本發(fā)明屬于植物生物技術(shù)領(lǐng)域，它涉及一種植物種子大小必需基因及其應用，具體涉及一種控制水稻種子大小基因OsNAC1及其應用。

背景技術(shù)：

水稻是我國重要的糧食作物，面對人口劇增、環(huán)境惡化和耕地面積減少的嚴峻形勢，保證糧食安全成為我國面臨的一個日益突出的大問題和嚴峻挑戰(zhàn)，而提高水稻等主要糧食作物的單位面積產(chǎn)量是解決這一問題的重要途徑，對保證我國的糧食安全、促進國民經(jīng)濟的發(fā)展有舉足輕重的作用。有效穗數(shù)、每穗粒數(shù)和千粒重是構(gòu)成水稻產(chǎn)量的三個基本要素。種子大小是由粒長、粒寬、粒厚和谷粒充實度共同決定的，是千粒重最主要的決定因素。種子大小也是構(gòu)成水稻理想株型的主要農(nóng)藝性狀之一，長期以來一直是很多作物育種改良的重要目標，對產(chǎn)量和外觀品質(zhì)有很大的影響?！半s種優(yōu)勢”和“綠色革命”的利用，使我國水稻產(chǎn)量實現(xiàn)了兩次飛躍。雜交水稻主要是基于野敗型不育系的發(fā)現(xiàn)和三系配套法的發(fā)明，使產(chǎn)量大幅提升?！熬G色革命”則是基于半矮稈基因sd1的發(fā)現(xiàn)和利用，使株高大幅度降低，提高了耐肥和抗倒伏能力，從而顯著提高產(chǎn)量 (Sasaki et al., 2002)。近10多年來，“超級稻”育種備受人們期待，其采用的最主要的技術(shù)就是理想株型和優(yōu)勢利用相結(jié)合。由此可見，水稻理想株型研究上的突破是水稻育種能夠更快更好地開展下去的前提和基礎(chǔ)，因此，對于作為理想株型建成的重要因子之一種子大小相關(guān)功能基因的挖掘及其作用機理的研究，進而應用于水稻、小麥等禾谷類作物高產(chǎn)品種的培育，具有重要的理論意義和生產(chǎn)應用前景。

糧食高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)是植物基礎(chǔ)科學和應用科學研究的重要目標，也是糧食作物遺傳改良的重中之重。水稻是重要的糧食作物和模式生物，在水稻、小麥等禾谷類作物中，種子大小既是水稻外觀品質(zhì)性狀，又是一個非常重要的產(chǎn)量性狀和作物馴化的靶性狀。近幾年對擬南芥和水稻種子大小相關(guān)基因的克隆及功能研究表明，泛素蛋白酶體可能是一種調(diào)控種子大小的機制。GW2基因編碼一個具有E3泛素連接酶活性的RING蛋白，GW2功能缺失突變增加了水稻細胞的數(shù)目，導致穎殼變大，灌漿速率加快，從而使粒寬和粒重增加，產(chǎn)量提高，結(jié)果表明GW2通過將其底物錨定到蛋白酶體進行降解，從而負調(diào)節(jié)細胞的分裂（Song et al., 2007）。此外，敲除小麥TaGW2基因使小麥種子變小，粒重降低（Su et al., 2011）。水稻GW5基因編碼一個144 氨基酸組成的核定位蛋白，該蛋白包含一個核定位信號和一個富含精氨酸區(qū)域。通過酵母雙雜交實驗證實GW5 與多聚泛素有相互作用，表明GW5可能通過泛素蛋白酶體途徑調(diào)節(jié)粒寬和粒重。gw5突變后不能將泛素轉(zhuǎn)移到靶蛋白上，因而使得本應降解的底物不能被特異識別，進而激活穎花外殼細胞的分裂，從而增加穎花外殼的寬度，最終谷殼的寬度、粒重以及產(chǎn)量都得到了增加（Song et al., 2011）。SOD2基因編碼一個去泛素化酶UBP15 (ubiquitin-specific protease 15)，超表達SOD2基因?qū)е聰M南芥種子變大，而sod2單突變體降低了擬南芥種子大小，表明SOD2/UBP15是種子大小調(diào)控的關(guān)鍵因子，細胞學分析表明SOD2是通過促進珠被的細胞分裂，從而影響種子大小。免疫共沉淀等實驗揭示出泛素受體DA1能夠與SOD2在體內(nèi)和體外直接互作，表明SOD2是DA1的直接底物。以上結(jié)果表明：泛素受體DA1通過直接與去泛素化酶SOD2互作，并介導SOD2的降解，從而調(diào)控植物種子大?。―u et al., 2014）。最新研究發(fā)現(xiàn)，E3泛素連接酶DA2和EOD1通過泛素化DA1，激活了DA1的蛋白酶活性，然而活化的DA1可以進一步切割UBP15，TCP15，TCP22等下游底物，進而調(diào)控種子大小，表明DA1的蛋白酶活性通過協(xié)同調(diào)控下游底物的穩(wěn)定性來調(diào)控種子大?。―ong et al., 2017）。

近年來，在植物中發(fā)現(xiàn)了一些IKU途徑基因參與種子大小調(diào)控（圖 1）。IKU1基因編碼一個包含VQ基序的蛋白，在早期胚乳中表達，IKU1功能缺失突變降低了擬南芥種子大小（Wang et al., 2010）。IKU2編碼一個富含亮氨酸的受體激酶，IKU2功能缺失突變也降低了種子大?。↙i et al., 2016）。SHB1在種子發(fā)育中其關(guān)鍵的調(diào)控作用，在芥末中超表達擬南芥SHB1基因增加了芥末種子大小和產(chǎn)量（Savadi et al., 2015）。近期研究發(fā)現(xiàn)，SHB1能夠結(jié)合在MIN3和IKU2基因啟動子區(qū)域，通過改變MIN3和IKU2基因的表達來調(diào)控胚乳的發(fā)育，然而ABI5直接與SHB1啟動子結(jié)合進而抑制SHB1的表達，在擬南芥中超表達油菜IKU2基因增加了種子大?。↙i et al., 2016; Xiao et al., 2016）。abi5突變體增加了種子大小，結(jié)果表明ABA調(diào)控種子發(fā)育至少部分是由ABI5介導的SHB1基因表達的抑制所引起的（Cheng et al., 2014）。

水稻種子大小是一個復雜的基因表達調(diào)控過程，種子大小是由多基因控制的數(shù)量性狀。水稻其形態(tài)學和遺傳學上的研究優(yōu)勢為高等植物種子大小的分子機理研究提供了非常重要的研究模式。因此，挖掘新的控制水稻種子大小基因、對禾谷類作物分子育種及高產(chǎn)品種的培育具有重要的應用價值和理論意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種控制水稻種子大小基因OsNAC1及其應用，該基因是水稻種子大小的關(guān)鍵調(diào)控基因，它可以用于水稻、小麥等禾谷類作物高產(chǎn)品種的培育。

本發(fā)明的目的是以下述方式實現(xiàn)的：

本發(fā)明提供一種控制水稻種子大小基因OsNAC1，來源于水稻(Oryza sativa L.) cv. 中花 11，其核苷酸序列為SEQ ID NO.1，其基因開放閱讀框的核苷酸序列為SEQ ID NO.2，其cDNA編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO.3。

一種重組構(gòu)建體，包括控制水稻種子大小基因OsNAC1的核苷酸序列，所述構(gòu)建體用的載體為用于克隆的pMD18-T載體或者用于表達的pCAMBIA1301載體。

控制水稻種子大小基因OsNAC1的核苷酸序列的轉(zhuǎn)基因農(nóng)桿菌為EHA105。

控制水稻種子大小基因OsNAC1的核苷酸序列在植物組織表達中的應用。

所述植物組織為根、莖、葉、花、穗或種子。

所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。

所述單子葉植物為水稻、小麥、大麥、高粱或玉米，所述雙子葉植物為擬南芥、番茄、煙草、大豆或土豆。

上述控制水稻種子大小基因OsNAC1或上述控制水稻種子大小基因OsNAC1編碼的蛋白質(zhì)，或其他物種中的功能類似蛋白，其氨基酸序列與SEQ ID No.3所示的氨基酸序列具有不小于30%的同源性，該蛋白在培育高產(chǎn)品種植物中的應用。所述高產(chǎn)為增加禾谷類作物種子大小，進而增加單產(chǎn)。

相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的優(yōu)點在于：

首先對OsNAC1基因進行了組織特異性表達分析，qRT-PCR 結(jié)果表明OsNAC1 基因在水稻幼葉高效表達；然后將OsNAC1基因構(gòu)建到以35S啟動子啟動的植物表達載體pCAMBIA1301中，獲得重組載體pCAMBIA1301-OsNAC1，將重組載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌用于進一步的轉(zhuǎn)化。以水稻愈傷為受體，利用農(nóng)桿菌介導法將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)入到水稻，通過潮霉素和GUS染色獲得轉(zhuǎn)基因株系。在水稻中超表達OsNAC1后發(fā)現(xiàn)，與野生型水稻相比，OsNAC1超表達轉(zhuǎn)基因水稻種子變小，種子寬度和種子長度都降低，千粒重降低，株高降低，結(jié)實率不變。這些結(jié)果說明OsNAC1是控制水稻種子大小的基因。此外，我們已經(jīng)種植了4代轉(zhuǎn)基因株系，并且從T1代開始種子大小和千粒重都顯著性的降低，說明我們獲得的OsNAC1轉(zhuǎn)基因植株是可以穩(wěn)定遺傳的。OsNAC1基因是水稻種子大小的關(guān)鍵調(diào)控基因，表明可以利用基因工程技術(shù)調(diào)節(jié)水稻的種子大小，在利用生物工程技術(shù)有目的調(diào)控植物株型性狀，調(diào)整植物群體結(jié)構(gòu)以達到高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)方面具有非常重要的應用價值。該基因可以通過CRISPR/Cas9技術(shù)用于水稻、小麥等禾谷類作物高產(chǎn)品種的培育。

附圖說明

圖1表示OsNAC1在野生型水稻不同組織中的表達量。

圖2是OsNAC1基因在野生型和轉(zhuǎn)基因株系中的表達量檢測。

圖3是OsNAC1基因超表達植株和對照植株的種子大小表型。

圖4是OsNAC1基因超表達植株和對照植株千粒重。

圖5是OsNAC1基因超表達植株和對照植株的表型。

圖6是OsNAC1基因超表達植株和對照植株株高。

圖7是OsNAC1基因超表達植株和對照植株各節(jié)間長度統(tǒng)計學分析。

圖8是OsNAC1基因超表達植株和對照植株20粒種子長度表型。

圖9是OsNAC1基因超表達植株和對照植株種子長度統(tǒng)計學分析。

圖10是OsNAC1基因超表達植株和對照植株20粒種子寬度表型。

圖11是OsNAC1基因超表達植株和對照植株種子寬度統(tǒng)計學分析。

圖12是OsNAC1基因超表達植株和對照植株結(jié)實率統(tǒng)計學分析。

具體實施方式

以下本發(fā)明擬進一步對OsNAC1基因的上下游基因及其參與的相關(guān)調(diào)控信號通路進行分析，并分析OsNAC1基因是否具有更廣泛的控制種子大小的作用。通過分析該基因在水稻種子大小調(diào)控機理研究及高產(chǎn)品種培育中的作用，以為豐富水稻等禾谷類作物種子大小的分子機理積累資料，通過基因工程手段為水稻、小麥等禾谷類作物的高產(chǎn)分子模塊設(shè)計育種提供新的基因資源。

水稻轉(zhuǎn)基因株系獲得及表型分析實驗

1材料與方法

1.1 植物材料及種植方式

供試的水稻品種為水稻粳稻品種中花 11即水稻(Oryza sativa L.) cv. 中花 11，保存在周口師范學院植物遺傳與分子育種重點實驗室。新收的種子種植前先用質(zhì)量百分比濃度為5% 次氯酸鈉消毒40 min或者用1/1000的多菌靈消毒12 h，再用0.1 mol/L HNO₃（0.1 mol/L HNO₃的配制方法：1 mL 63%的濃HNO₃加入100 mL水）浸種16 h，自來水沖洗干凈后將消毒后的種子置于28°C環(huán)境下浸種1 d，然后將種子均勻的平鋪在培養(yǎng)皿中，其中培養(yǎng)皿中放置一層濾紙，并用水濕潤；蓋上蓋子，然后放入32°C下培養(yǎng)，每天換水兩到三次，看到大多數(shù)種子破殼出根后轉(zhuǎn)入30°C下培養(yǎng)。保存半年以上的種子播種前先曬種2d，消毒后浸種，消毒方法：55°C溫湯浸種30min，待水稻芽長到4.8-5.2 mm長的時候播種到紗窗布上，并在水稻營養(yǎng)液中培養(yǎng)，3葉期后，將水稻幼苗移入土壤中并做好對應的標簽進行表型觀察和后續(xù)的試驗分析。水稻每間隔8或者10d進行一次施肥。

1.2 所用試劑及載體

本實驗所采用的大腸桿菌為DH5α，農(nóng)桿菌為EHA105，這些菌株為周口師范學院植物遺傳與分子育種重點實驗室保存，植物表達載體為pCAMBIA1301；其中，限制性內(nèi)切酶、克隆載體pMD18-T、T4 DNA連接酶、Taq DNA聚合酶購自于TaKaBa生物公司；DNA回收試劑盒為Magen生物公司產(chǎn)品；潮霉素（Hyg）、卡那霉素（Kan）和氨卡霉素（Amp）等購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司，試驗所有引物均由北京奧克鼎盛生物公司合成。

1.3 RNA的提取、cDNA合成和RT-PCR擴增目的基因

RNA提取使用Magen公司的植物RNA提取試劑盒，參考方法為較易提取植物組織RNA小量提取法。以1 μg的RNA 做模板，按照 cDNA 合成試劑盒（TaKaRa）操作說明合成第一鏈 cDNA。根據(jù)OsNAC1基因cDNA全長序列設(shè)計特異引物，特異引物序列見表1。RT-PCR 反應體系（20 μL）：10×PCR 反應緩沖液 2 μL，dNTP（2.5 mmol/L）1 μL，引物（10 pm/μL）各1 μL，Taq聚合酶（5 U/μL）0.2 μL，模板 cDNA 2 μL，ddH₂O 12.8 μL。PCR 反應條件：94℃預變性 5 min；94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸 1 min，33個循環(huán)；72℃延伸 10 min，4℃保存。

1.4 OsNAC1基因組織特異性表達分析

OsNAC1基因表達量檢測選用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）。qRT-PCR結(jié)果表明：OsNAC1在幼葉中表達最高，如圖 1所示。用于qRT-PCR分析的引物根據(jù)基因全長序列設(shè)計，選用水稻的Ubiquitin1(Ubi1;Os06g0681400)作為定量PCR內(nèi)參引物，如表2所示。

1.5 OsNAC1基因植物表達載體的構(gòu)建

目的基因的PCR產(chǎn)物，按照Megan公司PCR產(chǎn)物純化試劑盒操作進行純化。限制性內(nèi)切酶KpnI和XbaI雙酶切連接有目的基因片段的pMD18-T質(zhì)?；騪CAMBIA1301質(zhì)粒后，用T₄ DNA連接酶將目的基因連接到植物表達載體pCAMBIA1301上，反應體系如下：T₄ DNA連接酶（5 U/μL）1 μL，10×buffer 1 μL，目的基因片段5 μL，pCAMBIA1301載體3μL；反應條件：16℃，2 h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli DH5α，涂布LB平板（50 mg/L Kan）培養(yǎng)，37℃過夜倒置培養(yǎng)形成單菌落。

1.6 OsNAC1基因植物表達載體的鑒定

挑取OsNAC1基因植物表達載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coli DH5α 后形成的單克隆，提取質(zhì)粒進行PCR鑒定。陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)農(nóng)桿菌EAH105，涂布LB平板（50mg/L Kan、50mg/L Rif）培養(yǎng)，28℃倒置培養(yǎng)2d，挑選陽性克隆提取質(zhì)粒并進行酶切驗證。

1.7 農(nóng)桿菌侵染和轉(zhuǎn)基因苗的獲得

以水稻愈傷組織為實驗材料。OsNAC1基因植物表達載體（質(zhì)粒）通過凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105。分別挑取含有OsNAC1基因植物超表達載體農(nóng)桿菌單克隆于28℃培養(yǎng)過夜，取10 mL培養(yǎng)液，3000 rpm，20 min，離心收集菌體沉淀，分別重懸于AAI培養(yǎng)液內(nèi)，AA培養(yǎng)液包括30 g/L蔗糖，70g/L葡萄糖，200 μmol/L 乙酰丁香酮，PH 5.2，OD₆₀₀=1.0，然后將懸浮液在搖床上28℃振蕩培養(yǎng)3-5 h。將長到一定大小的水稻愈傷組織挑出，放入農(nóng)桿菌懸浮液浸染30 min；然后將愈傷組織取出，置于滅菌濾紙上瀝干50 min；將愈傷組織置于共培養(yǎng)基（共培養(yǎng)基為：2N6，10g/L葡萄糖，200 μmol/L 乙酰丁香酮，PH 5.5）上，28℃暗培養(yǎng)3 d。三天后用500 mg/L頭孢美素的滅菌水清洗6遍，包含16μL吐溫的100mL滅菌水清洗5遍，然后用無菌水清洗一遍。將瀝干的水稻愈傷轉(zhuǎn)移到篩選培養(yǎng)基（篩選培養(yǎng)基為：2N6，500 mg/L頭孢美素，50 mg/L潮霉素），28℃暗培養(yǎng)30 d。將新長出的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基（分化培養(yǎng)基為：MS+30 g/L蔗糖+30 g/L山梨醇+2 mg/L6-BA（花之舞用KT）+0.8%瓊脂+1.0 mg/L NAA+250 mg/L頭孢霉素+50 mg/L潮霉素+2 g/L水解酪蛋白，PH 5.8）。挑取出現(xiàn)綠芽的水稻愈傷移入裝有生根培養(yǎng)基（生根培養(yǎng)基為：MS/2+30g/L蔗糖+250 mg/L頭孢霉素+50 mg/L潮霉素）的三角瓶中，放入恒溫培養(yǎng)箱28℃光培養(yǎng)15d。準備移栽。首先通過潮霉素抗性基因和GUS活性分析對陽性轉(zhuǎn)基因植株進行初步篩選，然后通過qRT-PCR技術(shù)檢測目的基因在野生型和轉(zhuǎn)基因植株中的表達情況，進一步對初次篩選的陽性植株進行再次篩選。

1.8 OsNAC1基因在野生型和轉(zhuǎn)基因水稻中的表達情況檢測

取14 d的野生型和轉(zhuǎn)基因水稻葉片進行RNA提取，以1 μg的RNA 做模板，按照 cDNA 合成試劑盒（TaKaRa）操作說明合成第一鏈 cDNA。以OsNAC1基因cDNA設(shè)計特異定量PCR引物，見表2，通過qRT-PCR檢測OsNAC1在野生型和轉(zhuǎn)基因株系中的表達情況。

1.9 OsNAC1基因在野生型和轉(zhuǎn)基因水稻中的表型分析

通過qRT-PCR檢測了OsNAC1基因在野生型和轉(zhuǎn)基因株系OvOsNAC1（OE1, OE2和OE3）中表達情況，如圖2所示；超表達OsNAC1基因顯著性的降低了水稻的種子大小，如圖3所示，超表達OsNAC1植株千粒重顯著性的降低，如圖4所示，株高降低如圖5，6和7所示；與野生型相比，超表達OsNAC1植株種子長度顯著性降低，如圖8和9所示，超表達OsNAC1植株種子寬度顯著性降低，如圖10和11所示，結(jié)實率不變，如圖12所示。該結(jié)果為進一步使OsNAC1基因應用于水稻、小麥高產(chǎn)品種改良奠定了良好的基礎(chǔ)和新的基因資源。

2.0 OsNAC1序列對應基因的全長

OsNAC1序列對應基因的全長序列為2292bp，其中包含完整讀碼框序列長度為1 089bp，序列如下SEQ ID NO.1；

采用NCBI ORF-finder預測其編碼蛋白質(zhì)為362個氨基酸，序列如SEQ ID NO.3所示。

根據(jù)序列分析，OsNAC1為一個功能未知的新的和水稻種子大小相關(guān)的基因，尚沒有與其同源的禾本科作物中任何功能已知的基因被發(fā)現(xiàn)。

以上實施例僅用以說明，而非限制本發(fā)明的技術(shù)方案，盡管參照上述實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應當理解：依然可以對本發(fā)明進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明的精神和范圍的任何修改或局部替換，其均應涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當中。

SEQUENCE LISTING

<110> 周口師范學院

<120> 控制水稻種子大小基因OsNAC1及其應用

<130> 2

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2292

<212> DNA

<213> 控制水稻種子大小基因OsNAC1的核苷酸序列

<400> 1

gaaaggccaa tatctcaaga gagctagcta gagctccatt tacaaccatt acaagattgc 60

atcagagaag atatcttcat agataattgt tggagcaaga acacaagaaa acacgtaggt 120

tcaattataa tcgatcgtgg agatggtgac cagcaaggag tttgcaaggg atcaggcggc 180

catggatcag aagatcaaga gcgacgtcgg cgaggtggtg ctcgccggag acgaggaaga 240

agacggggac gtggtgctcc cggggttcag gttccacccg accgacgagg agctcgtcac 300

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<213> 控制水稻種子大小基因OsNAC1的核苷酸序列的基因開放閱讀框

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tgggatctcc ccaatgcgag cacggtaggt ggagagaagg agtggtactt cttctgcctg 300

agagggagga agtacaggaa cagcatcagg cccaacaggg tgacgggatc cgggttctgg 360

aaggcgacgg ggatcgaccg gccgatctac tccgccgccg tcaacagcaa ctccggcgag 420

tcgatcgggc tgaagaagtc gctcgtctac taccgcggca gcgccggcaa gggcaccaag 480

accgactgga tgatgcacga gttccgcctc ccgccggcga tcgccgccgc cgacgcctcc 540

ccgtgcatgc aagaagctga ggtctggacc atctgcagaa tcttcaagag aagcatcacc 600

tacaggaagc agcagcagca gcaggcctgg aggccgccgg cgacggtgac cgtcaaggcc 660

ccaccgccgg gggactcgag ctccaacacc ggcagcttcg agtcggacgg cggcggcgac 720

gagttcatga actgcggcct gactccggcc atctcccagc agcagcagca cggcggccgt 780

catcagatga tgagcacgat gagctgcaac ggcggctact tcttcaacga cggcatccat 840

cacagccaca gccaccacaa gcttcatagt caatggggct ccctacaaat ggcgccgccg 900

gagccgaagc cggagccgga gcagaagcct ctgagctcgc cggcgatgac gatcgccttc 960

catcaaaacg accatggctt ccccgccgcc gccgcggatt tctacaagga tgggtacttg 1020

gaagagattg cgaggatgat ggaggtggct gatccaagtc caacaggatt ctatgactgt 1080

agatattga 1089

<210> 3

<211> 362

<212> PRT

<213> 控制水稻種子大小基因OsNAC1的核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)

<400> 3

Met Val Thr Ser Lys Glu Phe Ala Arg Asp Gln Ala Ala Met Asp Gln

1 5 10 15

Lys Ile Lys Ser Asp Val Gly Glu Val Val Leu Ala Gly Asp Glu Glu

20 25 30

Glu Asp Gly Asp Val Val Leu Pro Gly Phe Arg Phe His Pro Thr Asp

35 40 45

Glu Glu Leu Val Thr Phe Tyr Leu Arg Arg Lys Val Ala Arg Lys Ser

50 55 60

Leu Ser Ile Glu Ile Ile Lys Glu Met Asp Ile Tyr Lys His Asp Pro

65 70 75 80

Trp Asp Leu Pro Asn Ala Ser Thr Val Gly Gly Glu Lys Glu Trp Tyr

85 90 95

Phe Phe Cys Leu Arg Gly Arg Lys Tyr Arg Asn Ser Ile Arg Pro Asn

100 105 110

Arg Val Thr Gly Ser Gly Phe Trp Lys Ala Thr Gly Ile Asp Arg Pro

115 120 125

Ile Tyr Ser Ala Ala Val Asn Ser Asn Ser Gly Glu Ser Ile Gly Leu

130 135 140

Lys Lys Ser Leu Val Tyr Tyr Arg Gly Ser Ala Gly Lys Gly Thr Lys

145 150 155 160

Thr Asp Trp Met Met His Glu Phe Arg Leu Pro Pro Ala Ile Ala Ala

165 170 175

Ala Asp Ala Ser Pro Cys Met Gln Glu Ala Glu Val Trp Thr Ile Cys

180 185 190

Arg Ile Phe Lys Arg Ser Ile Thr Tyr Arg Lys Gln Gln Gln Gln Gln

195 200 205

Ala Trp Arg Pro Pro Ala Thr Val Thr Val Lys Ala Pro Pro Pro Gly

210 215 220

Asp Ser Ser Ser Asn Thr Gly Ser Phe Glu Ser Asp Gly Gly Gly Asp

225 230 235 240

Glu Phe Met Asn Cys Gly Leu Thr Pro Ala Ile Ser Gln Gln Gln Gln

245 250 255

His Gly Gly Arg His Gln Met Met Ser Thr Met Ser Cys Asn Gly Gly

260 265 270

Tyr Phe Phe Asn Asp Gly Ile His His Ser His Ser His His Lys Leu

275 280 285

His Ser Gln Trp Gly Ser Leu Gln Met Ala Pro Pro Glu Pro Lys Pro

290 295 300

Glu Pro Glu Gln Lys Pro Leu Ser Ser Pro Ala Met Thr Ile Ala Phe

305 310 315 320

His Gln Asn Asp His Gly Phe Pro Ala Ala Ala Ala Asp Phe Tyr Lys

325 330 335

Asp Gly Tyr Leu Glu Glu Ile Ala Arg Met Met Glu Val Ala Asp Pro

340 345 350

Ser Pro Thr Gly Phe Tyr Asp Cys Arg Tyr

355 360