本發(fā)明屬于作物遺傳育種領(lǐng)域，涉及一個控制水稻籽粒高鎘積累的基因突變位點及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

鎘是一種對動植物均具有很強毒性的重金屬元素，隨著我國工業(yè)化、城鎮(zhèn)化的快速發(fā)展，農(nóng)田鎘污染問題日益突出。水稻是我國主要的糧食作物，水稻鎘污染日趨嚴重，已成為不容忽視的食品安全問題。近年來關(guān)于水稻吸收、運輸及解毒鎘的機理已經(jīng)開展了大量的研究工作，并取得了一些重要進展，為遺傳改良阻控水稻重金屬鎘積累提供了理論基礎(chǔ)和技術(shù)途徑。

國內(nèi)外研究表明，不同水稻品種籽粒鎘的積累能力差異很大，籽粒鎘濃度的差異高達10倍以上，而且這些性狀的遺傳性強。通常秈稻品種鎘積累能力較粳稻高，但是也有一些粳稻品種具有較強的鎘積累能力。不同水稻品種間，參與重金屬鎘吸收或運輸?shù)年P(guān)鍵基因的表達水平、以及所編碼的轉(zhuǎn)運蛋白對鎘跨膜運輸活性的不同，是導(dǎo)致品種間鎘積累能力的差異的主要原因。研究表明，鎘是通過鐵、鋅、錳等植物必需元素的吸收途徑進入植物體內(nèi)。水稻OsHMA3是一個P‐1B型重金屬ATP酶，主要在根系表達，定位于液泡膜上，具有運輸鎘的能力。水稻中OsHMA3轉(zhuǎn)運蛋白的主要功能是將鎘運輸進入液泡中儲存，從而限制鎘由根系向地上部的運輸。

國際上已經(jīng)有通過遺傳改良阻控作物重金屬積累的成功例子，如加拿大科學家已培育并注冊了5種低鎘的硬粒小麥新品種，美國培育了低鎘的向日葵品種。最近，日本科學家采用放射性誘變，篩選出低鎘水稻突變株，其根系鎘的吸收及籽粒鎘濃度比對照降低90％以上，種植在鎘污染的土壤上稻米鎘濃度也沒有超標，而且生長及產(chǎn)量均不受影響，分析表明突變的基因為編碼鎘和錳的運轉(zhuǎn)蛋白Nramp5，目前日本正在應(yīng)用這一突變株開展低鎘水稻品種的培育。這些例子充分說明通過遺傳改良培育重金屬低積累的品種是完全可行的。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一個控制水稻籽粒高鎘積累的基因突變位點。

本發(fā)明的另一目的是提供檢測該突變位點的引物對。

本發(fā)明的又一目的是提供該突變位點和引物對的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)：

一個控制水稻籽粒高鎘積累的基因突變位點，所述突變位點位于水稻OsHMA3基因起始密碼子ATG下游+1138位核苷酸，且存在A/C多態(tài)性，所述突變位點與水稻籽粒鎘含量顯著相關(guān)，該位點具有AA基因型的水稻籽粒鎘含量顯著低于具有CC基因型的水稻籽粒鎘含量。

本發(fā)明根據(jù)已公布的水稻日本晴(Nipponbare)序列設(shè)計OsHMA3基因的全長PCR引物，對籽粒鎘積累存在顯著差異的水稻品種(圖1；圖2)的cDNA進行PCR擴增和測序，同時與日本晴的序列進行了比對，發(fā)現(xiàn)了一些單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)。這些SNP會導(dǎo)致OsHMA3所編碼氨基酸的變異(圖3)。通過酵母異源表達這些不同水稻品種來源的OsHMA3蛋白發(fā)現(xiàn)，在OsHMA3蛋白80位和380位氨基酸的變異會導(dǎo)致OsHMA3蛋白功能喪失(圖3；圖4)。OsHMA3基因起始密碼子ATG下游+1138位的SNP導(dǎo)致了HMA3蛋白第380位氨基酸的變異。OsHMA3基因起始密碼子ATG下游+1138位核苷酸位點存在A/C多態(tài)性(SEQ ID NO.4)，所述OsHMA3基因起始密碼子ATG下游+1138位SNP位點與水稻籽粒鎘含量顯著相關(guān)。水稻OsHMA3基因起始密碼子ATG下游+1138位核苷酸位點具有AA基因型的水稻籽粒鎘含量顯著低于具有CC基因型的水稻籽粒鎘含量。利用這個SNP設(shè)計了一個dCAPS分子標記，對不同水稻品種的基因組DNA進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)一個限制性內(nèi)切酶Hpy188I酶切，在電泳中可檢測到兩種大小不同條帶，籽粒鎘含量高的品種的條帶大小為189bp(base pair)，籽粒鎘含量低的品種條帶大小為163bp(圖5)，這兩種條帶在聚丙烯酰胺凝膠電泳中具有很好的多態(tài)性(圖6)。該dCAPS標記能分析待測水稻品種中OsHMA3基因起始密碼子ATG下游+1138位核苷酸的多態(tài)性。

一種用于檢測水稻基因組中是否存在權(quán)利要求1所述的基因突變位點的引物對，正向引物F1：5'‐TGGAAGCTGGCTCTGGTGATGCTTCTG‐3'(SEQ ID NO.1)，反向引物R1：5'‐TCTGGTGATCGTCCCGGTCTT‐3'(SEQ ID NO.2)。

一種檢測水稻基因組中是否存在本發(fā)明所述的基因突變位點的方法，包括：以待測水稻基因組DNA為模板，用SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示引物進行PCR擴增，擴增得到OsHMA3基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)一個限制性內(nèi)切酶Hpy188I酶切，電泳結(jié)果如果出現(xiàn)189bp的條帶，表明待測水稻品種中OsHMA3基因起始密碼子ATG下游+1138位核苷酸存在所述的基因突變位點， 其基因型為CC，該水稻樣品為籽粒鎘含量高的品種；如果出現(xiàn)163bp的條帶，表明水稻品種中OsHMA3基因起始密碼子ATG下游+1138位核苷酸位點未產(chǎn)生突變，基因型為AA，該水稻樣品為籽粒鎘含量低的品種。

本發(fā)明所述的基因突變位點在水稻籽粒低鎘積累品種的輔助選擇育種中的應(yīng)用。

本發(fā)明所述的引物對在檢測本發(fā)明所述的基因突變位點中的應(yīng)用。

本發(fā)明所述的引物對在水稻籽粒低鎘積累品種的輔助選擇育種中的應(yīng)用。

有益效果：

本發(fā)明提供了控制水稻籽粒鎘積累基因OsHMA3序列一個新的突變位點及其檢測方法，可以用于水稻OsHMA3基因的輔助選擇育種。

附圖說明

圖1為不同品種水稻編號、名稱及亞種類型；

圖2為不同品種水稻籽粒鎘含量差異；

圖3為不同品種水稻OsHMA3氨基酸變異位點；

圖4為在酵母異源系統(tǒng)中驗證不同品種水稻OsHMA3蛋白活性；

圖5為本發(fā)明檢測所述突變位點的dCAPS分子標記的設(shè)計圖；

圖6為籽粒高鎘品種與低鎘品種水稻dCAPS分子標記的電泳分析圖；

圖7為通過本發(fā)明所述的dCAPS分子標記檢測的籽粒高鎘品種與低鎘品種水稻地上部鎘含量差異。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和本質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。

實施例1

本發(fā)明所述的檢測所述突變位點的方法，包括以下步驟：

1、引物設(shè)計：根據(jù)對不同水稻品種(圖1)OsHMA3基因的測序分析，即序列SEQ ID NO.5，在OsHMA3基因起始密碼子ATG下游+1138位SNP位點及其周圍約200bp處，設(shè)計一對dCAPS分子標記的PCR引物，序列為正向引物：5'‐TGGAAGCTGGCTCTGGTGATGCTTCTG‐3'(SEQ ID NO.1)，反向引物：5'‐TCTGGTGATCGTCCCGGTCTT‐3'(SEQ ID NO.2)。引物可委托金斯瑞公司合成。

2、DNA提取：以水稻葉片為材料提取基因組DNA，已報道的DNA提取方法很多，可任意選擇一種。本發(fā)明是采用的是陳文岳等(中國水稻科學，2005,19:561‐563)報道的一種水稻DNA簡易提取法。

3、PCR擴增：在0.2mL的PCR擴增專用薄壁管中，加入20ng水稻基因組DNA、正反向引物各0.25μM、4種dNTP(dCTP、dGTP、dATP、dTTP)各100μM、10μL 2×GC BufferI、1個酶活力單位的Taq DNA聚合酶，用雙蒸水定容到20μL，充分混勻。本發(fā)明使用的PCR試劑為TaKaRa公司產(chǎn)品。PCR擴增在熱循環(huán)儀上進行，擴增條件為：95℃變性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸30秒，30個循環(huán)；72℃延伸5分鐘。本發(fā)明采用的熱循環(huán)儀為BioRad公司的T100型。

4、PCR產(chǎn)物的酶切：取步驟3所得PCR產(chǎn)物的10μL，加入2μL CutSmart Buffer、1個酶活力單位的限制性內(nèi)切酶Hpy188I，用雙蒸水定容到20μL，充分混勻，37℃保溫1個小時。本發(fā)明使用的內(nèi)切酶及其Buffer是NEB公司產(chǎn)品。

5、酶切產(chǎn)物的電泳：用1×TBE電泳液制備濃度為8％的聚丙烯酰胺凝膠，將步驟4所得的20μL酶切產(chǎn)物與2μL 10×Loading Buffer混合，加到凝膠的點樣孔中，以DNAMarker 2000bp DNALadder(TaKaRa公司)作為分子量對照，在200V～300V電泳1h。用0.1％硝酸銀對凝膠進行染色，顯示DNA條帶，染色方法按照《分子克隆實驗指南》(科學出版社，第三版)。

6、電泳圖譜分析：在凝膠成像儀(BioRad公司)上觀察凝膠上的電泳條帶，通過比對DNAmarker判斷電泳條帶的大小，電泳條帶為189bp(SEQ ID NO.3)的水稻品種OsHMA3基因1138位核苷酸位點為CC型，對應(yīng)籽粒鎘含量相對較高，電泳條帶為163bp(SEQ ID NO.4)的水稻品種OsHMA3基因起始密碼子ATG下游+1138位核苷酸位點為AA型，對應(yīng)籽粒鎘含量相對較低。

為了證明本發(fā)明的正確性，發(fā)明人設(shè)置了實施例2的試驗。

實施例2

利用本發(fā)明所述dCAPS分子標記對進行過基因組重測序的533份水稻品種OsHMA3基因 起始密碼子ATG下游+1138位SNP進行檢測，最終結(jié)果如下：

檢測到4份水稻品種OsHMA3基因起始密碼子ATG下游+1138位A/C位點均為CC型，與測序結(jié)果吻合。所述4份水稻品種編號分別是NO.17、NO.23、NO.35和NO.221(圖1)。

對上述4份水稻品種鎘含量分析表明這4份水稻品種地上部鎘含量顯著高于其他對照品種(圖6)。由此可見，在水稻遺傳育種中，繼代選育OsHMA3基因起始密碼子ATG下游+1138位A/C位點的AA型均可降低水稻籽粒鎘積累，達到水稻籽粒低鎘積累品種育種的目的。