本發(fā)明涉及多肽藥物合成技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種利西拉來的制備方法。

背景技術(shù)：

利西拉來(lixisenatide)是胰高血糖素樣肽-1(glp-1)受體激動劑，是基于具降糖活性的glp-1類似物exendin-4的c末端6個賴氨酸殘基的修飾而合成的新型glp-1類似物，能耐受體內(nèi)二肽基肽酶ⅳ(dpp4)的降解作用。利西拉來的結(jié)構(gòu)如式i所示：

其肽序為：

h-his-gly-glu-gly-thr-phe-thr-ser-asp-leu-ser-lys-gln-met-glu-glu-glu-ala-val-arg-leu-phe-ile-glu-trp-leu-lys-asn-gly-gly-pro-ser-ser-gly-ala-pro-pro-ser-lys-lys-lys-lys-lys-lys-nh2

作為glp-1類似物的一種，利西拉來適用于服用二甲雙胍、磺脲類、噻唑烷二酮類、二甲雙胍和磺脲類聯(lián)用、二甲雙胍和噻唑烷二酮類聯(lián)用的ii型糖尿 病患者中，不能有效控制血糖的患者的輔助治療，以改善對血糖的控制。

目前一種常規(guī)合成利西拉來的方法是固相逐步合成(spps)法，該方法具有操作簡單、設(shè)備要求低等特點。但是因為利西拉來由44個氨基酸組成，固相逐步合成法的產(chǎn)品收率低，肽在合成樹脂上容易發(fā)生二級結(jié)構(gòu)的彎曲，導(dǎo)致反應(yīng)位點被包裹，得到的利西拉來粗肽純度低，雜質(zhì)繁雜，給產(chǎn)品純化帶來困難，不易得到較高純度的利西拉來。

對于解決偶聯(lián)困難的氨基酸問題，片段合成法是固相合成方法中一種常用的手段。片段合成法是先將偶聯(lián)困難的序列制備成全保護(hù)肽片段，按照氨基酸序列將其作為整體直接偶聯(lián)到指定肽樹脂上，從而避開偶聯(lián)困難的氨基酸位點，避免逐個氨基酸偶聯(lián)產(chǎn)生的缺損等副反應(yīng)，能夠獲得純度相對高的粗肽，降低純化難度。但片段合成法采用了常規(guī)的樹脂外，還需使用大量價格較昂貴的2-ctc樹脂制備片段肽樹脂，且2-ctc樹脂酸敏感性高，偶聯(lián)時肽容易從樹脂上脫落，從而導(dǎo)致制備的片段收率不高，操作步驟相對繁瑣，生產(chǎn)成本也大幅度提高。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供一種利西拉來的制備方法，該方法操作簡便，總收率高，所得產(chǎn)物純度較高。

本發(fā)明提供了一種利西拉來的制備方法，包括：

步驟1：固相合成fmoc-lys-樹脂；

步驟2：根據(jù)利西拉來的肽序在所述fmoc-lys-樹脂上偶聯(lián)氨基酸或二肽制得利西拉來肽樹脂；所述二肽選自-gly-thr、-phe-thr、-thr-ser、-leu-ser、-ser-ser或-pro-ser；

步驟3：所述利西拉來肽樹脂經(jīng)裂解制得利西拉來。

本發(fā)明提供的方法將利西拉來肽序中第4～5位(-gly-thr，記為二肽a)、第6～7位(-phe-thr，記為二肽b)、第7～8位(-thr-ser，記為二肽c)、第10～11位(-leu-ser，記為二肽d)、第32～33位(-ser-ser，記為二肽e)或第31～32位、第37～37位(-pro-ser，記為二肽f)的氨基酸以二肽為原料進(jìn)行偶聯(lián)，選用的二肽原料為二肽a～f中任一種或多種，不采用二肽為原料的位點則采用單個氨基酸為原料進(jìn)行偶聯(lián)。該方法能夠有效防止肽鍵旋轉(zhuǎn)，抑 制肽鏈卷曲劑收縮，使活性官能團(tuán)(伯胺)充分暴露，從而有利于氨基酸的偶聯(lián)，減少缺損等副反應(yīng)的發(fā)生。

在本發(fā)明的實施例中，

偶聯(lián)-gly-thr采用fmoc-gly-thr(psime,mepro)-oh；

偶聯(lián)-phe-thr采用fmoc-phe-thr(psime,mepro)-oh；

偶聯(lián)-thr-ser采用fmoc-thr(tbu)-ser(psime,mepro)-oh；

偶聯(lián)-leu-ser采用fmoc-leu-ser(psime,mepro)-oh；

偶聯(lián)-ser-ser采用fmoc-ser(tbu)-ser(psime,mepro)-oh；

偶聯(lián)-pro-ser采用fmoc-pro-ser(psime,mepro)-oh。

其中，fmoc-gly-thr(psime,mepro)-oh的結(jié)構(gòu)如式ii-a；

fmoc-phe-thr(psime,mepro)-oh的結(jié)構(gòu)如式ii-b；

fmoc-thr(tbu)-ser(psime,mepro)-oh的結(jié)構(gòu)如式ii-c；

fmoc-leu-ser(psime,mepro)-oh的結(jié)構(gòu)如式ii-d；

fmoc-ser(tbu)-ser(psime,mepro)-oh的結(jié)構(gòu)如式ii-e；

fmoc-pro-ser(psime,mepro)-oh的結(jié)構(gòu)如式ii-f。

在本發(fā)明中，fmoc-lys-樹脂的樹脂為rinkamide樹脂、rinkamide-mbha樹脂、rinkamide-am樹脂或siber樹脂。

其中，lys的保護(hù)基為boc。

作為優(yōu)選，fmoc-lys(boc)-樹脂的替代度為0.1mmol/g～0.6mmol/g。優(yōu)選的，替代度范圍為0.2mmol/g～0.4mmol/g。

在本發(fā)明的實施例中，偶聯(lián)的偶聯(lián)劑為hobt與dic的混合物；其中hobt與dic的摩爾比為1:1。

在本發(fā)明中，所述偶聯(lián)的步驟包括：脫除fmoc保護(hù)后，以dcm和dmf的混合液為溶劑，與偶聯(lián)劑混合后進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)。

作為優(yōu)選，脫除保護(hù)的樹脂與待偶聯(lián)氨基酸的摩爾比為1:3。

重復(fù)偶聯(lián)的步驟直至合成整個肽鏈。

在本發(fā)明中，偶聯(lián)反應(yīng)的條件為室溫反應(yīng)2h。所述室溫為10℃～30℃。

作為優(yōu)選，如偶聯(lián)反應(yīng)不完全則繼續(xù)偶聯(lián)反應(yīng)1h。

在本發(fā)明中，偶聯(lián)反應(yīng)結(jié)束后以甲醇收縮，樹脂真空干燥過夜。

在本發(fā)明的實施例中，裂解的裂解劑為裂解的裂解劑包括tfa與b組分；所述b組分選自phsme、phome、edt、h2o、tis或phoh。

作為優(yōu)選，裂解劑中tfa、phsme、phome、edt、h2o、tis、phoh的體積比為(80～90)：(0～5):(0～3):(0～5):(0～5)：(0～2)：(0～5)。

優(yōu)選的，裂解液中tfa、phsme、edt、tis、h2o的體積比為84:5:5:5:1。

優(yōu)選的，裂解劑中tfa、phsme、edt、h2o的體積比為91:3:3:3。

優(yōu)選的，裂解劑中tfa、phsme、edt、phome的體積比為90:5:3:2。

優(yōu)選的，裂解劑中tfa、edt、h2o的體積比為90:5:5。

優(yōu)選的，裂解劑中tfa、phsme、phoh、edt、h2o的體積比為85:5:3:5:2。

在本發(fā)明中，裂解的步驟包括：將利西拉來肽樹脂與裂解液混合，室溫裂解2.5h～3h后，以tfa洗滌樹脂、以無水乙醚沉淀，獲得利西拉來線性粗肽。

作為優(yōu)選，無水乙醚沉淀的溫度為0～4℃。

作為優(yōu)選，利西拉來肽樹脂與裂解液的質(zhì)量-體積比為1:8～15。

在本發(fā)明的實施例中，步驟3后還包括純化、轉(zhuǎn)鹽的步驟。

具體的，純化的色譜采用novaseprp-hplc系統(tǒng)，檢測波長220nm，色譜柱為反相c18柱，流動相a相為體積分?jǐn)?shù)為0.1％的tfa水溶液，流動相b相為乙腈。洗脫梯度為18％乙腈-48％乙腈45min，48％等度15min：純化后經(jīng)轉(zhuǎn)鹽色譜，轉(zhuǎn)鹽。

具體的轉(zhuǎn)鹽為轉(zhuǎn)化為醋酸鹽，鹽酸鹽，枸櫞酸鹽，磷酸鹽，三氟乙酸鹽，鈉鹽，鉀鹽或銨鹽。

在一些實施例中，僅引入二肽a，二肽c、二肽d、二肽e、二肽f，制備利西拉來。

偶聯(lián)具體為依次偶聯(lián)：fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-pro-ser(psime，mepro)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-ser(tbu)-ser(psime，mepro)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-gly-gly-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-met-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-leu-ser(psime，mepro)-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-ser(psime，mepro)-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-gly-thr(psime，mepro)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-gly-oh和boc-his(trt)-oh。

在一些實施例中，僅引入二肽a，二肽b、二肽d、二肽f，制備利西拉來。

偶聯(lián)具體為依次偶聯(lián)：fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-pro-ser(psime,mepro)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-gly-oh、 fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-pro-ser(psime,mepro)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-met-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-leu-ser(psime,mepro)-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-phe-thr(psime,mepro)-oh、fmoc-gly-thr(psime,mepro)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-gly-oh和boc-his(trt)-oh。

在一些實施例中，僅引入二肽a，二肽b、二肽d、二肽e，制備利西拉來。

偶聯(lián)具體為依次偶聯(lián)：fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-ser(tbu)-ser(psime,mepro)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-met-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-leu-ser(psime,mepro)-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-phe-thr(psime,mepro)-oh、fmoc-gly-thr(psime,mepro)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-gly-oh和boc-his(trt)-oh。

在一些實施例中，僅引入二肽b、二肽d、二肽e，制備利西拉來。

偶聯(lián)具體為依次偶聯(lián)：fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-ser(tbu)-ser(psime,mepro)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-ile-oh、 fmoc-phe-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-met-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-leu-ser(psime,mepro)-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-phe-thr(psime,mepro)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-gly-oh和boc-his(trt)-oh。

在一些實施例中，僅引入二肽c、二肽e，制備利西拉來。

偶聯(lián)具體為依次偶聯(lián)：fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-ser(tbu)-ser(psime,mepro)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-met-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-ser(psime,mepro)-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-gly-oh和boc-his(trt)-oh。

在一些實施例中，僅引入二肽e，制備利西拉來。

偶聯(lián)具體為依次偶聯(lián)：fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-ser(tbu)-ser(psime,mepro)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-met-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、 fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-phe--oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-gly-oh和boc-his(trt)-oh。

在一些實施例中，僅引入二肽d，制備利西拉來。

偶聯(lián)具體為依次偶聯(lián)：fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-met-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-leu-ser(psime,mepro)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-phe--oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-gly-oh或boc-his(trt)-oh。

在一些實施例中，僅引入二肽a，二肽b，二肽d，二肽e，二肽f，制備利西拉來。

偶聯(lián)具體為依次偶聯(lián)：fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-pro-ser(psime,mepro)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-ser(tbu)-ser(psime,mepro)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-met-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-leu-ser(psime,mepro)-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-phe-thr(psime,mepro)-oh、fmoc-gly-thr(psime,mepro)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-gly-oh和boc-his(trt)-oh。

本發(fā)明根據(jù)利西拉來肽的肽序結(jié)構(gòu)，采用特定的保護(hù)的絲氨酸二肽作為 原料偶聯(lián)到肽序中，由于形成了類似脯氨酸的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，能有效的防止肽鍵旋轉(zhuǎn)，抑制肽鏈卷曲劑收縮，使活性官能團(tuán)(伯胺)充分暴露，從而有利于氨基酸的偶聯(lián)，減少缺損等副反應(yīng)的發(fā)生。根據(jù)實驗，本發(fā)明精肽收率可高達(dá)25.8％～28.8％，優(yōu)于順序逐個偶聯(lián)方法(約15.4％)。同時，本發(fā)明精肽的純度為99.3％。在保證了純度的同時保證了收率。

附圖說明

圖1示實施例1制得制得粗肽的質(zhì)譜圖；

圖2示對比例1制得制得粗肽的質(zhì)譜圖。

具體實施方式

本發(fā)明提供了一種利西拉來的制備方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。

本發(fā)明采用的試劑或儀器皆為普通市售品，皆可于市場購得。

其中，各材料的名稱及縮寫如表1：

表1各材料的名稱及縮寫

下面結(jié)合實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：

實施例1

本實施例僅引入二肽a，二肽c、二肽d、二肽e、二肽f，制備利西拉來。

1.1fmoc-lys(boc)-rinkamide-mbharesin的制備

稱取干燥rinkamide-mbharesin380g(替代度為0.45mmol/g)加入到固相反應(yīng)柱中，首先dmf洗滌樹脂2遍，再用2～3倍樹脂床層體積dmf溶脹樹脂30分鐘，dmf洗滌3次，dcm洗滌2次，等待投料。

在冰浴冷卻的條件下，將238.9gfmoc-lys(boc)-oh(510mmol)、72.4ghoat(536mmol)溶于dmf和dcm的混合溶劑中，待氨基酸溶解后，慢慢加入dic67.5g(535mmol)，活化3min后將反應(yīng)液倒入反應(yīng)柱中，鼓氣攪拌反應(yīng)；采用茚三酮檢測樹脂反應(yīng)透明時停止反應(yīng)，dmf洗滌3遍，甲醇收縮、減壓干燥得fmoc-lys(boc)-rinkamide-mbharesin421克，檢測樹脂替代度為0.406mmol/g。

1.2lixisenatide肽樹脂的制備

取1.1方法制備的替代度為0.406mmol/g的fmoc-lys(boc)-rinkamide-mbharesin421g(230mmol)，加入固相反應(yīng)柱中，用dmf洗滌2次，用dmf溶脹樹脂30分鐘后，用dblk脫除fmoc保護(hù)，然后用dmf洗滌6次，。將239.1g(510mmol)fmoc-lys(boc)-oh，72.2g(536mmol)hobt，67.7g(535mmol)dic溶于體積比為1:1的dcm和dmf混合溶液，加入固相反應(yīng)柱中，室溫反應(yīng)2h(反應(yīng)終點以茚三酮法檢測為準(zhǔn)，如果樹脂無色透明，則反應(yīng)完全，樹脂顯色，表示反應(yīng)不完全，需再偶聯(lián)反應(yīng)1h至樹脂檢測透明)。

重復(fù)上述脫除fmoc保護(hù)和加入相應(yīng)氨基酸偶聯(lián)的步驟，按照片段的順序，采用一定的偶聯(lián)方法，依次完成fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-pro-ser(psime,mepro)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-ser(tbu)-ser(psime,mepro)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-gly-gly-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-met-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-leu-ser(psime,mepro)-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-ser(psime,mepro)-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-gly-thr(psime,mepro)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-gly-oh、boc-his(trt)-oh的偶聯(lián)。反應(yīng)結(jié)束后用甲醇收縮，樹脂真空干燥過夜，得到2018克lixisenatide肽樹脂。

1.3lixisenatide肽樹脂的裂解和精肽制備

取1.2得到的lixisenatide肽樹脂700g置于裂解反應(yīng)器中，以8ml/g(裂解液/樹脂)的裂解液用量入裂解試劑(tfa：phsme：edt：tis：h2o＝84:5:5:5:1，(v/v))，室溫攪拌2.5h。反應(yīng)物用砂芯漏斗過濾，收集濾液，樹脂再用少量tfa洗滌2次，合并濾液后減壓濃縮。加入冰凍的無水乙醚沉淀、離心，無水乙醚洗滌粗肽濾餅3次，真空干燥得到白色粉末固體，lixisenatide粗肽341g，質(zhì)譜(圖1)maldi-tof：(m+h)⁺＝4859.216。粗肽重量收率為 99.4％，hplc純度為69.1％。

取1.3中得到的lixisenatide粗肽44g進(jìn)行精制，溶解后采用novaseprp-hplc系統(tǒng)，波長220nm，色譜柱為反相c18柱，常規(guī)0.1％tfa/水、乙腈流動相體系純化后轉(zhuǎn)鹽，收集目的峰餾分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，凍干得到lixisenatide精肽12.6g，hplc純度99.3％，精肽收率28.8％。

實施例2

本實施例僅引入二肽a，二肽b、二肽d、二肽f，制備利西拉來。

2.1fmoc-lys(boc)-rinkamideresin的制備

稱取干燥rinkamideresin356g(替代度為0.42mmol/g)加入到固相反應(yīng)柱中，首先dmf洗滌樹脂2遍，再用2～3倍樹脂床層體積dmf溶脹樹脂30分鐘，dmf洗滌3次，dcm洗滌2次，等待投料。

在冰浴冷卻的條件下，將210.9gfmoc-lys(boc)-oh(450mmol)、63.8ghobt(473mmol)、170.6ghbtu(450mmol)溶于dmf和dcm的混合溶劑中，待氨基酸溶解后，慢慢加入dipea87.6g(675mmol)，活化3min后將反應(yīng)液倒入反應(yīng)柱中，鼓氣攪拌反應(yīng)；采用茚三酮檢測樹脂反應(yīng)透明時停止反應(yīng)，dmf洗滌3遍，甲醇收縮、減壓干燥得fmoc-lys(boc)-rinkamideresin390克，檢測樹脂替代度為0.385mmol/g。

2.2lixisenatide肽樹脂的制備

取2.1方法制備的替代度為0.385mmol/g的fmoc-lys(boc)-rinkamideresin421g(150mmol)，加入固相反應(yīng)柱中，用dmf洗滌2次，用dmf溶脹樹脂30分鐘后，用dblk脫除fmoc保護(hù)，然后用dmf洗滌6次，。將211.3g(450mmol)fmoc-lys(boc)-oh，64.8g(473mmol)hobt，63.9g(473mmol)dic溶于體積比為1:1的dcm和dmf混合溶液，加入固相反應(yīng)柱中，室溫反應(yīng)2h(反應(yīng)終點以茚三酮法檢測為準(zhǔn)，如果樹脂無色透明，則反應(yīng)完全，樹脂顯色，表示反應(yīng)不完全，需再偶聯(lián)反應(yīng)1h至樹脂檢測透明)。

重復(fù)上述脫除fmoc保護(hù)和加入相應(yīng)氨基酸偶聯(lián)的步驟，按照片段的順序，采用一定的偶聯(lián)方法，依次完成fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-pro-ser(psime,mepro)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、 fmoc-pro-ser(psime,mepro)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-met-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-leu-ser(psime,mepro)-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-phe-thr(psime,mepro)-oh、fmoc-gly-thr(psime,mepro)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-gly-oh、boc-his(trt)-oh的偶聯(lián)。反應(yīng)結(jié)束后用甲醇收縮，樹脂真空干燥過夜，得到1611克lixisenatide肽樹脂。

2.3lixisenatide肽樹脂的裂解和精肽制備

取2.2得到的lixisenatide肽樹脂600g置于裂解反應(yīng)器中，以10ml/g(裂解液/樹脂)的裂解液用量入裂解試劑(tfa：phsme：edt：h2o＝91:3:3:3，(v/v))，室溫攪拌2.5h。反應(yīng)物用砂芯漏斗過濾，收集濾液，樹脂再用少量tfa洗滌2次，合并濾液后減壓濃縮。加入冰凍的無水乙醚沉淀、離心，無水乙醚洗滌粗肽濾餅3次，真空干燥得到白色粉末固體，lixisenatide粗肽251g，質(zhì)譜maldi-tof：(m+h)⁺＝4859.017。粗肽重量收率為101.2％，hplc純度為66.6％。

取2.3中得到的lixisenatide粗肽47g進(jìn)行精制，溶解后采用novaseprp-hplc系統(tǒng)，波長220nm，色譜柱為反相c18柱，常規(guī)0.1％tfa/水、乙腈流動相體系純化后轉(zhuǎn)鹽，收集目的峰餾分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，凍干得到lixisenatide精肽12.4g，hplc純度99.1％，精肽收率26.4％。

實施例3

本實施例僅引入二肽a，二肽b、二肽d、二肽e，制備利西拉來。

3.1fmoc-lys(boc)-siberresin的制備

稱取干燥siberresin155g(替代度為0.35mmol/g)加入到固相反應(yīng)柱中，首先dmf洗滌樹脂2遍，再用2～3倍樹脂床層體積dmf溶脹樹脂30分鐘，dmf洗滌3次，dcm洗滌2次，等待投料。

在冰浴冷卻的條件下，將77.6gfmoc-lys(boc)-oh(165mmol)、23.5g hobt(173mmol)溶于dmf和dcm的混合溶劑中，待氨基酸溶解后，慢慢加入dic22.1g(173mmol)，活化3min后將反應(yīng)液倒入反應(yīng)柱中，鼓氣攪拌反應(yīng)；采用茚三酮檢測樹脂反應(yīng)透明時停止反應(yīng)，dmf洗滌3遍，甲醇收縮、減壓干燥得fmoc-lys(boc)-siberresin368克，檢測樹脂替代度為0.323mmol/g。

3.2lixisenatide肽樹脂的制備

取3.1方法制備的替代度為0.323mmol/g的fmoc-lys(boc)-siberresin368g(54mmol)，加入固相反應(yīng)柱中，用dmf洗滌2次，用dmf溶脹樹脂30分鐘后，用dblk脫除fmoc保護(hù)，然后用dmf洗滌6次，。將77.9g(165mmol)fmoc-lys(boc)-oh，23.5g(173mmol)hobt，22.4g(173mmol)dic溶于體積比為1:1的dcm和dmf混合溶液，加入固相反應(yīng)柱中，室溫反應(yīng)2h(反應(yīng)終點以茚三酮法檢測為準(zhǔn)，如果樹脂無色透明，則反應(yīng)完全，樹脂顯色，表示反應(yīng)不完全，需再偶聯(lián)反應(yīng)1h至樹脂檢測透明)。

重復(fù)上述脫除fmoc保護(hù)和加入相應(yīng)氨基酸偶聯(lián)的步驟，按照片段的順序，采用一定的偶聯(lián)方法，依次完成fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-ser(tbu)-ser(psime,mepro)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-met-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-leu-ser(psime,mepro)-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-phe-thr(psime,mepro)-oh、fmoc-gly-thr(psime,mepro)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-gly-oh、boc-his(trt)-oh的偶聯(lián)。反應(yīng)結(jié)束后用甲醇收縮，樹脂真空干燥過夜，得到831克lixisenatide肽樹脂。

3.3lixisenatide肽樹脂的裂解和精肽制備

取3.2得到的lixisenatide肽樹脂800g置于裂解反應(yīng)器中，以12ml/g(裂解液/樹脂)的裂解液用量入裂解試劑(tfa：phsme：edt：phome＝90:5:3:2，(v/v))，室溫攪拌3h。反應(yīng)物用砂芯漏斗過濾，收集濾液，樹脂再用少量tfa洗滌2次，合并濾液后減壓濃縮。加入冰凍的無水乙醚沉淀、離心，無 水乙醚洗滌粗肽濾餅3次，真空干燥得到白色粉末固體，lixisenatide粗肽241g，質(zhì)譜maldi-tof：(m+h)⁺＝4859.512。粗肽重量收率為98.9％，hplc純度為68.4％。

取3.3中得到的lixisenatide粗肽50g進(jìn)行精制，溶解后采用novaseprp-hplc系統(tǒng)，波長220nm，色譜柱為反相c18柱，常規(guī)0.1％tfa/水、乙腈流動相體系純化后轉(zhuǎn)鹽，收集目的峰餾分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，凍干得到lixisenatide精肽13.7g，hplc純度99.2％，精肽收率27.4％。

實施例4

本實施例僅引入二肽b、二肽d、二肽e，制備利西拉來。

4.1fmoc-lys(boc)-rinkamide-mbharesin的制備

稱取干燥rinkamide-mbharesin135g(替代度為0.24mmol/g)加入到固相反應(yīng)柱中，首先dmf洗滌樹脂2遍，再用2～3倍樹脂床層體積dmf溶脹樹脂30分鐘，dmf洗滌3次，dcm洗滌2次，等待投料。

在冰浴冷卻的條件下，將46.8gfmoc-lys(boc)-oh(100mmol)、14.2ghobt(105mmol)溶于dmf和dcm的混合溶劑中，待氨基酸溶解后，慢慢加入dic13.5g(105mmol)，活化3min后將反應(yīng)液倒入反應(yīng)柱中，鼓氣攪拌反應(yīng)；采用茚三酮檢測樹脂反應(yīng)透明時停止反應(yīng)，dmf洗滌3遍，甲醇收縮、減壓干燥得fmoc-lys(boc)-siberresin143克，檢測樹脂替代度為0.223mmol/g。

4.2lixisenatide肽樹脂的制備

取4.1方法制備的替代度為0.223mmol/g的fmoc-lys(boc)-rinkamide-mbharesin143g(32mmol)，加入固相反應(yīng)柱中，用dmf洗滌2次，用dmf溶脹樹脂30分鐘后，用dblk脫除fmoc保護(hù)，然后用dmf洗滌6次，將45.6g(96mmol)fmoc-lys(boc)-oh，13.8g(101mmol)hobt，12.7g(101mmol)dic溶于體積比為1:1的dcm和dmf混合溶液，加入固相反應(yīng)柱中，室溫反應(yīng)2h(反應(yīng)終點以茚三酮法檢測為準(zhǔn)，如果樹脂無色透明，則反應(yīng)完全，樹脂顯色，表示反應(yīng)不完全，需再偶聯(lián)反應(yīng)1h至樹脂檢測透明)。

重復(fù)上述脫除fmoc保護(hù)和加入相應(yīng)氨基酸偶聯(lián)的步驟，按照片段的順序，采用一定的偶聯(lián)方法，依次完成fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-pro-oh、 fmoc-pro-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-ser(tbu)-ser(psime,mepro)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-met-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-leu-ser(psime,mepro)-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-phe-thr(psime,mepro)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-gly-oh、boc-his(trt)-oh的偶聯(lián)。反應(yīng)結(jié)束后用甲醇收縮，樹脂真空干燥過夜，得到401克lixisenatide肽樹脂。

4.3lixisenatide肽樹脂的裂解和精肽制備

取4.2得到的lixisenatide肽樹脂400g置于裂解反應(yīng)器中，以15ml/g(裂解液/樹脂)的裂解液用量入裂解試劑(tfa：phsme：edt：phoh：h2o＝85:5:3:5:2，(v/v))，室溫攪拌3h。反應(yīng)物用砂芯漏斗過濾，收集濾液，樹脂再用少量tfa洗滌2次，合并濾液后減壓濃縮。加入冰凍的無水乙醚沉淀、離心，無水乙醚洗滌粗肽濾餅3次，真空干燥得到白色粉末固體，lixisenatide粗肽156g，質(zhì)譜maldi-tof：(m+h)⁺＝4859.347。粗肽重量收率為102.6％，hplc純度為67.9％。

取4.3中得到的lixisenatide粗肽46g進(jìn)行精制，溶解后采用novaseprp-hplc系統(tǒng)，波長220nm，色譜柱為反相c18柱，常規(guī)0.1％tfa/水、乙腈流動相體系純化后轉(zhuǎn)鹽，收集目的峰餾分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，凍干得到lixisenatide精肽11.6g，hplc純度99.3％，精肽收率27.1％。

實施例5

本實施例僅引入二肽c、二肽e，制備利西拉來。

5.1fmoc-lys(boc)-rinkamide-amresin的制備

稱取干燥rinkamide-amresin547g(替代度為0.56mmol/g)加入到固相反應(yīng)柱中，首先dmf洗滌樹脂2遍，再用2～3倍樹脂床層體積dmf溶脹樹脂30分鐘，dmf洗滌3次，dcm洗滌2次，等待投料。

在冰浴冷卻的條件下，將431.2gfmoc-lys(boc)-oh(918mmol)、130.5g hobt(964mmol)溶于dmf和dcm的混合溶劑中，待氨基酸溶解后，慢慢加入dic121.5g(964mmol)，活化3min后將反應(yīng)液倒入反應(yīng)柱中，鼓氣攪拌反應(yīng)；采用茚三酮檢測樹脂反應(yīng)透明時停止反應(yīng)，dmf洗滌3遍，甲醇收縮、減壓干燥得fmoc-lys(boc)-rinkamide-amresin621克，檢測樹脂替代度為0.508mmol/g。

5.2lixisenatide肽樹脂的制備

取5.1方法制備的替代度為0.508mmol/g的fmoc-lys(boc)-rinkamide-amresin207g(105mmol)，加入固相反應(yīng)柱中，用dmf洗滌2次，用dmf溶脹樹脂30分鐘后，用dblk脫除fmoc保護(hù)，然后用dmf洗滌6次，。將147.6g(315mmol)fmoc-lys(boc)-oh，44.8g(330mmol)hobt，41.6g(330mmol)dic溶于體積比為1:1的dcm和dmf混合溶液，加入固相反應(yīng)柱中，室溫反應(yīng)2h(反應(yīng)終點以茚三酮法檢測為準(zhǔn)，如果樹脂無色透明，則反應(yīng)完全，樹脂顯色，表示反應(yīng)不完全，需再偶聯(lián)反應(yīng)1h至樹脂檢測透明)。

重復(fù)上述脫除fmoc保護(hù)和加入相應(yīng)氨基酸偶聯(lián)的步驟，按照片段的順序，采用一定的偶聯(lián)方法，依次完成fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-ser(tbu)-ser(psime,mepro)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-met-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-ser(psime,mepro)-oh、fmoc-phe--oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-gly-oh、boc-his(trt)-oh的偶聯(lián)。反應(yīng)結(jié)束后用甲醇收縮，樹脂真空干燥過夜，得到1046克lixisenatide肽樹脂。

5.3lixisenatide肽樹脂的裂解和精肽制備

取5.2得到的lixisenatide肽樹脂1000g置于裂解反應(yīng)器中，以10ml/g(裂解液/樹脂)的裂解液用量入裂解試劑(tfa：edt：h2o＝90:5:5，(v/v))， 室溫攪拌3h。反應(yīng)物用砂芯漏斗過濾，收集濾液，樹脂再用少量tfa洗滌2次，合并濾液后減壓濃縮。加入冰凍的無水乙醚沉淀、離心，無水乙醚洗滌粗肽濾餅3次，真空干燥得到白色粉末固體，lixisenatide粗肽487g，質(zhì)譜maldi-tof：(m+h)⁺＝4859.109。粗肽重量收率為100.6％，hplc純度為67.1％。

取5.3中得到的lixisenatide粗肽43g進(jìn)行精制，溶解后采用novaseprp-hplc系統(tǒng)，波長220nm，色譜柱為反相c18柱，常規(guī)0.1％tfa/水、乙腈流動相體系純化后轉(zhuǎn)鹽，收集目的峰餾分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，凍干得到lixisenatide精肽11.9g，hplc純度99.3％，精肽收率28.1％。

實施例6

本實施例僅引入二肽e，制備利西拉來。

6.1fmoc-lys(boc)-rinkamide-amresin的制備

稱取干燥rinkamide-amresin547g(替代度為0.56mmol/g)加入到固相反應(yīng)柱中，首先dmf洗滌樹脂2遍，再用2～3倍樹脂床層體積dmf溶脹樹脂30分鐘，dmf洗滌3次，dcm洗滌2次，等待投料。

在冰浴冷卻的條件下，將431.2gfmoc-lys(boc)-oh(918mmol)、130.5ghobt(964mmol)溶于dmf和dcm的混合溶劑中，待氨基酸溶解后，慢慢加入dic121.5g(964mmol)，活化3min后將反應(yīng)液倒入反應(yīng)柱中，鼓氣攪拌反應(yīng)；采用茚三酮檢測樹脂反應(yīng)透明時停止反應(yīng)，dmf洗滌3遍，甲醇收縮、減壓干燥得fmoc-lys(boc)-rinkamide-amresin621克，檢測樹脂替代度為0.508mmol/g。

6.2lixisenatide肽樹脂的制備

取6.1方法制備的替代度為0.508mmol/g的fmoc-lys(boc)-rinkamide-amresin137g(70mmol)，加入固相反應(yīng)柱中，用dmf洗滌2次，用dmf溶脹樹脂30分鐘后，用dblk脫除fmoc保護(hù)，然后用dmf洗滌6次。將98.5g(210mmol)fmoc-lys(boc)-oh，30.6g(220mmol)hobt，27.9g(220mmol)dic溶于體積比為1:1的dcm和dmf混合溶液，加入固相反應(yīng)柱中，室溫反應(yīng)2h(反應(yīng)終點以茚三酮法檢測為準(zhǔn)，如果樹脂無色透明，則反應(yīng)完全，樹脂顯色，表示反應(yīng)不完全，需再偶聯(lián)反應(yīng)1h至樹脂檢測透明)。

重復(fù)上述脫除fmoc保護(hù)和加入相應(yīng)氨基酸偶聯(lián)的步驟，按照片段的順序，采用一定的偶聯(lián)方法，依次完成fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-ser(tbu)-ser(psime,mepro)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-met-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-phe--oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-gly-oh、boc-his(trt)-oh的偶聯(lián)。反應(yīng)結(jié)束后用甲醇收縮，樹脂真空干燥過夜，得到728克lixisenatide肽樹脂。

6.3lixisenatide肽樹脂的裂解和精肽制備

取6.2得到的lixisenatide肽樹脂728g置于裂解反應(yīng)器中，以10ml/g(裂解液/樹脂)的裂解液用量入裂解試劑(tfa：edt：h2o＝90:5:5，(v/v))，室溫攪拌3h。反應(yīng)物用砂芯漏斗過濾，收集濾液，樹脂再用少量tfa洗滌2次，合并濾液后減壓濃縮。加入冰凍的無水乙醚沉淀、離心，無水乙醚洗滌粗肽濾餅3次，真空干燥得到白色粉末固體，lixisenatide粗肽338.9g，質(zhì)譜maldi-tof：(m+h)⁺＝4859.205。粗肽重量收率為99.6％，hplc純度為61.8％。

取6.3中得到的lixisenatide粗肽58g進(jìn)行精制，溶解后采用novaseprp-hplc系統(tǒng)，波長220nm，色譜柱為反相c18柱，常規(guī)0.1％tfa/水、乙腈流動相體系純化后轉(zhuǎn)鹽，收集目的峰餾分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，凍干得到lixisenatide精肽14.9g，hplc純度99.2％，精肽收率25.8％。

實施例7

本實施例僅引入二肽d，制備利西拉來。

7.1fmoc-lys(boc)-rinkamide-amresin的制備

稱取干燥rinkamide-amresin547g(替代度為0.56mmol/g)加入到固相反應(yīng)柱中，首先dmf洗滌樹脂2遍，再用2～3倍樹脂床層體積dmf溶脹 樹脂30分鐘，dmf洗滌3次，dcm洗滌2次，等待投料。

在冰浴冷卻的條件下，將431.2gfmoc-lys(boc)-oh(918mmol)、130.5ghobt(964mmol)溶于dmf和dcm的混合溶劑中，待氨基酸溶解后，慢慢加入dic121.5g(964mmol)，活化3min后將反應(yīng)液倒入反應(yīng)柱中，鼓氣攪拌反應(yīng)；采用茚三酮檢測樹脂反應(yīng)透明時停止反應(yīng)，dmf洗滌3遍，甲醇收縮、減壓干燥得fmoc-lys(boc)-rinkamide-amresin621克，檢測樹脂替代度為0.508mmol/g。

7.2lixisenatide肽樹脂的制備

取7.1方法制備的替代度為0.508mmol/g的fmoc-lys(boc)-rinkamide-amresin137g(70mmol)，加入固相反應(yīng)柱中，用dmf洗滌2次，用dmf溶脹樹脂30分鐘后，用dblk脫除fmoc保護(hù)，然后用dmf洗滌6次。將98.5g(210mmol)fmoc-lys(boc)-oh，31.6g(220mmol)hoat，27.9g(220mmol)dic溶于體積比為1:1的dcm和dmf混合溶液，加入固相反應(yīng)柱中，室溫反應(yīng)2h(反應(yīng)終點以茚三酮法檢測為準(zhǔn)，如果樹脂無色透明，則反應(yīng)完全，樹脂顯色，表示反應(yīng)不完全，需再偶聯(lián)反應(yīng)1h至樹脂檢測透明)。

重復(fù)上述脫除fmoc保護(hù)和加入相應(yīng)氨基酸偶聯(lián)的步驟，按照片段的順序，采用一定的偶聯(lián)方法，依次完成fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-met-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-leu-ser(psime,mepro)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-phe--oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-gly-oh、boc-his(trt)-oh的偶聯(lián)。反應(yīng)結(jié)束后用甲醇收縮，樹脂真空干燥過夜，得到742克lixisenatide肽樹脂。

7.3lixisenatide肽樹脂的裂解和精肽制備

取7.2得到的lixisenatide肽樹脂742g置于裂解反應(yīng)器中，以10ml/g(裂解液/樹脂)的裂解液用量入裂解試劑(tfa：phsme：phoh：edt：h2o＝85:5:3:5:2，(v/v))，室溫攪拌3h。反應(yīng)物用砂芯漏斗過濾，收集濾液，樹脂再用少量tfa洗滌2次，合并濾液后減壓濃縮。加入冰凍的無水乙醚沉淀、離心，無水乙醚洗滌粗肽濾餅3次，真空干燥得到白色粉末固體，lixisenatide粗肽341.3g，質(zhì)譜maldi-tof：(m+h)⁺＝4859.318。粗肽重量收率為100.8％，hplc純度為59.6％。

取7.3中得到的lixisenatide粗肽48g進(jìn)行精制，溶解后采用novaseprp-hplc系統(tǒng)，波長220nm，色譜柱為反相c18柱，常規(guī)0.1％tfa/水、乙腈流動相體系純化后轉(zhuǎn)鹽，收集目的峰餾分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，凍干得到lixisenatide精肽12.8g，hplc純度99.1％，精肽收率26.6％。

實施例8

本實施例僅引入二肽a，二肽b，二肽d，二肽e，二肽f，制備利西拉來。

8.1fmoc-lys(boc)-rinkamide-amresin的制備

稱取干燥rinkamide-amresin547g(替代度為0.56mmol/g)加入到固相反應(yīng)柱中，首先dmf洗滌樹脂2遍，再用2～3倍樹脂床層體積dmf溶脹樹脂30分鐘，dmf洗滌3次，dcm洗滌2次，等待投料。

在冰浴冷卻的條件下，將431.2gfmoc-lys(boc)-oh(918mmol)、130.5ghobt(964mmol)溶于dmf和dcm的混合溶劑中，待氨基酸溶解后，慢慢加入dic121.5g(964mmol)，活化3min后將反應(yīng)液倒入反應(yīng)柱中，鼓氣攪拌反應(yīng)；采用茚三酮檢測樹脂反應(yīng)透明時停止反應(yīng)，dmf洗滌3遍，甲醇收縮、減壓干燥得fmoc-lys(boc)-rinkamide-amresin621克，檢測樹脂替代度為0.508mmol/g。

8.2lixisenatide肽樹脂的制備

取8.1方法制備的替代度為0.508mmol/g的fmoc-lys(boc)-rinkamide-amresin136g(70mmol)，加入固相反應(yīng)柱中，用dmf洗滌2次，用dmf溶脹樹脂30分鐘后，用dblk脫除fmoc保護(hù)，然后用dmf洗滌6次。將98.5g(210mmol)fmoc-lys(boc)-oh，31.6g(220mmol)hoat，109.5g (210mmol)pyaop，54.3g(420mmol)dipea溶于體積比為1:1的dcm和dmf混合溶液，加入固相反應(yīng)柱中，室溫反應(yīng)2h(反應(yīng)終點以茚三酮法檢測為準(zhǔn)，如果樹脂無色透明，則反應(yīng)完全，樹脂顯色，表示反應(yīng)不完全，需再偶聯(lián)反應(yīng)1h至樹脂檢測透明)。

重復(fù)上述脫除fmoc保護(hù)和加入相應(yīng)氨基酸偶聯(lián)的步驟，按照片段的順序，采用一定的偶聯(lián)方法，依次完成fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-pro-ser(psime,mepro)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-ser(tbu)-ser(psime,mepro)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-met-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-leu-ser(psime,mepro)-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-phe-thr(psime,mepro)-oh、fmoc-gly-thr(psime,mepro)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-gly-oh、boc-his(trt)-oh的偶聯(lián)。反應(yīng)結(jié)束后用甲醇收縮，樹脂真空干燥過夜，得到751克lixisenatide肽樹脂。

8.3lixisenatide肽樹脂的裂解和精肽制備

取8.2得到的lixisenatide肽樹脂742g置于裂解反應(yīng)器中，以10ml/g(裂解液/樹脂)的裂解液用量入裂解試劑(tfa：phsme：phoh：edt：h2o＝85:5:3:5:2，(v/v))，室溫攪拌3h。反應(yīng)物用砂芯漏斗過濾，收集濾液，樹脂再用少量tfa洗滌2次，合并濾液后減壓濃縮。加入冰凍的無水乙醚沉淀、離心，無水乙醚洗滌粗肽濾餅3次，真空干燥得到白色粉末固體，lixisenatide粗肽335.6g，質(zhì)譜maldi-tof：(m+h)⁺＝4859.478。粗肽重量收率為97.6％，hplc純度為68.9％。

取8.3中得到的lixisenatide粗肽52g進(jìn)行精制，溶解后采用novaseprp-hplc系統(tǒng)，波長220nm，色譜柱為反相c18柱，常規(guī)0.1％tfa/水、乙腈流動相體系純化后轉(zhuǎn)鹽，收集目的峰餾分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，凍干得到lixisenatide精肽14.5g，hplc純度99.2％，精肽收率27.9％。

對比例1

d1.1fmoc-lys(boc)-rinkamide-amresin的制備

稱取干燥rinkamide-amresin410g(替代度為0.56mmol/g)加入到固相反應(yīng)柱中，首先dmf洗滌樹脂2遍，再用2～3倍樹脂床層體積dmf溶脹樹脂30分鐘，dmf洗滌3次，dcm洗滌2次，等待投料。

在冰浴冷卻的條件下，將323.5gfmoc-lys(boc)-oh(690mmol)、97.9ghobt(725mmol)溶于dmf和dcm的混合溶劑中，待氨基酸溶解后，慢慢加入dic92.4g(725mmol)，活化3min后將反應(yīng)液倒入反應(yīng)柱中，鼓氣攪拌反應(yīng)；采用茚三酮檢測樹脂反應(yīng)透明時停止反應(yīng)，dmf洗滌3遍，甲醇收縮、減壓干燥得fmoc-lys(boc)-rinkamide-amresin462克，檢測樹脂替代度為0.51mmol/g。

d1.2順序偶聯(lián)制備lixisenatide肽樹脂

取d1.1方法制備的替代度為0.51mmol/g的fmoc-lys(boc)-rinkamide-amresin462g(230mmol)，加入固相反應(yīng)柱中，用dmf洗滌2次，用dmf溶脹樹脂30分鐘后，用dblk脫除fmoc保護(hù)，然后用dmf洗滌6次，。將323.6g(690mmol)fmoc-lys(boc)-oh，98.1g(725mmol)hobt，92.4g(724mmol)dic溶于體積比為1:1的dcm和dmf混合溶液，加入固相反應(yīng)柱中，室溫反應(yīng)2h(反應(yīng)終點以茚三酮法檢測為準(zhǔn)，如果樹脂無色透明，則反應(yīng)完全，樹脂顯色，表示反應(yīng)不完全，需再偶聯(lián)反應(yīng)1h至樹脂檢測透明)。

重復(fù)上述脫除fmoc保護(hù)和加入相應(yīng)氨基酸偶聯(lián)的步驟，按照片段的順序，采用一定的偶聯(lián)方法，依次完成fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-pro-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-asn(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-trp(boc)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-ile-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-arg(pbf)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-ala-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-met-oh、fmoc-gln(trt)-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-leu-oh、fmoc-asp(otbu)-oh、 fmoc-ser(tbu)-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-phe-oh、fmoc-thr(tbu)-oh、fmoc-gly-oh、fmoc-glu(otbu)-oh、fmoc-gly-oh、boc-his(trt)-oh的偶聯(lián)。反應(yīng)結(jié)束后用甲醇收縮，樹脂真空干燥過夜，得到2350克lixisenatide肽樹脂。

d1.3lixisenatide肽樹脂的裂解和精肽制備

稱取d1.2得到的lixisenatide肽樹脂800克置于裂解反應(yīng)器中，以12ml/g(裂解液/樹脂)的裂解液用量入裂解試劑(tfa：phsme：phoh：edt：h2o＝85:5:3:5:2，(v/v))，室溫攪拌3h。反應(yīng)物用砂芯漏斗過濾，收集濾液，樹脂再用少量tfa洗滌2次，合并濾液后減壓濃縮。加入冰凍的無水乙醚沉淀、離心，無水乙醚洗滌粗肽濾餅3次，真空干燥得到白色粉末固體，lixisenatide粗肽370.6g，質(zhì)譜(圖2)maldi-tof：(m+h)⁺＝4859.288。粗肽重量收率為96.8％，hplc純度為44.5％。

取d1.3中得到的lixisenatide粗肽49g進(jìn)行精制，溶解后采用novaseprp-hplc系統(tǒng)，波長220nm，色譜柱為反相c18柱，常規(guī)0.1％tfa/水、乙腈流動相體系純化后轉(zhuǎn)鹽，收集目的峰餾分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，凍干得到lixisenatide精肽7.5g，hplc純度98.6％，精肽收率15.4％。

實施例9

檢測實施例1～8和對比例1制得的精肽。其中，對實施例1制得粗肽的質(zhì)譜圖如圖1，對對比例1制得粗肽的質(zhì)譜圖如圖2。其他各實施例制得產(chǎn)品的質(zhì)譜圖與此相似。各實施例獲得多肽純度和收率如表2：

表2多肽純度和收率

結(jié)果顯示，引入二肽片段的技術(shù)方案無論從粗肽純度、精肽純度還是精肽收率上都高于對比例方案。

以上僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。