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用于從含有凝血因子的溶液中減少和/或除去FXI和FXIa的方法與流程

文檔序號:12814580閱讀:895來源:國知局

(本申請是申請日為2011年11月16日、申請?zhí)枮?01180054753.5(國際申請?zhí)枮閜ct/ep2011/070257)的發(fā)明申請的分案申請。)

本發(fā)明涉及用于從含有凝血因子(或稱凝結(jié)因子)的溶液中減少和/或除去fxi和fxia的方法、可通過本發(fā)明方法獲得的含有fxi和fxia的濃縮物、以及可通過本發(fā)明方法獲得的含有fxi和fxia的藥物組合物。



背景技術(shù):

已知凝血因子xi(fxi)是一種與血液凝固有關(guān)的蛋白并且代表了凝血級聯(lián)的一部分內(nèi)源性途徑(intrinsicpathway)。fxi是活化的fxi(fxia)的前體,其是一種在凝血過程中的活性化合物。因此,從將要被靜脈施加于患者的藥物制劑中除去fxia是非常重要的,因為fxia會無意之中引發(fā)凝血從而引起危及生命的血栓形成事件。另一方面,fxi和/或fxia的濃縮物對于患有與缺少fxi活性或fxi活性不足相關(guān)的疾病的患者或嚴(yán)重失血的患者可能是有益的,在這些情況下快速且有效的凝血具有生死攸關(guān)的重要性。這樣的濃縮物對于患有例如血友病a和血友病b中的凝血因子的抑制性抗體的患者也是有益的。這些抑制劑能夠?qū)е鲁鲅录?,從而患者需要用藥以促進凝血和傷口閉合。

因此,本發(fā)明的一個目的是從含有fxi和/或fxia的溶液中除去或至少減少fxi和/或fxia。本發(fā)明的另一個目的是通過所提到的方法提供fxi、fxia的可治療應(yīng)用的濃縮物或包含fxi和fxia的混合物的可治療應(yīng)用的濃縮物。

已知幾種制備fxi濃縮物的方法。bouma和griffin在thejournalofbiologicalchemistry,1977,vol.252,no.18,pp.6432-6437中公開了一種通過五個層析步驟從人血漿提純fxi的方法。以時間順序使用的層析材料為(兩次)以及最后為與結(jié)合的伴刀豆球蛋白a。所使用的全部緩沖液均含有和芐瞇。

m.burnouf-radosevich和t.burnouf在transfusion,1992,32,pp.861-867中報道了通過在吸附fxi的帶負電荷的過濾器(zetaplus50s)上過濾cryo-poor血漿(或稱冰凍-貧血漿),洗脫被吸附的fxi以及在陽離子交換樹脂(fastflow)上對洗脫液實施層析以產(chǎn)生fxi凍干物(lyophilisate)。洗脫的fxi與抗凝血酶和肝素一起配制,然后凍干。

hiroshlmashiko和hidenobutakahashi在biol.chem.hoppe-seyler,1994,vol.375,pp.481-484中披露了基于高分子量激肽原-親和層析和在上進行層析的豬fxi和fxia的制備方法。為了避免接觸活化并克服蛋白水解消化,他們向所使用的緩沖液中加入了和芐瞇。他們還報道了他們未能通過肝素--親和層析純化fxi。

hiroshlmashiko和hidenobutakahashi在agentsandactionssupplements,(birkhaeuserverlag,basel,ch),1992,vol.38,part2,pp.249-256中的另一篇論文討論了基于高分子量激肽原、和蛋白以及存在于緩沖液中的和芐瞇的豬fxi和fxia的制備方法。

tait和fujikawa在journalofbiologicalchemistry,1981,vol.262,no.24,pp.11651-11656中披露了一種通過三個層析步驟并使用緩沖液中的和芐瞇從人血漿中純化fxi和激肽釋放酶原的方法。將代表高分子量激肽原輕鏈的一部分的合成肽固定在載體上并用于從血漿分離激肽釋放酶原、fxi和igg的一些遺留物(carryover)。隨后通過肝素-瓊脂糖層析分離激肽釋放酶原和fxi,最后通過精制以獲得較純的fxi和激肽釋放酶原流分。

saito等人在thejournalofclinicalinvestigation,vol.52,pp.850-861,1973中提出了一種fxi的純化方法,包括在ca3(po4)2上吸附血漿,多次硫酸銨分餾,以及在(兩次)、-g150、上連續(xù)層析,其中存在以防止fxi的活化。



技術(shù)實現(xiàn)要素:

本發(fā)明提供了一種用于從溶液中減少fxi、fxia或二者混合物含量的方法,該溶液含有所述蛋白以及作為主要組分的免疫球蛋白。該方法是通過在吸附材料上吸附所述蛋白實現(xiàn)的,所述吸附材料選自硅酸鹽(尤其是硅石、珍珠巖、沸石或硅藻土)、氫氧化鋁(al2(oh)3)、羥基氧化鋁(alo(oh))、氧化鋁(al2o3)或適合用于親和層析的材料。所述適合用于親和層析的材料由連接于基質(zhì)材料(例如沸石或諸如丙烯酸鹽和糖類的聚合物)的多糖(例如右旋糖苷、肝素或類肝素)、尤其是用于肝素親和層析的凝膠(例如heparinsepharose(tm)ff或toyopearlafheparin650m(tm))組成。

含有該來源(source)的溶液可以是含有來源于血液或血漿的fxi和/或fxia的任何液體或來源于生物技術(shù)方法的液體。這樣的溶液的已知但非限制性的實例為cyro-poor血漿、cohn方法的中間體(例如再生糊狀物i+ii+iii)及其衍生物、kistler-nitschmann方法的中間體(例如再生沉淀物a)及其衍生物或由重組蛋白表達得到的溶液,以及主要由其他蛋白組成的溶液,其中在免疫球蛋白-γ(igg)溶液的情況下,fxi或fxia代表雜質(zhì)。

用于從含有所述凝血因子(fxi和fxia)和作為主要組分的免疫球蛋白的溶液中減少和/或除去fxi和fxia的方法包括以下步驟:

a)使含有fxi和/或fxia的溶液與親和層析凝膠接觸,其中肝素或類肝素連接于基質(zhì)材料;

b)進行fxi和/或fxia的吸附;以及

c)將喪失(deprivedof)fxi和/或fxia的液體與吸附介質(zhì)分離。

也可以改變步驟a)以使得在用fxi和/或fxia裝載(load)基質(zhì)或凝膠的過程中基質(zhì)或凝膠的活化位置已經(jīng)用抗凝血酶飽和或允許用抗凝血酶飽和。

可以分批吸附的形式實施吸附,其中將源溶液(sourcesolution)與吸附劑混合、攪拌并通過已知方法(例如沉降、過濾或離心)將負載于吸附劑上的fxi和/或fxia從上清液中除去??商娲姆椒ㄊ菍⑽讲牧涎b于色譜柱中并施加源溶液以用fxi和/或fxia裝載吸附劑。

在本發(fā)明的一種實施方式中,可另外地使用選自硅石、珍珠巖、沸石或硅藻土的硅酸鹽作為fxi和/或fxia的吸附劑。

在另一種實施方式中,可以使用另外的吸附介質(zhì),該吸附介質(zhì)選自由氫氧化鋁、羥基氧化鋁或氧化鋁組成的組。

也可以將例如用硅藻土或氫氧化鋁作為吸附材料以分批方式進行的吸附與利用heparinsepharose(tm)作為吸附劑在色譜柱中進行的吸附組合起來。

在本發(fā)明的又一種實施方式中,在用抗凝血酶-iii對層析材料進行預(yù)處理后在連接于基質(zhì)材料的肝素或類肝素上實施一次吸附。

用洗滌緩沖液小心地洗滌所裝載的吸附劑以避免fxi和/或fxia的解吸并將所得的洗滌溶液加入到待進行進一步處理的穿流(flow-through)和/或上清液中并最優(yōu)化該fxi/fxia貧化溶液(fxi/fxia-depletedsolution,或稱喪失fxi/fxia的溶液)中其他感興趣組分(例如免疫球蛋白,尤其是igg)的回收。在heparinsepharose(tm)上進行處理的fxi/fxia貧化溶液通常含有少于0.15iufxi/ml,尤其是少于0.1iufxi/ml,甚至更具體地0.00至0.05iufxi/ml。這樣的貧化溶液(depletedsolution)中以國際單位(iu)表示的fxia含量通常小于10mufxia/ml,尤其是小于5mufxia/ml,甚至更具體地0.0至1.0mufxia/ml。

fxi/fxia貧化溶液的進一步處理可結(jié)合一個或多個病毒滅活步驟,給出的實例為溶劑/清潔劑處理(s/d處理)、uv-輻照、巴氏滅菌、低ph孵育、辛酸鹽沉淀或納米過濾。其他步驟包括層析步驟、濃縮以獲得藥物活性化合物的濃縮物、配制并裝填,這些是制造各種蛋白已知的,例如免疫球蛋白(尤其是igg)、白蛋白、纖維蛋白原、抗凝血酶或α-1-抗胰島素,并且是為了獲得藥物組合物而強制進行的并取決于待生產(chǎn)的產(chǎn)品。

可將fxi和/或fxia從所負載的吸附劑洗脫,尤其是該吸附劑為具有附著于基質(zhì)的肝素或類肝素的親和層析凝膠的情況下。利用洗脫緩沖液從親和層析凝膠洗脫fxi和/或fxia,該洗脫緩沖液由0.2-1.4mnacl,尤其是0.25-1.0mnacl,甚至更尤其是0.25-0.5mnacl以及0.003-0.03m磷酸鹽或相等離子強度組成。因此,所提供的含fxi和/或fxia溶液也可以通過上文提到的方法進行病毒滅活并通過超濾/滲濾濃縮以獲得含有fxi、fxia或二者的濃縮物??蓪⑺鰸饪s物進一步與輔料一起配制以獲得能夠治療與fxi或fxia缺乏或失活相關(guān)疾病的藥物組合物。

出人意料的是,我們發(fā)現(xiàn)肝素色譜凝膠的流出液的fxi和fxia水平低于所述蛋白的檢測限盡管抗凝血酶允許突破(breakthrough)。預(yù)期fxi和fxia已被抗凝血酶替代,尤其是抗凝血酶-β同工型,因為已知其強力結(jié)合于肝素和類肝素親和凝膠。甚至更加令人驚訝的是,能夠利用低于中等離子強度的洗脫緩沖液(主要含有0.2-1.4mnacl)或等同離子強度的洗脫緩沖液從抗凝血酶飽和的肝素親和凝膠中選擇性洗脫fxi和fxia,同時需要利用較高離子強度的緩沖液(主要含有大于1.5m的nacl,尤其是約2.0m的nacl)洗脫抗凝血酶-iii(at-iii)。當(dāng)用足夠高離子強度的緩沖液進行洗脫時,這種性質(zhì)允許fxi/fxia的分離洗脫接著at-iii的洗脫或含有fxi、fxia和at-iii的混合物的共洗脫。

甚至更加出人意料的是,發(fā)現(xiàn)不必如現(xiàn)有技術(shù)文獻中教導(dǎo)的那樣向緩沖液中添加和芐瞇以避免接觸活化并克服蛋白水解消化。

通過利用抗凝血酶-iii(at-iii)預(yù)處理具有連接于基質(zhì)材料的右旋糖苷、肝素或類肝素的親和色譜凝膠實現(xiàn)了本發(fā)明的一個目的的最佳效果。預(yù)處理可進行到這樣的程度,即,用at-iii使色譜材料的活化位置飽和。這種方法是尤其有益的,因為改善了親和凝膠對fxi和fxia的結(jié)合能力以及抑制其他凝血因子的結(jié)合或至少在較大程度上阻礙其他凝血因子的結(jié)合。因此,可以從附隨的蛋白質(zhì)中選擇性除去fxi和fxia并在從親和凝膠洗脫之后獲得沒有其他凝血因子的fxi和fxia溶液。

本發(fā)明的主題還包括可通過本發(fā)明的方法獲得的藥物活性組分的濃縮物及所獲得的藥物組合物。

在根據(jù)本發(fā)明的藥物活性組分的濃縮物或本發(fā)明的藥物組合物中,該藥物活性組分為igg。

具體實施方式

本發(fā)明提供了一種用于從溶液中減少fxi,fxia或二者混合物的方法,該溶液含有所述蛋白質(zhì)(即fxi,fxia或二者混合物)和作為主要組分的免疫球蛋白含量。這是通過在吸附材料上吸附所述蛋白實現(xiàn)的,所述吸附材料選自硅酸鹽(尤其是硅藻土)或適合用于親和層析的材料,尤其是用于肝素-或類肝素親和層析的凝膠,例如heparinsepharose(tm)ff或toyopearlafheparin650m(tm)。

含有該來源(source)的溶液可以是含有來源于血液或血漿的fxi和/或fxia的任何液體或來源于生物技術(shù)過程的液體。這樣的溶液的已知但非限制性實例為cyro-poor血漿、cohn方法的中間體(例如再生糊狀物i+ii+iii)及其衍生物、kistler-nitschmann方法的中間體(例如再生沉淀物a)及其衍生物或由重組蛋白表達得到的溶液,以及主要由其他蛋白組成的溶液,其中在免疫球蛋白-γ(igg)溶液的情況下,fxi或fxia代表雜質(zhì)。

用于從含有凝血因子和作為主要組分的免疫球蛋白的溶液中減少和/或除去fxi和fxia的方法包括以下步驟:

a)使含有fxi和/或fxia的溶液與親和層析凝膠接觸,其中肝素或類肝素連接于基質(zhì)材料;

b)進行fxi和/或fxia的吸附;以及

c)將喪失fxi和/或fxia的液體與吸附介質(zhì)分離。

也可以改變步驟a)以使得在用fxi和/或fxia裝載基質(zhì)或凝膠的過程中基質(zhì)或凝膠的活化位置已經(jīng)用抗凝血酶飽和或允許用抗凝血酶飽和。

一種可替代的方法是將吸附材料裝到色譜柱中并施加源溶液以用fxi和/或fxia裝載吸附劑。

在本發(fā)明的一種實施方式中,可另外地使用硅藻土作為fxi和/或fxia的吸附劑。

通過將電導(dǎo)率為10-18ms,尤其是電導(dǎo)率為14-17ms的緩沖液中的蛋白裝載到層析樹脂(heparin-sepharosetmff)上來實施步驟a)和步驟b)。用具有相同電導(dǎo)率的洗滌緩沖液小心地洗滌所裝載的吸附劑以避免fxi和/或fxia的解吸并將得到的洗滌溶液加入到待進一步處理的穿流和/或上清液中并最優(yōu)化存在于作為fxi/fxia貧化溶液的穿流中的igg的回收。在heparinsepharose(tm)上處理的fxi/fxia貧化溶液通常含有少于0.1iufxi/ml,甚至更具體地0.00至0.05iufxi/ml。這樣的貧化溶液(depletedsolution)中以國際單位(iu)表示的fxia含量通常小于5mufxia/ml,甚至更具體地0.0至1.0mufxia/ml。

fxi/fxia貧化溶液的進一步處理可結(jié)合一個或多個病毒滅活步驟,給出的實例為溶劑/清潔劑處理(s/d處理)(如ep-a-131740中披露的,其結(jié)合于本文作為參考)、uv-輻照、巴氏滅菌、低ph孵育、辛酸鹽沉淀或納米過濾。其他步驟包括層析步驟、濃縮以獲得藥物活性化合物的濃縮物、配制并裝填,這些是制造各種蛋白已知的,例如免疫球蛋白(尤其是igg)、白蛋白、纖維蛋白原、抗凝血酶或α-1-抗胰島素,并且是為了獲得藥物組合物而強制進行的并取決于待生產(chǎn)的產(chǎn)品。

可利用由0.36mnacl和0.01m磷酸鹽或相等離子強度組成的洗脫緩沖液將fxi和/或fxia從所負載的吸附劑上洗脫。因此,所提供的含fxi和/或fxia溶液也可以通過上文提到的方法進行病毒滅活并通過超濾/滲濾進行濃縮以獲得含有fxi、fxia或二者的濃縮物??蓪⑺鰸饪s物進一步與輔料一起配制以獲得能夠治療與fxi或fxia缺乏或失活相關(guān)疾病的藥物組合物。

實施例

因子xia活性試驗

通過樣品中存在的fxia將重組凝血因子ix(無fixa)活化為fixa。在存在磷脂和鈣離子的情況下,fixa與凝血酶-活化的fviii:c(在試驗溶液中是過量的)形成酶復(fù)合物。隨后,該酶復(fù)合物將也存在于試驗溶液中的fx活化為因子xa(fxa)。可通過商購的底物測量所產(chǎn)生的fxa的量并且其與樣品中的fxia濃度成正比。通過與校準(zhǔn)曲線進行比較進行量化。

必須提及本試驗還指明當(dāng)測量來自血漿分餾過程的早期階段的樣品(例如cyro-poor血漿)時fixa和fxa的活性。因此容易理解對于這樣的樣品指示了fxia、fixa和fxa總活性(summarizedactivities),條件是該樣品中存在fixa和fxa。

實施例1:

在裝于柱中的heparinsepharoseff上處理起始材料以使得fxi和fxia吸附在色譜材料上。使含有igg的穿流與hyflo(即硅藻土)接觸,離心以除去負載的hyflo并隨后對含igg的上清液處理為中間體糊狀物i+ii+iii。如此產(chǎn)生的中間體的復(fù)原(reconstitution)顯示出0.02iufxi/ml和小于1mufxia/ml。

實施例2:

除了省略在硅藻土上捕獲fxi/fxia之外,以與實施例1相同的方式產(chǎn)生糊狀物i+ii+iii。fxi和fxia的確定顯示出含量為0.05iufxi/ml和3.5mufxia/ml。

表1-表3示出了層析前和層析后樣品的分析結(jié)果,其中對于肝素凝膠以與運行1(run1)相比減少的起始材料負載來實施運行2-5(runs2-5)。

表1:起始材料的分析

表2:根據(jù)實施例1(運行1、運行4和運行5)和實施例2(運行2和運行3)的幾次實驗的樣品分析

表3:根據(jù)實施例1的幾次實驗的樣品分析

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