本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，更特別地，涉及一種Smad4蛋白可結(jié)合的DNA片段及其在檢測細(xì)胞內(nèi)Smad4轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

Smad4是從染色體18q21.1分離出的一個腫瘤抑制基因，其編碼的Smad4蛋白屬于SMAD信號轉(zhuǎn)導(dǎo)家族中的一員，是一類在真核生物中分布廣泛的多功能轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，參與了轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β超家族細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)過程，在基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，并參與多種生物學(xué)功能的調(diào)控。

Smad4蛋白由進(jìn)化上高度保守的N末端MH1、C末端MH2結(jié)構(gòu)域以及中間富含脯氨酸的高變連接區(qū)組成，Smad4蛋白可與其他種類的SMAD蛋白結(jié)合形成SMAD復(fù)合物，協(xié)同調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄，控制腫瘤細(xì)胞生長、分化及凋亡；還可通過結(jié)合DNA來發(fā)揮其生物學(xué)功能。Smad4作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的作用十分關(guān)鍵，TGF-β/Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的異常可引起疾病的發(fā)生或腫瘤的形成。Smad4的缺失和突變可以導(dǎo)致胰腺癌、幼年息肉樣綜合征、遺傳性出血性毛細(xì)血管綜合征等重大疾??；Smad4基因沉默、活性位點(diǎn)突變等有可能促進(jìn)裸鼠移植瘤增殖和微血管形成。Smad4表達(dá)水平的變化會影響疾病的發(fā)生發(fā)展，因此有可能作為研究這些疾病的病理學(xué)發(fā)展過程的標(biāo)志之一。

目前，對Smad4的檢測主要依靠Western Blot或者qRCR等技術(shù)。這類技術(shù)雖然靈敏度高，但檢測到的只是Smad4蛋白含量的差異，并不能直接體現(xiàn)其結(jié)合到靶序列后活性的改變。

因此，需要設(shè)計一種新的用于檢測細(xì)胞內(nèi)Smad4轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

發(fā)明人通過研究發(fā)現(xiàn)，Smad4蛋白結(jié)合的DNA序列存在高度的保守性，其結(jié)合的DNA核心序列為5’-CAGAC-3’。

基于以上研究，本發(fā)明提供了一種Smad4蛋白可結(jié)合的DNA片段，其包含多個Smad4蛋白結(jié)合框，所述Smad4蛋白結(jié)合框的序列包含5’-CAGAC-3’，并且還包含一段富GC序列。每兩個相鄰的Smad4蛋白結(jié)合框之間具有間隔序列，并且所述間隔序列為AT。用多個結(jié)合框可提高Smad4蛋白的識別和結(jié)合效率，提高靈敏度。得到的DNA片段序列如SEQ ID NO:1所示。在研究過程中，我們試驗了多種組合，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該序列的DNA片段比其他組合方式對Smad4蛋白的結(jié)合效率更高。

本發(fā)明還提供了上述DNA片段在檢測細(xì)胞內(nèi)Smad4轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了一種用于檢測細(xì)胞內(nèi)Smad4轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的方法，其包括以下步驟：

S1：將包括上述DNA片段以及連接于所述DNA片段下游的報告基因表達(dá)框的報告基因系統(tǒng)導(dǎo)入所述細(xì)胞；

S2：通過檢測所述報告基因的表達(dá)來計算所述細(xì)胞內(nèi)Smad4轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性?？蓪蟾婊虻谋磉_(dá)強(qiáng)度作為衡量Smad4轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的指標(biāo)。

優(yōu)選地，所述報告基因系統(tǒng)為雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)，包括重組質(zhì)粒和對照質(zhì)粒，并且所述重組質(zhì)粒帶有所述DNA片段以及連接在所述DNA片段下游的熒光素酶I的表達(dá)框，所述對照質(zhì)粒帶有熒光素酶II的表達(dá)框，所述熒光素酶I與所述熒光素酶II激發(fā)產(chǎn)生的熒光波長不同。將Smad4轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性表示為熒光素酶I激發(fā)產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度與熒光素酶II激發(fā)產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度的比值。

優(yōu)選地，所述重組質(zhì)粒通過將所述DNA片段插入至質(zhì)粒pGL3-Basic的Kpn I與Hind III位點(diǎn)之間得到。

優(yōu)選地，所述對照質(zhì)粒為phRL-TK。

優(yōu)選地，S1具體包括：

S11：將所述細(xì)胞培養(yǎng)至貼壁，并恢復(fù)形態(tài)；

S12：將所述重組質(zhì)粒和對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。

優(yōu)選地，S2具體包括：

S21：轉(zhuǎn)染后將細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24-36小時，洗滌細(xì)胞；

S22：分別檢測轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中的熒光素酶I和熒光素酶II的活性；

S23：將熒光素酶II活性歸一化熒光素酶I活性得到值作為衡量Smad4轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的指標(biāo)。

通過使用本發(fā)明的DNA片段和方法，可直接針對性地檢測細(xì)胞內(nèi)Smad4的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性，而非僅僅檢測其轉(zhuǎn)錄本或蛋白質(zhì)的含量，從而使得能夠更準(zhǔn)確地分析Smad4作為轉(zhuǎn)錄因子在一些發(fā)育生物學(xué)和病理學(xué)發(fā)展中所起的作用。

附圖說明

圖1為Kpn I與Hind III對重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切后的瓊脂糖凝膠電泳照片；

圖2為分別轉(zhuǎn)染了pGL3.0-Smad4-Luc后再分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-Smad4和pcDNA3.1(+)空載體的人胃細(xì)胞系SGC-7901、人前列腺癌PC-3、人宮頸癌細(xì)胞系HeLa細(xì)胞中的相對Smad4活性(即，螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值)的統(tǒng)計圖。

具體實施方式

以下結(jié)合實例對本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。

1.構(gòu)建Smad4蛋白可結(jié)合的DNA片段

發(fā)明人對Smad4進(jìn)行研究分析，發(fā)現(xiàn)Smad4蛋白結(jié)合的DNA序列為5’-CAGAC-3’。合成該DNA核心序列時，將這段DNA核心序列重復(fù)三次，并且在每段核心序列的5’端都連接富GC序列，以AT堿基進(jìn)行間隔，其序列如SEQ ID NO:1所示，并連接至攜帶螢火蟲熒光素酶的表達(dá)載體(pGL3.0-Basic)中。

為保證載體構(gòu)建的成功，在末端加入相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的粘性末端，本例在5’端加入Kpn I酶切位點(diǎn)的粘性末端(CATGG)，在3’端加入Hind III酶切位點(diǎn)的粘性末端(TTCGA)，序列兩邊的粘性末端的設(shè)計有助于片段與載體的連接。

通過從頭合成的方法，分別合成該片段的兩條寡核苷酸鏈，其序列分別如SEQ ID NO:2和3所示，這兩條寡核苷酸鏈皆由武漢擎科生物技術(shù)有限公司合成。兩條寡核苷酸鏈互補(bǔ)配對后形成包含Kpn I酶切位點(diǎn)粘性末端和Hind III酶切位點(diǎn)粘性末端的雙鏈DNA片段。100μl退火體系如下：Annealing Buffer for DNA Oligos(5X)20μl、寡核苷酸鏈(50μM)各20μl，余下為ddH₂O。

充分混勻后，設(shè)置PCR儀程序進(jìn)行退火反應(yīng)。DNA退火結(jié)束后可于﹣20℃凍存?zhèn)溆?，或也可用于連接反應(yīng)。如果退火結(jié)束后打算進(jìn)行酶切反應(yīng)，最好用純化試劑盒進(jìn)行純化。

2.將Smad4蛋白可結(jié)合的DNA片段插入熒光素酶表達(dá)載體

用內(nèi)切酶Kpn I和Hind III(購自TAKARA公司，Kpn I貨號為1618，Hind III貨號為1615)對上述pGL3.0-Basic空載體進(jìn)行雙酶切，20μl 酶切體系如下：10x QuickCut Green buffer 2μl，Kpn I 1.5μl，HindIII1.5μl，pGL3.0-Basic空載體6μl，余下為ddH₂O。

充分混勻后，37℃酶切反應(yīng)120分鐘，用1.5％普通瓊脂糖凝膠電泳鑒定質(zhì)粒酶切情況判斷是否酶切完全，切膠回收(DNA膠回收試劑盒購自天根生化科技有限公司，貨號為D0251)，回收結(jié)束后測樣品濃度，置冰上備用。

將退火得到的雙鏈DNA連接至pGL3.0-Basic熒光素酶表達(dá)載體上。10μl連接體系如下：DNA連接酶(購自TAKARA公司，貨號為6022)5μl，雙鏈DNA片段與經(jīng)雙酶切的pGL3-Basic載體共5μl。為促進(jìn)酶連成功率，將DNA片段與載體的摩爾比控制在8:1左右。充分混勻后，將酶連體系置于PCR儀中，16℃反應(yīng)1小時，連接反應(yīng)結(jié)束后得到重組質(zhì)粒，置于冰上備用。

將重組質(zhì)粒(含有Smad4蛋白結(jié)合的DNA片段的pGL3.0-Basic表達(dá)載體)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌。按照經(jīng)典的熱激法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，具體方法如下：從-80℃冰箱中取出大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α,置于冰上解凍2-3分鐘，分成3管，加入上述連接好的重組質(zhì)粒，輕輕混勻，冰上孵育15-20分鐘，42℃熱激60秒，迅速放至冰上靜置2-3分鐘，然后加入500μl不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，放置于恒溫?fù)u床中復(fù)蘇1小時。取復(fù)蘇后的菌液100μl均勻涂布于含氨芐青霉素抗性的LB固體選擇培養(yǎng)基中，吸收10分鐘后，將培養(yǎng)皿倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜。次日挑取單菌落至5ml含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，經(jīng)37℃200轉(zhuǎn)/分鐘，搖菌12小時后提取質(zhì)粒。

用內(nèi)切酶Kpn I和Hind III(購自TAKARA公司，Kpn I貨號為1618，Hind III貨號為1615)對上述提取的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，本發(fā)明實施例雙酶切鑒定如圖1所示(泳道1為marker，泳道2、3和5顯示為陽性克隆)。陽性質(zhì)粒送至武漢擎科生物技術(shù)有限公司測序，確認(rèn)DNA片段已整合至pGL3.0-Basic載體上。至此，含有Smad4蛋白結(jié)合的DNA片段的pGL3.0-Basic表達(dá)載體(以下均表示為pGL3.0-Smad4-Luc)構(gòu)建成功。

3.pGL3.0-Smad4-Luc轉(zhuǎn)染細(xì)胞

本發(fā)明實施例采用SGC-7901、人前列腺癌PC-3、人宮頸癌細(xì)胞系HeLa進(jìn)行雙熒光素酶實驗。分別將對數(shù)期生長的細(xì)胞均勻種植在24孔板內(nèi)，每孔約10萬個細(xì)胞，用10％胎牛血清，高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜。待細(xì)胞貼壁并恢復(fù)形態(tài)后，將報告基因系統(tǒng)相關(guān)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中(轉(zhuǎn)染時細(xì)胞密度約為60-80％為宜)。使用的轉(zhuǎn)染試劑為Neofect(購自零客創(chuàng)智生物科技有限公司，貨號為TF20121201)。50μl轉(zhuǎn)染體系如下：質(zhì)粒0.5μg，Neofect轉(zhuǎn)染試劑0.5μl，余下為無血清培養(yǎng)基。

本實驗中使用的質(zhì)粒分別為：pGL3.0-Basic空報告基因質(zhì)粒、pGL3.0-Smad4-Luc(含有Smad4蛋白的核心DNA結(jié)合位點(diǎn)序列的pGL3.0-Basic報告基因質(zhì)粒)、phRL-TK(帶有海腎熒光素酶基因的質(zhì)粒)、pcDNA3.1(+)-Smad4(Smad4過表達(dá)質(zhì)粒)。

4.計算Smad4的活性

將pGL3.0-Smad4-Luc重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，然后分別將pcDNA3.1(+)-Smad4(Smad4過表達(dá)質(zhì)粒)和空載體導(dǎo)入細(xì)胞中，檢測Smad4報告基因系統(tǒng)的活性。

以海腎熒光素酶活性作為內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，計算Smad4活性。具體實驗方法如下：轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24-36小時，再棄培養(yǎng)基上清，用1xPBS清洗細(xì)胞3次，每次5分鐘，清洗細(xì)胞時注意操作輕柔，避免正面吹打細(xì)胞。加入配制好的細(xì)胞裂解液，用移液器輕輕吹打幾次，促進(jìn)細(xì)胞充分裂解，室溫放置5-10分鐘后用來檢測。螢火蟲熒光酶的活性測定：取100μl Luciferase Assay Reagent加入測試管底部，加入20μl待測樣品，輕輕混勻后，放入儀器進(jìn)行檢測。海腎熒光素酶活性測定：取100μl稀釋好的Stop Reagent加入上述步驟的測定管中，混勻后，放入儀器進(jìn)行檢測。

測定結(jié)果如圖2所示，外源導(dǎo)入Smad4后，陽性處理組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-Smad4)熒光活性明顯高于對照組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)空載體)。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

序列表

<110> 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院

<120> 一種Smad4蛋白可結(jié)合DNA片段及在Smad4活性檢測中的應(yīng)用

<130> 1

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gtggggcagc catctatctc gggcagacat ccatgtcatt cagacttat 49

<210> 2

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cgtggggcag ccatctatct cgggcagaca tccatgtcat tcagacttat a 51

<210> 3

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agcttataag tctgaatgac atggatgtct gcccgagata gatggctgcc ccacggtac 59