本發(fā)明涉及一株無成瘤性MDCK細(xì)胞克隆株。

背景技術(shù)：

MDCK細(xì)胞（Madin-Daby Canine Kidney Cells, MDCK）由Madin和Darby于1958年從美國Cocker Spaniel母曲架犬腎臟組織分離培育建立，由于其病毒感染效率高、增殖快，且不易變異，是公認(rèn)的適于流感病毒復(fù)制的3種細(xì)胞系之一。

流感(Influenza) ，是由甲(A) 、乙(B) 、丙(C) 三型流感病毒分別引起的急性呼吸道傳染病，常造成不同程度的流行，包括世界大流行、局部暴發(fā)流行及散發(fā)。禽流感（Bird Flu或Avian Influenza）是禽流行性感冒的簡稱，它是由甲型流感病毒的一種亞型（也稱禽流感病毒）引起的一種急性傳染病，也能感染人類，通常人感染禽流感死亡率約為33%。目前為止無論是流感還是禽流感未找到理想的治療藥物，疫苗接種仍是當(dāng)今防止疾病發(fā)生和流行最有效的手段。

我國流感疫苗和禽流感疫苗生產(chǎn)主要采用雞胚生產(chǎn)工藝，雞胚生產(chǎn)工藝存在生產(chǎn)周期長、操作繁瑣、工作量大、易污染等諸多缺陷，如遇禽流感大規(guī)模爆發(fā)，雞胚的供應(yīng)也將存在很大問題。若采用傳代細(xì)胞生產(chǎn)疫苗的工藝將不受雞胚等天然因素的限制，且生產(chǎn)周期短，工藝簡單，如遇流感暴發(fā)會快速反應(yīng)，短時間內(nèi)可提供大量疫苗產(chǎn)品。另外，貼壁型的傳代細(xì)胞可用生物反應(yīng)器微載體規(guī)?；囵B(yǎng)，生產(chǎn)中可將細(xì)胞生長和病毒繁殖自動控制在最適條件范圍內(nèi)，提高細(xì)胞密度和病毒滴度，實(shí)現(xiàn)大批次量、小批間差，產(chǎn)品具有更好的穩(wěn)定性和安全性，大量節(jié)省勞動力、生產(chǎn)場地和能源消耗，降低生產(chǎn)成本，與雞胚直接增殖病毒的工藝和轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)傳代細(xì)胞增殖病毒的工藝相比具有明顯優(yōu)勢。

目前國際上已有幾家企業(yè)已批準(zhǔn)利用MDCK細(xì)胞生產(chǎn)流感疫苗。荷蘭蘇威制藥公司（Solvay Pharmaceuticals）生產(chǎn)的流感病毒裂解疫苗Influvac?TC于2001年在荷蘭獲得批準(zhǔn)。諾華公司（Novartis Vaccines）經(jīng)過馴化獲得的MDCK細(xì)胞株生產(chǎn)的Optaflu?于2007年獲得了歐洲藥品審評署（EMEA）的批準(zhǔn)，Optaflu?在歐盟27個成員國、冰島和挪威得到了廣泛的使用。Optaflu?的上市標(biāo)志著近50年流感疫苗生產(chǎn)史最重大的創(chuàng)新之一。Flucelvax?滅活疫苗（甲型流感病毒亞型和乙型流感病毒）于2012年11月獲得美國FDA批準(zhǔn)用于18歲以上成人流感預(yù)防接種。阿斯利康(AstraZeneca)旗下的MedImmune公司生產(chǎn)的4價減毒活疫苗Flumist?于2010年獲得美國FDA的批準(zhǔn)用于2-45歲人群接種。

MDCK細(xì)胞用于流感疫苗生產(chǎn)的主要爭議是因?yàn)槠渚哂谐闪鲂浴?005年11月16日疫苗和相關(guān)生物制品顧問委員會（VRBPAC）組織召開的會議討論了MDCK細(xì)胞作為細(xì)胞基質(zhì)用于流感疫苗生產(chǎn)的相關(guān)事宜，并且著重討論了MDCK細(xì)胞的成瘤性問題。會議期間諾華公司、荷蘭蘇威制藥公司、美國醫(yī)學(xué)免疫學(xué)公司分別做了MDCK細(xì)胞的研究報告。諾華公司的研究報告顯示無血清懸浮培養(yǎng)型MDCK細(xì)胞的成瘤性非常強(qiáng)，10個細(xì)胞就可以對裸鼠成瘤，但是對該公司通過馴化獲得的MDCK細(xì)胞株33016-PF的研究顯示該細(xì)胞株對裸鼠不成瘤。荷蘭蘇威制藥公司的研究報告顯示MDCK細(xì)胞（CCL-34）母細(xì)胞（P56）接種的細(xì)胞量高于10⁷細(xì)胞對裸鼠成瘤，建立的細(xì)胞庫細(xì)胞傳代至P98代時接種10⁵細(xì)胞量就對裸鼠形成腫瘤。美國醫(yī)學(xué)免疫學(xué)公司生產(chǎn)流感疫苗使用的細(xì)胞是該公司自主研發(fā)獲得的無成瘤性MDCK貼壁細(xì)胞株，接種10⁷細(xì)胞量對裸鼠不成瘤。目前，獲得無成瘤性MDCK細(xì)胞株仍是各國科研人員研究的重點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一株無成瘤性MDCK細(xì)胞克隆株。本發(fā)明對ATCC引進(jìn)的MDCK細(xì)胞（CCL-34）母細(xì)胞（P56）通過單細(xì)胞克隆、染色體分析和裸鼠接種篩選得到了無成瘤性的MDCK細(xì)胞克隆株，并在中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）進(jìn)行了保藏，保藏編號為：C2016151，分類命名：犬腎細(xì)胞MDCK-C65，保藏日期為：2016年7月27日，保藏地址為：湖北省武漢市武昌區(qū)八一路299號武漢大學(xué)。

本發(fā)明的第一個目的是提供無成瘤性MDCK細(xì)胞克隆株，所述無成瘤性MDCK細(xì)胞克隆株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，分類命名：犬腎細(xì)胞MDCK-C65，保藏編號為：C2016151。

本發(fā)明的第二個目的是提供無成瘤性MDCK細(xì)胞克隆株在流感疫苗生產(chǎn)中的應(yīng)用。

作為優(yōu)選，所述MDCK細(xì)胞克隆株作為細(xì)胞基質(zhì)用于流感疫苗生產(chǎn)。

作為優(yōu)選，將MDCK細(xì)胞克隆株接種動物后，所述MDCK細(xì)胞克隆株對接種動物不成瘤。

本申請人通過單細(xì)胞克隆培養(yǎng)和篩選，得到了一株無成瘤性的MDCK細(xì)胞株（分類命名：犬腎細(xì)胞MDCK-C65，保藏編號C2016151），為我國開展流感疫苗的相關(guān)研究和生產(chǎn)提供無成瘤性的細(xì)胞株。

附圖說明

附圖用來提供對本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與本發(fā)明的實(shí)施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。在附圖中：

圖1為MDCK單細(xì)胞克隆生長過程；其中，A.第9天，B.第13天；

圖2為MDCK細(xì)胞；其中，A.未克隆的MDCK細(xì)胞，B.MDCK-C65，C.MDCK-C72，Aa.培養(yǎng)前24h有島樣和似成纖維狀，Ab.培養(yǎng)48h呈較致密的上皮型，Ba.培養(yǎng)24h似成纖維狀，Bb.培養(yǎng)48h呈致密的上皮型，Ca.培養(yǎng)48h呈島樣生長，Cb.培養(yǎng)96h呈致密的上皮型.10X；

圖3為MDCK細(xì)胞染色體數(shù)量分布比例圖；

圖4為活細(xì)胞接種裸鼠觀察結(jié)果；其中，A.陽性對照Hela細(xì)胞，B.陰性對照MRC-5細(xì)胞，C.MDCK-C65。

具體實(shí)施方式

以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為市售。

實(shí)施例1

1.材料

1.1 MDCK細(xì)胞株（CCL-34），2011年2月21日從ATCC引進(jìn)，引進(jìn)時細(xì)胞代次為P56，在ATCC的保藏號：58860056。在本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)10代（P66）時建庫保存，入庫編號為GsAcc2B000009057。裸鼠成瘤結(jié)果為6/10（即試驗(yàn)的10只裸鼠中有6只長出腫瘤）。

1.2 DMEM(H)培養(yǎng)基，貨號：BGLM-101.01，批號20150128、20160615，蘭州百靈生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。使用時加10%胎牛血清（體積百分?jǐn)?shù)）。

1.3胎牛血清，批號：20150715，蘭州百靈生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.4 0.25%胰蛋白酶（含EDTA），批號：20150715、20151228，蘭州百靈生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.5 D-PBSA（無鈣鎂離子），批號：20150312，蘭州百靈生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.6 U型96孔細(xì)胞培養(yǎng)板：批號140029，貨號163320；

24孔細(xì)胞培養(yǎng)板：批號7193630，貨號142475；

均為Thermo公司生產(chǎn)。

1.7 細(xì)胞培養(yǎng)瓶

T25貨號：430639，批號：12814601；

T75貨號：430641，批號：08514601；

T225貨號：431081，批號：28913010；

均為corning公司生產(chǎn)。

1.8 凍存管1.5ml（貨號：5000-1020，批號1115432，ThermoFisher公司生產(chǎn)）。

1.9 BALB/c裸鼠（4-7周齡）雌鼠，北京維通利華試驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，在甘肅中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心飼養(yǎng)。

1.10 對照細(xì)胞

Hela細(xì)胞和MRC-5細(xì)胞，均為甘肅省動物細(xì)胞工程技術(shù)研究中心保藏。

2 主要儀器設(shè)備

2.1生物顯微鏡（CKX-41，日本，OLYMPUS）。

2.2 CO₂培養(yǎng)箱（3111，美國，ThermoFisher）。

2.3 細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（CASY TT，美國，INNOVATIS）。

2.4其它設(shè)備：各種規(guī)格的移液器。

3.方法

3.1細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)

按常規(guī)方法在38-39℃水浴中快速解凍細(xì)胞，用10ml DMEM(H)培養(yǎng)基懸浮后1000rpm離心5min。棄上清用20ml DMEM(H)培養(yǎng)基將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至75cm細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置37℃，5%CO₂的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至生長單層。

3.2單細(xì)胞懸液制備

采用有限稀釋法制備單細(xì)胞懸液。

3.2.1取生長至單層的MDCK細(xì)胞，倒掉培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，加入 10ml 的 PBS 輕輕搖動清洗，共清洗兩遍；

3.2.2加入5ml 的0.25%胰蛋白酶，在37℃下進(jìn)行消化細(xì)胞至細(xì)胞變圓，棄去胰酶；

3.2.3加入10ml DMEM(H)培養(yǎng)基，吹打細(xì)胞至完全分散，于1000rpm離心10min；

3.2.4離心完畢后，將上清液倒掉，加入DMEM(H)培養(yǎng)基 10ml，將細(xì)胞重新均勻懸浮后計(jì)數(shù)；

3.2.5細(xì)胞稀釋方法：細(xì)胞計(jì)數(shù)濃度→10×10⁴/ml→1×10⁴/ml→1×10³/ml，吸取1×10³/ml細(xì)胞100μl至20ml DMEM(H)培養(yǎng)基中混合均勻，即每200μl中約含1個細(xì)胞。

3.3單細(xì)胞培養(yǎng)

用12道移液器將上述稀釋好的單細(xì)胞懸液加到U型96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加200μl，即每孔加1個細(xì)胞，共加5塊培養(yǎng)板，并于 37℃，5%CO₂的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)2h后取出細(xì)胞板，在顯微鏡下逐孔觀察，標(biāo)記出只有1個細(xì)胞的孔，再放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。每天觀察只接種了一個細(xì)胞的孔內(nèi)的生長情況，并在培養(yǎng)第4d和8d對單細(xì)胞孔各換液一次，換液量每孔200μl。

3.4單克隆細(xì)胞株的挑選

3.4.1單細(xì)胞培養(yǎng)至11-13d時，每天用顯微鏡觀察單細(xì)胞孔中的生長情況，依據(jù)細(xì)胞長勢和形態(tài)挑選優(yōu)勢克隆株40株分別進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，此時優(yōu)勢株細(xì)胞可覆蓋接種孔低面40%以上的生長面。在傳代擴(kuò)大培養(yǎng)期間可淘汰生長不良的細(xì)胞株。

3.4.2細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)

（1）挑選的單克隆細(xì)胞株每次培養(yǎng)操作時要逐孔依次進(jìn)行，防止細(xì)胞間交叉污染，如同時操作多個孔，有細(xì)胞間交叉污染的風(fēng)險。從第一次傳代的先后順序編號，依次為MDCK-C51、MDCK-C52……MDCK-C90。

（2）從96孔培養(yǎng)板到24孔培養(yǎng)板擴(kuò)大培養(yǎng)

用移液器吸掉孔內(nèi)的培養(yǎng)基，每次加入200μl PBS，用移液器輕輕吹洗兩下，吸去PBS，共吹洗兩次。每孔加入0.25%胰蛋白酶50μl，置于培養(yǎng)箱消化，從第5min起，每隔1min取出在顯微鏡下觀察消化情況，直到細(xì)胞完全變圓并有輕微脫落感時，輕輕吸去上層胰酶，加入100μl的DMEM(H)培養(yǎng)基，再輕輕吹打幾次使細(xì)胞完全懸浮后轉(zhuǎn)移至24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，置37℃，5% CO₂的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。1孔96孔培養(yǎng)板中的細(xì)胞傳代至24孔培養(yǎng)板的1孔，24孔培養(yǎng)板培養(yǎng)時每孔加1mlDMEM(H)培養(yǎng)基。每天觀察24孔培養(yǎng)板中的生長狀況，待細(xì)胞長成單層細(xì)胞時繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)（需要48h-72h）。

（3）從24孔到T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶擴(kuò)大培養(yǎng)

依照（2）的方法，清洗用PBS每次加1ml，消化用0.25%胰蛋白酶每孔加0.5ml，用10mlDMEM(H)培養(yǎng)基傳代至T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶至生長成單層細(xì)胞（需要72h-120h）。

（4）從T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶到T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶擴(kuò)大培養(yǎng)

依照（3）的方法，清洗用PBS每次加10mlPBS，消化用0.25%胰蛋白酶每瓶加5ml，用40ml DMEM(H)培養(yǎng)基傳代至2個T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，每瓶20ml，培養(yǎng)至細(xì)胞成致密單層（需要48h-96h）。

3.4.3單克隆細(xì)胞株原始細(xì)胞庫的建立

（1）根據(jù)培養(yǎng)過程中細(xì)胞的長勢和形態(tài)情況，挑選優(yōu)勢克隆株進(jìn)行保種凍存。

（2）按上述3.4.2（3）方法消化成單細(xì)胞懸液，消化T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞時清洗用PBS每次加20ml，消化用0.25%胰蛋白酶每瓶加10ml。每瓶用10ml培養(yǎng)液懸浮后兩瓶細(xì)胞合并計(jì)數(shù)，于1000rpm離心10min后棄上清。

（3）用細(xì)胞凍存液重新懸浮離心后的細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞濃度為1-2×10⁶個/ml，每支凍存管按1ml分裝，貼標(biāo)簽后按常規(guī)方法在液氮中保存，標(biāo)簽要標(biāo)記細(xì)胞編號、細(xì)胞株名稱、克隆株號、細(xì)胞代次和凍存日期等信息，建立原始細(xì)胞庫，保存種子細(xì)胞。

細(xì)胞凍存液由以下體積百分?jǐn)?shù)的各組分組成：10%DMSO（二甲基亞砜）+20%胎牛血清+70%DMEM培養(yǎng)基。

3.4.4單克隆細(xì)胞株染色體數(shù)測定

依照3.1的方法分別復(fù)蘇原始細(xì)胞庫的細(xì)胞各1支，按哺乳動物細(xì)胞染色體常規(guī)分析方法，制備染色體標(biāo)本，每株克隆株細(xì)胞統(tǒng)計(jì)50個以上處于中期分裂相細(xì)胞的染色體數(shù)量，并統(tǒng)計(jì)染色體數(shù)量處于78±2的細(xì)胞占的數(shù)量（MDCK細(xì)胞來源于犬腎，犬類的正常染色體數(shù)為78條）。

3.4.5單克隆細(xì)胞株的成瘤性初步檢查

選取染色體眾數(shù)（78±2）大于80%的單克隆細(xì)胞株，依照3.1的方法復(fù)蘇培養(yǎng)，按照《中華人民共和國藥典》（2015年版三部）“生物制品生產(chǎn)檢定用動物細(xì)胞基質(zhì)制備及檢定規(guī)”的附錄二進(jìn)行成瘤性檢查（每只裸鼠接種1.0×10⁷個活細(xì)胞）。

3.4.6無成瘤性細(xì)胞株的主細(xì)胞庫建立、復(fù)檢和保藏

（1）依照3.1的方法，從單克隆細(xì)胞株原始細(xì)胞庫中復(fù)蘇1支初步檢查不成瘤的單克隆細(xì)胞株接種到1個T75細(xì)胞培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，并按照1個T75→2個T225→8個T225的比例擴(kuò)大培養(yǎng)后凍存，建立主細(xì)胞庫。凍存方法同3.4.3，其中，在T225細(xì)胞培養(yǎng)瓶細(xì)胞清洗每次加50mlPBS，消化用0.25%胰蛋白酶每瓶加20ml。

（2）依照3.1的方法復(fù)蘇主細(xì)胞庫的細(xì)胞1支，按照《中華人民共和國藥典》（2015年版三部）“生物制品生產(chǎn)檢定用動物細(xì)胞基質(zhì)制備及檢定規(guī)”的附錄二進(jìn)行成瘤性復(fù)查（每只裸鼠接種1.0×10⁷個活細(xì)胞）。

（3）取成瘤性復(fù)查仍不成瘤的MDCK單克隆細(xì)胞株主細(xì)胞庫中的細(xì)胞，用加干冰的包裝快運(yùn)至中國典型培養(yǎng)物保藏中心（武漢）進(jìn)行保藏。

4結(jié)果

4.1 通過單細(xì)胞克隆培養(yǎng)和篩選，最后選擇了7株優(yōu)勢細(xì)胞株建立了原始細(xì)胞庫，均呈上皮型細(xì)胞，編號分別為：MDCK-C54、MDCK-C59、MDCK-C60、MDCK-C65、MDCK-C66、MDCK-C71和MDCK-C72。其中，MDCK-C72在每代培養(yǎng)前48h呈島樣生長，生長速度較慢，1：6的分瓶比例傳代時72-96小時才能形成致密單層。其它六株為生長速度較快，培養(yǎng)前期似成纖維狀，1：6的分瓶比例傳代時48-72小時可形成致密單層。兩類細(xì)胞形成致密單層后，形態(tài)無明顯區(qū)別。凍存的細(xì)胞活力均好，胎盤藍(lán)染色后鏡下很少看到死細(xì)胞，細(xì)胞凍存信息見下表1。

表1.單克隆細(xì)胞株的凍存信息表

54.2單克隆細(xì)胞的染色體數(shù)量78條所占的比例在29.2-85%，78±2條所占比例在45.5-90%，其中，MDCK-65株染色體78條和78±2條所占比例最高，分別為85%和90%；其次是MDCK-72株分別為65.4%和84.6%；其余5株78條和78±2條最高為34.9%和58.3%。未克隆的MDCK細(xì)胞染色體78條和78±2條為54.5%和77.3%。統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。

表2.單克隆細(xì)胞株染色體統(tǒng)計(jì)結(jié)果表

4.3 成瘤性初步檢查

對染色體數(shù)（78±2）大于80%的MDCK-C65和MDCK-C72兩株細(xì)胞進(jìn)行初步成瘤性檢查，裸鼠成瘤結(jié)果分別為0/10和1/10。

表3 成瘤性初步檢查結(jié)果

4.4無成瘤性細(xì)胞株的主細(xì)胞庫建立、復(fù)檢和保藏

4.4.1從單克隆細(xì)胞株原始細(xì)胞庫中復(fù)蘇1支成瘤性初步檢查不成瘤的MDCK-C65株細(xì)胞，經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后凍存500支，細(xì)胞密度為：1.91×10⁶個/ml，凍存活力：99.5%（胎盤藍(lán)染色后鏡下很少看到死細(xì)胞），建立了主細(xì)胞庫。

4.4.2 從單克隆細(xì)胞株主細(xì)胞庫中復(fù)蘇1支MDCK-C65株，進(jìn)行成瘤性復(fù)檢，結(jié)果為：0/10，再次證明該細(xì)胞株不具有成瘤性。

表4 成瘤性復(fù)檢結(jié)果

4.4.3從單克隆細(xì)胞株主細(xì)胞庫中取MDCK-C65株，用加干冰的包裝快運(yùn)至中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）進(jìn)行保藏，分類命名：犬腎細(xì)胞MDCK-C65，保藏編號：C2016151，保藏日期為：2016年7月27日，保藏地址為：湖北省武漢市武昌區(qū)八一路299號武漢大學(xué)。

經(jīng)實(shí)驗(yàn)，本發(fā)明的細(xì)胞株犬腎細(xì)胞MDCK-C65是貼壁培養(yǎng)型。

最后應(yīng)說明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其依然可以對前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。