胰島素分泌的促進(jìn)作用明顯高于靜脈注射，這種額外的效應(yīng)被稱為“腸促胰素效應(yīng)”。而珀利等人進(jìn)一步研究證實(shí)，這種“腸促胰素效應(yīng)”所產(chǎn)生的胰島素占進(jìn)食后胰島素總量的50％以上。1986年，瑙克等人發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病患者腸促胰素作用減退。這提示，腸促胰素系統(tǒng)異?？赡苁?型糖尿病的發(fā)病機(jī)制之一。

隨著細(xì)胞和分子生物學(xué)的發(fā)展，腸促胰素這層神秘的面紗被慢慢揭開。研究證實(shí)，腸促胰素是人體內(nèi)一種腸源性激素。在進(jìn)食后，該類激素可促進(jìn)胰島素分泌，發(fā)揮葡萄糖濃度依賴性降糖作用。腸促胰素主要由glp-1和糖依賴性胰島素釋放肽(gip)組成，其中g(shù)lp-1在2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展中起著更為重要的作用，它能夠通過促進(jìn)胰島素分泌、刺激胰島β細(xì)胞增生、阻止胰島β細(xì)胞凋亡、抑制胰高血糖素的釋放、抑制胃腸道蠕動(dòng)和胃液分泌、延遲胃排空、產(chǎn)生飽脹感和食欲下降等多重途徑來控制血糖。但是由于其在體內(nèi)會(huì)迅速被dpp-iv降解，半衰期只有1-2分鐘，限制了其應(yīng)用開發(fā)。

exendin-4是從美洲毒蜥的唾液中分離得到的含有39個(gè)氨基酸序列的glp-1類似物，其與glp-1有53％的結(jié)構(gòu)同源性，能夠與glp-1受體結(jié)合。通過與glp-1受體結(jié)合發(fā)揮促胰島素分泌的作用，有效降低空腹和餐后血糖的作用，用于治療二型糖尿病。與glp-1相比由于其第二位的丙氨酸改為了甘氨酸，避免了體內(nèi)二肽酶(dpp-iv)的降解，半衰期較glp-1的1-2min提高到2-4h，使得其得以被開發(fā)成上市產(chǎn)品(byetta,amylin公司)，每日給藥兩次。

然而頻繁的注射給藥病人順應(yīng)性很低，因此對于此類藥物緩釋劑型的研究和開發(fā)從未停止：novonordisk開發(fā)的liraglutide(nn-2211)每天給藥一次。amylin研究開發(fā)的exenatidelar(plga微球)，每周給藥一次。因此，研究開發(fā)長效制劑或者非注射途徑給藥的制劑是該類藥物發(fā)展的趨勢。

目前研究最充分的，使用的最廣泛的多肽蛋白藥物長效制劑技術(shù)即是聚乙二醇化技術(shù)，其使用活化的聚乙二醇試劑與多肽蛋白上特殊的氨基酸殘基發(fā)生反應(yīng)，形成新的分子，利用聚乙二醇的水溶性大分子特點(diǎn)增加多肽蛋白的溶解度，降低其免疫原性，減少腎小球?yàn)V過從而延長體內(nèi)半衰期，達(dá)到延長藥物作用時(shí)間的目的，提高病人順應(yīng)性。

聚乙二醇化技術(shù)一般使用活化的聚乙二醇化試劑與多肽或蛋白結(jié)構(gòu)上的活潑殘基(按活性順序一般為巰基，氨基，羧基等)進(jìn)行反應(yīng)，形成化學(xué)鍵穩(wěn)定的聚乙二醇化產(chǎn)物。但是結(jié)構(gòu)上具有多個(gè)活潑殘基時(shí)，一般生成不同位點(diǎn)的單取代混合物，并且在聚乙二醇摩爾比例較高時(shí)還會(huì)繼續(xù)形成多取代產(chǎn)物。一般多取代物會(huì)顯著影響藥物活性，進(jìn)而影響體內(nèi)藥效，而且多取代物的質(zhì)量控制也比較困難，因此上市的聚乙二醇化藥物基本都是單取代物。

由于單取代的位置對于多肽或者蛋白類藥物的活性影響非常顯著，因此制備活性位點(diǎn)最佳的單取代聚乙二醇化產(chǎn)品很有必要。

現(xiàn)有技術(shù)中，定點(diǎn)化聚乙二醇化的常用技術(shù)有兩類：

一類是控制結(jié)構(gòu)上能夠反應(yīng)的殘基數(shù)。這類技術(shù)中，比較多的方法是是在位置最佳處突變產(chǎn)生或者合成中加入一個(gè)半胱氨酸，然后利用能夠與巰基反應(yīng)的聚乙二醇化試劑(如聚乙二醇化馬來酰亞胺)進(jìn)行反應(yīng)，在半胱氨酸上結(jié)合聚乙二醇。然而這種方法的缺點(diǎn)一方面是藥物結(jié)構(gòu)改變造成對其藥效及毒性的影響不清楚，二是引入了半胱氨酸，對于其穩(wěn)定性會(huì)有不利影響，比如說半胱氨酸易氧化。另外的定點(diǎn)方法則是采用賴氨酸氨基作為聚乙二醇化位點(diǎn)，其將其它位點(diǎn)的賴氨酸全部替換為堿性精氨酸，僅留下需要反應(yīng)位點(diǎn)的賴氨酸。這樣的方法缺點(diǎn)同樣是結(jié)構(gòu)改變會(huì)對藥效及毒性產(chǎn)生明顯影響，本申請的發(fā)明人在實(shí)驗(yàn)中即有明確發(fā)現(xiàn)這樣改變結(jié)構(gòu)的新多肽藥效受到很大影響。

另一類技術(shù)則是在偏酸性條件下使用聚乙二醇丙醛試劑對n端氨基進(jìn)行聚乙二醇化修飾。有研究者發(fā)現(xiàn)n端氨基pka值小于賴氨酸殘基上的氨基，也就是說堿性更強(qiáng)。因此，賴氨酸上的氨基需要在微堿性條件下(ph7-8)發(fā)生聚乙二醇化反應(yīng)，而n端氨基可在偏酸性條件下(ph5-6)即發(fā)生聚乙二醇化反應(yīng)，而此時(shí)賴氨酸上的氨基不能反應(yīng)。因此有研究者利用多肽或者蛋白的上述性質(zhì)，在偏酸性條件下對n端氨基進(jìn)行定點(diǎn)的聚乙二醇化反應(yīng)。但是這種方法有兩個(gè)缺點(diǎn)，一是不適用于n端為活性位點(diǎn)的藥物；二是此反應(yīng)得率低，在聚乙二醇試劑使用摩爾比高達(dá)5甚至10的條件下，而產(chǎn)率也僅有50％-60％，導(dǎo)致生產(chǎn)成本太高，不具備生產(chǎn)的可能。

對exendin-4類似物進(jìn)行聚乙二醇化修飾時(shí)，由于exendin-4類似物的結(jié)構(gòu)中沒有半胱氨酸，因此無法使用聚乙二醇馬來酰亞胺進(jìn)行定點(diǎn)聚乙二醇化反應(yīng)；其次，由于其結(jié)構(gòu)的n端是活性位點(diǎn)(參見britishjournalofpharmacology,2003,140,339-346)，因此無法使用聚乙二醇丙醛進(jìn)行n端定點(diǎn)聚乙二醇化反應(yīng)。

然而，當(dāng)使用聚乙二醇琥珀酰亞胺試劑對exendin-4類似物側(cè)鏈氨基進(jìn)行修飾時(shí)，由于exendin-4類似物中含有最多4個(gè)賴氨酸，加上n端氨基總共將有5個(gè)潛在反應(yīng)位點(diǎn)，因此在聚乙二醇化過程中不可避免會(huì)出現(xiàn)上面所提到的多取代物和單取代物混合物出現(xiàn)的情況，而所有這些產(chǎn)物中只有一個(gè)是活性最佳的目標(biāo)產(chǎn)物。

youn等人提出了使用fmoc(9-芴基甲氧羰基)保護(hù)基對多肽結(jié)構(gòu)中不希望發(fā)生反應(yīng)的氨基進(jìn)行保護(hù)的方法(biocomjugatechem,2007,18,500-506)，但該方法有一個(gè)顯著的缺點(diǎn)，即在堿性環(huán)境下多肽的fmoc保護(hù)基很容易脫落。實(shí)際上，在很多多肽合成實(shí)驗(yàn)中，就是采用堿(20％哌啶)來脫除fmoc保護(hù)基的。exendin-4類似物中氨基的聚乙二醇化反應(yīng)需要在一定程度的堿性條件下才能發(fā)生。這兩個(gè)矛盾的事實(shí)使得fmoc保護(hù)的多肽在偏堿性條件下進(jìn)行聚乙二醇化修飾時(shí)，fmoc保護(hù)基很容易脫落，從而不可避免地造成相當(dāng)數(shù)量的多取代物副反應(yīng)物的生成。

因此，有必要提供一種制備定點(diǎn)單取代聚乙二醇化exendin-4類似物的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種制備定點(diǎn)單取代聚乙二醇化exendin類似物的方法以及由該方法所制備的單取代聚乙二醇化exendin類似物。

為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明上述的發(fā)明目的，一方面，本發(fā)明提供了一種制備定點(diǎn)單取代聚乙二醇化exendin類似物的方法，該方法包括如下的步驟：

(1)合成exendin類似物的多肽原料，該多肽原料的部分位點(diǎn)的lys殘基上帶有dde保護(hù)基，其中，dde為n-α-1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)己亞基)(其英文名稱為(n-α-1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohex-1-ylidene)；

(2)將上述的多肽原料與聚乙二醇化試劑在偏堿性的有機(jī)溶劑中反應(yīng)，使得該多肽原料中不帶有dde保護(hù)基的lys殘基上連接有聚乙二醇基團(tuán)；

(3)脫除步驟(2)所得產(chǎn)物上的保護(hù)基，并分離純化，得到聚乙二醇化exendin類似物。

在本發(fā)明的方法中，由于采用了相對fmoc耐受堿性條件強(qiáng)的多得多的dde作為保護(hù)基，避免了fmoc不穩(wěn)定性(脫落)所導(dǎo)致的多取代反應(yīng)，從而使得反應(yīng)的副產(chǎn)物大大減少，使得大規(guī)模制備成為可能。

在上述的制備方法中，其多肽原料中應(yīng)當(dāng)至少有一個(gè)位點(diǎn)的lys殘基上不帶有dde保護(hù)基，以便連接聚乙二醇基團(tuán)；優(yōu)選地，上述多肽原料中只有一個(gè)位點(diǎn)的lys殘基上不帶有dde保護(hù)基，從而制備定點(diǎn)的、單取代的聚乙二醇化exendin類似物。

在上述的制備方法中，其多肽原料的n端可以帶有dde保護(hù)基或fmoc保護(hù)基；單純從藥物純度的角度來看，多肽原料的n端帶有dde保護(hù)基為佳，但如果結(jié)合成本的角度來開，可以選擇n端帶有fmoc保護(hù)基，因?yàn)閺姆磻?yīng)活性的實(shí)際考察來看，n端使用fmoc保護(hù)基并不會(huì)帶來較多的多取代的聚乙二醇化exendin類似物。

例如，在上述的制備方法中，其具體的多肽原料可以具有如下的結(jié)構(gòu)：

(x)his-gly-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-leu-ser-y1-gln-z-glu-glu-glu-ala-val-y2-leu-phe-ile-glu-trp-leu-y3-asn-gly-gly-pro-ser-ser-gly-ala-pro-pro-pro-ser-y4，其中，x是fmoc或dde；z為leu或ile；y1-y4為lys或(dde)lys，而且y1-y4中至少一個(gè)為lys；優(yōu)選地，在y1-y4中，只有y2-y4中的一個(gè)為lys，其余均為(dde)lys；更優(yōu)選地，y2為lys，y1、y3和y4為(dde)lys。

但是，本發(fā)明的方法并不只限于制備上述結(jié)構(gòu)的聚乙二醇化exendin類似物；在所有的exendin類似物，包括exendin-4類似物中，只要其多肽序列中有多于一個(gè)的lys殘基(兩個(gè)以及以上的lys殘基)，都特別適合采用本發(fā)明的上述制備方法來制備單取代的聚乙二醇化exendin類似物。本發(fā)明中采用了具有4個(gè)lys殘基的多肽序列來制備單取代的聚乙二醇化exendin類似物，因?yàn)榫哂?個(gè)lys殘基的exendin類似物是結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜的exendin類似物。本發(fā)明的方法適于制備申請人在其中國專利申請cn101125207a中所公開的所有exendin類似物的聚乙二醇化制劑；cn101125207a的所有公開內(nèi)容合并入本申請中。

在本發(fā)明的制備方法中，peg試劑(聚乙二醇化試劑)的聚乙二醇分子量可以為20,000-60,000道爾頓；進(jìn)一步地，在本發(fā)明的制備方法中，可以采用cn101125207a中所公開的具有支鏈結(jié)構(gòu)的聚乙二醇基團(tuán)。

例如，本發(fā)明方法中一種實(shí)施方式為：

按照如下步驟制備并分離純化定點(diǎn)單取代聚乙二醇化exendin-4類似物：

1、合成帶有保護(hù)基的exendin-4類似物

如聚乙二醇化位點(diǎn)為n端氨基，合成結(jié)構(gòu)如下的帶有保護(hù)基的exendin-4類似物：

his-gly-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-leu-ser-(dde)lys-gln-z-glu-glu-glu-ala-val-(dde)lys-leu-phe-ile-glu-trp-leu-(dde)lys-asn-gly-gly-pro-ser-ser-gly-ala-pro-pro-pro-ser-(dde)lys

如聚乙二醇化位點(diǎn)為lys¹²側(cè)鏈氨基，合成結(jié)構(gòu)如下的帶有保護(hù)基的exendin-4類似物：

(fmoc)his-gly-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-leu-ser-lys-gln-z-glu-glu-glu-ala-val-(dde)lys-leu-phe-ile-glu-trp-leu-(dde)lys-asn-gly-gly-pro-ser-ser-gly-ala-pro-pro-pro-ser-(dde)lys或

(dde)his-gly-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-leu-ser-lys-gln-z-glu-glu-glu-ala-val-(dde)lys-leu-phe-ile-glu-trp-leu-(dde)lys-asn-gly-gly-pro-ser-ser-gly-ala-pro-pro-pro-ser-(dde)lys；

如聚乙二醇化位點(diǎn)為lys²⁰側(cè)鏈氨基，合成結(jié)構(gòu)如下的帶有保護(hù)基的exendin-4類似物:

(fmoc)his-gly-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-leu-ser-(dde)lys-gln-z-glu-glu-glu-ala-val-lys-leu-phe-ile-glu-trp-leu-(dde)lys-asn-gly-gly-pro-ser-ser-gly-ala-pro-pro-pro-ser-(dde)lys或

(dde)his-gly-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-leu-ser-(dde)lys-gln-z-glu-glu-glu-ala-val-lys-leu-phe-ile-glu-trp-leu-(dde)lys-asn-gly-gly-pro-ser-ser-gly-ala-pro-pro-pro-ser-(dde)lys；

如聚乙二醇化位點(diǎn)為lys²⁷側(cè)鏈氨基，合成結(jié)構(gòu)如下的帶有保護(hù)基的exendin-4類似物:

(fmoc)his-gly-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-leu-ser-(dde)lys-gln-z-glu-glu-glu-ala-val-(dde)lys-leu-phe-ile-glu-trp-leu-lys-asn-gly-gly-pro-ser-ser-gly-ala-pro-pro-pro-ser-(dde)lys或

(dde)his-gly-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-leu-ser-(dde)lys-gln-z-glu-glu-glu-ala-val-(dde)lys-leu-phe-ile-glu-trp-leu-lys-asn-gly-gly-pro-ser-ser-gly-ala-pro-pro-pro-ser-(dde)lys；

如聚乙二醇化位點(diǎn)為lys⁴⁰側(cè)鏈氨基，合成結(jié)構(gòu)如下的帶有保護(hù)基的exendin-4類似物:

(fmoc)his-gly-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-leu-ser-(dde)lys-gln-z-glu-glu-glu-ala-val-(dde)lys-leu-phe-ile-glu-trp-leu-(dde)lys-asn-gly-gly-pro-ser-ser-gly-ala-pro-pro-pro-ser-lys或

(dde)his-gly-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-leu-ser-(dde)lys-gln-z-glu-glu-glu-ala-val-(dde)lys-leu-phe-ile-glu-trp-leu-(dde)lys-asn-gly-gly-pro-ser-ser-gly-ala-pro-pro-pro-ser-lys；

2、將上述帶有保護(hù)基的exendin-4類似物及一定摩爾比例的分子量范圍在20,000-60,000道爾頓的聚乙二醇化試劑(優(yōu)選40kdy型peg-nhs酯)溶解于適量有機(jī)溶劑中(優(yōu)選dmso)，當(dāng)其完全溶解后加入適量不與聚乙二醇化試劑發(fā)生反應(yīng)但卻更夠提供足夠堿性環(huán)境的有機(jī)堿，一般可用三乙胺(tea)、二異丙基乙胺(diea)、4-二甲基氨基吡啶(dmap)、2,4,6-三甲基吡啶(colidine)、二甲基吡啶(lutidine)、吡啶(pyridine)等。

3、上述溶液體系在一定溫度下(不超過40℃)保溫一段時(shí)間，聚乙二醇化反應(yīng)即已完成，然后加入足夠量的試劑(優(yōu)選聯(lián)胺)脫除fmoc和dde保護(hù)基，在一定溫度下(不超過40℃)保溫一段時(shí)間，所有保護(hù)基即可完全脫除。

4、將上述終反應(yīng)液用純水稀釋10倍并立即用hcl或醋酸調(diào)ph致5.0-6.0以保證樣品的穩(wěn)定性，然后使用source30rpc填料，使用含有20mm醋酸的水：乙腈或者水：乙醇系統(tǒng)進(jìn)行線性梯度分離純化，收集目標(biāo)產(chǎn)物聚乙二醇化exendin-4類似物。

5、將上述source純化的含有一定有機(jī)溶劑(乙腈或乙醇)的聚乙二醇化exendin-4類似物樣品，使用陽離子交換樹脂，使用10mm檸檬酸緩沖鹽1.5mnacl洗脫液進(jìn)行性梯度分離純化，除去有機(jī)溶劑，收集目標(biāo)產(chǎn)物聚乙二醇化exendin-4類似物。

6、將上述離子交換純化的聚乙二醇化exendin-4類似物用10kd超濾膜進(jìn)行超濾濃縮，然后將樣品用分子篩色譜，使用純水進(jìn)行脫鹽處理，得到的聚乙二醇化exendin-4類似物純水溶液進(jìn)行凍干處理，最終得到聚乙二醇化exendin-4類似物原料藥。

另一方面，為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明還提供了一種按上述方法制備的聚乙二醇化exedin類似物。

再一方面，為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明還提供了一種聚乙二醇化exedin類似物，其中，該exedin類似物具有如下的序列結(jié)構(gòu)：

his-gly-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-leu-ser-lys-gln-z-glu-glu-glu-ala-val-lys-leu-phe-ile-glu-trp-leu-lys-asn-gly-gly-pro-ser-ser-gly-ala-pro-pro-pro-ser-lys,其中,z是leu(seqidno.1)或ile(seqidno.2)，并且上述結(jié)構(gòu)中有一個(gè)lys殘基上的氨基連接有聚乙二醇基團(tuán)。

優(yōu)選地，在上述的序列結(jié)構(gòu)中的lys²⁰殘基或lys²⁷殘基的氨基上連接有聚乙二醇基團(tuán)。

又一方面，為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明還提供了聚乙二醇化exedin類似物在制備治療糖尿病或肥胖癥藥物方面的用途。

本發(fā)明的方法中由于采用穩(wěn)定性更好的保護(hù)基dde作為主要保護(hù)基，避免了fmoc不穩(wěn)定所帶來的多取代副反應(yīng)，從而可以以低的反應(yīng)摩爾比制備高得率的單取代的聚乙二醇化exedin類似物，降低了生產(chǎn)成本。本發(fā)明的聚乙二醇化exedin類似物中副產(chǎn)物少，是一種定點(diǎn)的單取代的exedin類似物，避免了副產(chǎn)物所帶來的各種副作用。

為了更詳細(xì)的說明本發(fā)明，下面結(jié)合附圖，通過具體的實(shí)施方式，來詳細(xì)地說明本發(fā)明。但本發(fā)明的范圍并非局限于這些具體的實(shí)施方式上。

附圖說明

圖1是定點(diǎn)保護(hù)exendin-4類似物maldi-tof質(zhì)譜圖；

圖2是定點(diǎn)保護(hù)exendin-4類似物聚乙二醇化前后hplc色譜圖；

圖3是聚乙二醇化exendin-4類似物source純化色譜圖；

圖4是聚乙二醇化exendin-4類似物sp陽離子交換純化色譜圖；

圖5是聚乙二醇化exendin-4類似物分子篩除鹽色譜圖；

圖6顯示了hybr-003-peg單取代物在c57bl/6小鼠腹腔糖耐受試驗(yàn)(n＝8)，圖中，ap<0.01v.sblank,bp<0.01v.scontrol。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

(1)合成所用的氨基酸單體

fmoc-his(trt)-oh，dde-his(trt)-oh，fmoc-ala-oh，fmoc-gly-oh，fmoc-glu(otbu)-oh，fmoc-thr(tbu)-oh，fmoc-phe-oh，fmoc-ser(tbu)-oh，fmoc-asp(otbu)-oh，fmoc-leu-oh，fmoc-lys(boc)-oh，fmoc-lys(dde)-oh，fmoc-gln(trt)-oh，fmoc-val-oh，fmoc-ile-oh，fmoc-trp(boc)-oh,，fmoc-asn(trt)-oh，fmoc-pro-oh，fmoc-cys(trt)-oh

上面縮寫為：fmoc9-芴基甲氧羰基；boc叔丁氧羰基；trt三苯甲基；otbu叔丁基氧基；tbu叔丁基；dden-[1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代環(huán)己亞基)

(2)試劑：n,n-二異丙基乙胺、二異丙基碳二亞胺(dic)、n,n-二甲基甲酰胺(dmf)、二氯甲烷、六氫吡啶、1-羥基苯并三唑、rinkamide樹脂、茚三酮、甲醇、三異丙基硅烷、三氟乙酸。

(3)操作

a合成：以0.25mmol規(guī)模為例，稱取0.5grinkamide樹脂置于反應(yīng)器中，將氨基酸稱取1mmol，用dic/hobt方法活化，按照多肽序列從c端到n端依次進(jìn)行合成。反應(yīng)在25℃室溫條件下進(jìn)行，按照下列步驟進(jìn)行操作：

1、用20％六氫吡啶的dmf溶液脫保護(hù)基fmoc，每次10分鐘；

2、用10mldmf洗三次，抽干；

3、稱取保護(hù)的氨基酸(1mmol)，hobt(1mmol)，溶于10mldmf中，加入dic(1mmol)活化10分鐘；

4、將此活化的氨基酸溶液加入反應(yīng)器內(nèi)，振搖反應(yīng)1小時(shí)；

5、用dmf洗樹脂三次，抽干；

6、如果茚三酮反應(yīng)顯陰性，進(jìn)行下一循環(huán)，重復(fù)步驟1到5；

如果茚三酮反應(yīng)顯陽性，重復(fù)步驟3到5。

多肽鏈逐步合成完畢后，用甲醇洗樹脂，晾干。

b脫保護(hù)基及切除多肽

將帶有多肽的樹脂1g置于反應(yīng)器中，加入裂解液(比例苯甲醚2ml；甲醇2ml；三異丙基硅烷2ml；三氟乙酸6ml)。

室溫振搖2小時(shí)后，過濾，收集濾液，樹脂用少量醋酸洗滌，合并收集液，濃縮后，加入乙醚產(chǎn)生沉淀，過濾沉淀，再用少乙醚洗滌后，得粗品。

c制備型hplc分離純化，凍干

將得到的粗品溶于少量10％醋酸溶液，上柱，經(jīng)制備型hplc分離純化，凍干的產(chǎn)品，所得多肽經(jīng)質(zhì)譜測定證明為所求化合物。

色譜柱：bostonc18,5um,100a，波長214nm，waters制備型hplc

梯度：10％0.05％tfa/can-45％0.05％tfa/can20min，45％0.05％tfa/can維持10min。

圖1是定點(diǎn)保護(hù)exendin-4類似物maldi-tof質(zhì)譜圖

實(shí)施例2

定點(diǎn)保護(hù)exendin-4類似物聚乙二醇化的方法

本實(shí)施例用常規(guī)的氨基聚乙二醇化修飾試劑如(sc-peg，ss-peg，nhs-peg等)對定點(diǎn)保護(hù)exendin-4類似物上唯一游離的可被聚乙二醇化反應(yīng)的側(cè)鏈氨基進(jìn)行結(jié)合修飾。其中，聚乙二醇化試劑優(yōu)選40kdy型nhs-peg，定點(diǎn)保護(hù)exendin-4類似物優(yōu)選

(fmoc)his-gly-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-leu-ser-(dde)lys-gln-z-glu-glu-glu-ala-val-lys-leu-phe-ile-glu-trp-leu-(dde)lys-asn-gly-gly-pro-ser-ser-gly-ala-pro-pro-pro-ser-(dde)lys或者

(fmoc)his-gly-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-leu-ser-(dde)lys-gln-z-glu-glu-glu-ala-val-(dde)lys-leu-phe-ile-glu-trp-leu-(dde)lys-asn-gly-gly-pro-ser-ser-gly-ala-pro-pro-pro-ser-lys。

取定點(diǎn)保護(hù)exendin-4類似物2g，40kdy型nhs-peg26g(與多肽摩爾比約1.5：1)溶解于400mldmso，40℃保溫?cái)嚢璐偃堋４龢悠吠耆芙夂?，加入三乙?tea)200ul(0.05％)促發(fā)聚乙二醇化反應(yīng)，并于40℃繼續(xù)保溫?cái)嚢琛?h后聚乙二醇化反應(yīng)基本完成(90％以上，按定點(diǎn)保護(hù)exendin-4類似物計(jì))，加入聯(lián)氨8ml(2％)，40℃保溫?cái)嚢?h至保護(hù)基全部脫除反應(yīng)結(jié)束。終反應(yīng)溶液用純水稀釋10倍并立即用6mhcl調(diào)ph至6.04℃冷藏保存。

圖2是定點(diǎn)保護(hù)exendin-4類似物聚乙二醇化前后hplc色譜圖。

實(shí)施例3

聚乙二醇化exendin-4類似物分離純化方法

定點(diǎn)保護(hù)exendin-4類似物聚乙二醇化終反應(yīng)液分別經(jīng)反相hplc，離子交換，超濾濃縮，分子篩及冷凍干燥可獲得純的聚乙二醇化exendin-4類似物原料藥。

a、source反相hplc純化

流動(dòng)相：a相a相20mmhac5％乙腈；b相20mmhac50％乙腈

色譜柱：gefinelinepilot35

填料：source30rpc175ml

流速：30ml/min

洗脫梯度：上樣后平衡2個(gè)柱體積，0-30％5min,30％-100％5min

圖3是聚乙二醇化exendin-4類似物source純化色譜圖。

b、sp陽離子交換純化

流動(dòng)相：a相10mmph3.5cbs

b1相10mmph3.5cbs+0.15mnacl

b2相10mmph3.5cbs+1.5mnacl

色譜柱：gexk50

填料：spsepharosefastflow600ml

流速：30ml/min

洗脫梯度：0％－100％b1相20min，100％b1相-100％b2相0min

圖4是聚乙二醇化exendin-4類似物sp陽離子交換純化色譜圖。

c、超濾

裝置：10kdpall剪切式超濾膜

濾前樣品體積2400ml濾后體積400ml

一般重復(fù)超濾3次(1000ml－400ml)

d、g25脫鹽

流動(dòng)相：純水

色譜柱：gexk50

填料：g25；900ml

流速：30ml/min，

上樣量：200ml

圖5是聚乙二醇化exendin-4類似物分子篩除鹽色譜圖。

e、凍干

聚乙二醇化exendin-4類似物純水溶液共溶點(diǎn)約在-5℃左右，因此凍干步驟一次干燥設(shè)定溫度為-10℃，二次干燥設(shè)定溫度為5℃。其它參數(shù)(凍干時(shí)間及出箱溫度等)按照樣品量的多少，凍干機(jī)的效能及具體氣候條件酌情設(shè)定。

實(shí)施例4

正常c57小鼠腹腔注射糖耐量實(shí)驗(yàn)(iptt)

(1)實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：c57小鼠，購自于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，spf級。飼養(yǎng)于公司臨時(shí)動(dòng)物房，cl級。數(shù)量：60性別：公

試劑：exendin-4類似物(0.125ug/ml)；聚乙二醇化exendin-4類似物(3.125ug/ml，按裸肽計(jì))；葡萄糖試劑盒；20％葡萄糖注射液；注射用生理鹽水。

(2)實(shí)驗(yàn)方法

給藥組，每只小鼠給予聚乙二醇化exendin-4類似物(3.125ug/ml，按裸肽計(jì))0.2ml/20g；空白組，每只小鼠給予注射用生理鹽水0.2ml/20g；對照組，每只小鼠給予exendin-4類似物(0.125ug/ml)0.2ml/20g。糖負(fù)荷為測血糖前半小時(shí)腹腔注射20％葡萄糖水溶液0.2ml/20gb.w。于給藥后24h和72h，觀察受試動(dòng)物的降糖作用維持時(shí)間。

(3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

各個(gè)聚乙二醇化exendin-4類似物降糖作用維持時(shí)間效果見圖6。

序列表

<110>上海華誼生物技術(shù)有限公司

<120>聚乙二醇修飾的exendin或其類似物及其制劑

<130>ghy001

<160>269

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>40

<212>prt

<213>exendin-4類似物

<400>1

hisglygluglythrphethrseraspleuserlysglnleuglugluglualavallys

15101520

leupheileglutrpleulysasnglyglyproserserglyalaproproproserlys

25303540

<210>2

<211>39

<212>prt

<213>exendin-4類似物

<400>2

hisglygluglythrphethrseraspleuserlysglnileglugluglualavallys

15101520

leupheileglutrpleulysasnglyglyproserserglyalaproproproserlys

25303540