專利名稱：抗癌配方的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種醫(yī)藥配方，其含有正丁烯基苯酞及多元酸酐。本發(fā)明也涉及此配 方用于治療腫瘤的用途。
背景技術(shù)：
正丁烯基苯酞(Bdph)為從當(dāng)歸(Angelica sinensis)分離出來(lái)的化學(xué)化合物。 其可用于治療各種不同腫瘤，例如多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(glioblastomamultiforme)及乳 腺癌。參見(jiàn)，例如，Tsai 等人，Clin. Cancer Res. 2005，11 (9) :3475_3484 及 Tsai 等人，J Neurochem. 2006,99(4) :1251_62。然而，以選擇性及持續(xù)的方式將正丁烯基苯酞遞送至癌 癥部位對(duì)于其于有效癌癥治療方面的用途系重要的。這對(duì)于治療腦癌尤其重要，其中該藥 物由于血腦屏障(blood brain barrier)而難以達(dá)到疾病區(qū)域。所以需要研發(fā)用于遞送該 藥物的有效方式。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明系以一種醫(yī)藥配方的發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)，正丁烯基苯酞可從該醫(yī)藥配方歷經(jīng)長(zhǎng)時(shí) 間，例如，多于30天，逐漸釋放。在一方面中，本發(fā)明描述一種醫(yī)藥配方的特征，該醫(yī)藥配方含有(i)正丁烯基苯 酞及(ii) 一聚合物，其為混合在一起。該聚合物可為聚(乳酸_共聚合_乙醇酸)、聚氨基葡萄糖(chitosan)、膠原、水 凝膠或多元酸酐，該多元酸酐系由雙(對(duì)羧基苯氧基)丙烷、雙(對(duì)羧基苯氧基)丁烷、雙 (對(duì)羧基苯氧基)戊烷、雙(對(duì)羧基苯氧基)庚烷、雙(對(duì)羧基苯氧基)己烷、雙(對(duì)羧基苯 氧基)辛烷、間苯二甲酸、1，4_苯二丙酸、十二烷二酸、草酸、丙二酸、丁二酸、戊二酸、己二 酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、癸二酸、鄰苯二甲酸、間苯二甲酸、對(duì)苯二甲酸或其混合物制備 而成。該配方之一實(shí)例為正丁烯基苯酞與多元酸酐p(CPP-SA)的混合物，該多元酸酐 P(CPP-SA)系由雙(對(duì)羧基苯氧基)丙烷(CPP)與該癸二酸(SA)制備而成。在該多元酸 酐中，該雙(對(duì)羧基苯氧基)丙烷與該癸二酸之間的比例較佳為1 2至1 10(例如， 1:4)。該正丁烯基苯酞的重量百分比為該配方的3%至20% (例如，10%)。該配方可呈 粉末、膜片(wafer)、薄片、棒、微球、納米球、糊或膠的形態(tài)。在另一方面中，本發(fā)明描述上述用于治療腫瘤的醫(yī)藥配方的特征。能治療的腫瘤 之實(shí)例包括，但不限于，多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、肺癌、肝細(xì)胞癌、結(jié)腸癌、黑色素瘤、乳腺癌、 神經(jīng)胚細(xì)胞瘤、畸胎瘤或人類白血病。而且上述配方在制造有用于治療腫瘤的藥劑時(shí)的用途在本發(fā)明的范圍以內(nèi)。在下文說(shuō)明中說(shuō)明本發(fā)明的一個(gè)或更多具體實(shí)施例的細(xì)節(jié)。從此說(shuō)明及申請(qǐng)專利 范圍將使本發(fā)明的其他特征、目的及優(yōu)點(diǎn)顯而易見(jiàn)。用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的正丁烯基苯酞在商業(yè)上可以，例如，從LancasterSynthesis有限公司(UK)取得。其也可從當(dāng)歸的氯仿萃取物分離出來(lái)。參見(jiàn)，例如，Tsai等人，Clin. Cancer Res. 2005，11 (9) :3475_3484。該正丁烯基苯酞化合物，無(wú)論用購(gòu)買或分離的方式，可進(jìn)一步經(jīng)由快速柱層析 (flash column chromatography)、高效液相層析法、結(jié)晶法或任何其他適合方法加以純 化。
用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的聚合物可任意從商業(yè)上取得或可經(jīng)由本領(lǐng)域已知的方法制備 而成。舉例來(lái)說(shuō)，可使二元酸化合物在醋酸酐中回流而獲得多元酸酐。該聚合物可為一共聚物。有關(guān)一實(shí)例，此一共聚物可由二不同聚多元酸酐部分利 用熔融縮聚法制備而成。參見(jiàn)，例如，Domb等人，Journal ofPolymer Science, 1987, 25 3373-3386。所獲得的聚合物可通過(guò)任何適合的方法予以純化而且通過(guò)NMR、MS或FT-IR來(lái)界 定其特征。為了制備本發(fā)明的配方，可于想要的比例(例如，10重量份的正丁烯基苯酞及90 重量份的多元酸酐)下混合該亞丁基苯酞與該聚合物，例如，多元酸酐。有關(guān)另一實(shí)例，可 將該亞丁基苯酞與多元酸酐溶于一溶劑(例如，二氯甲烷)內(nèi)而且接著移除該溶劑以提供
一干粉。由此所獲得的混合物可進(jìn)一步加工成各種不同的形態(tài)，例如膜片、薄片、棒、微球、 納米球、糊或膠。舉例來(lái)說(shuō)，可使用一模子把該混合物壓縮成膜片。在此使用的措辭“醫(yī)藥配方”系用于意指一組成，其(i)系適用于給藥給人類 或其他哺乳動(dòng)物或其可經(jīng)處理，例如，殺菌，使其適用于此給藥，及(ii)包含至少一藥 物(例如，正丁烯基苯酞)及上述聚合物之至少其一。此配方可為任何可遞送一藥物的 裝置的部分或全部，該裝置包括丸劑、膠囊、凝膠、針劑(cbpot)、醫(yī)藥可植入的裝置(例 如，支架(其包括自膨式支架，球囊擴(kuò)張式支架、涂藥血管支架(drug-eluting stent)及 覆膜支架(stent-graft))、移植(例如，主動(dòng)脈移植)、人造心臟瓣膜、腦脊髓液分流器 (cerebrospinal fluid shunt)、起搏,點(diǎn)電極(pacemaker electrode)、>!>律i周節(jié)器導(dǎo)線及 生物吸收性植入體(bioerodable implant)等)，及外部操縱裝置(例如藥物裝置及導(dǎo)管， 其包括可釋放藥物的導(dǎo)管，例如，由于加熱該導(dǎo)管尖端的結(jié)果)。該醫(yī)藥配方也可包括一或 更多其他添加物，舉例來(lái)說(shuō)醫(yī)藥上可接受的賦形劑、載劑、穿透增強(qiáng)劑、安定劑、緩沖劑或其 他以物理方式聯(lián)合該藥物的材料，及/或用于增進(jìn)該給藥形態(tài)的遞送性及/或該藥物的功 效的聚合物。該配方可為，舉例來(lái)說(shuō)，液體、懸浮液、如錠劑、丸劑、膠囊(包括微膠囊)的固 體、乳液、微胞、藥膏、凝膠、乳液、針劑(其包括皮下植入針劑)或在植入裝置，例如支架等， 上的涂層。該配方可舉例來(lái)說(shuō)被施于外部，例如以貼片的形態(tài)，或部分施于外部且部分植入 的裝置，或完全植入或經(jīng)皮下注入。該措辭“藥物”意指在人類或其他哺乳動(dòng)物體內(nèi)局部及/或全身具有生物活性的 材料。藥物的實(shí)例系揭示于Merck Index、the Physicians DeskReference及美國(guó)專利案 第6，297，337號(hào)第11欄第16行至第12欄第58行，及US 2003/0224974的第0045段中， 在此為了所有目的將其全文并入本文。藥物可舉例來(lái)說(shuō)為用于治療、預(yù)防、診斷、治愈或減 輕癥狀或患病，其包括維生素及礦物質(zhì)補(bǔ)充劑；影響哺乳動(dòng)物的構(gòu)造或機(jī)能的物質(zhì)；前藥， 在其被置于生理環(huán)境中之后變?yōu)樯锘钚曰蚋呋钚缘奈镔|(zhì)；及藥物的代謝物。診斷劑的實(shí)例為含有放射線元素的造影劑、含有舉例來(lái)說(shuō)碘、酶及熒光物質(zhì)等的對(duì)比劑。本發(fā)明的配方也可含有適合的添加物。這些添加物可于此配方的任何制備階段時(shí) 包括于此配方內(nèi)。為了賦予預(yù)期的效果該等添加物在此配方內(nèi)的想要濃度，如本領(lǐng)域技術(shù) 人員所習(xí)知，可利用常用方法來(lái)分析。本發(fā)明的配方，通過(guò)與流體接觸，釋放出正丁烯基苯酞_抗腫瘤藥劑。因此，本發(fā) 明亦系關(guān)于通過(guò)投予有效量的此配方給有需要的病患而治療腫瘤的方法。此配方中的亞 丁基苯酞系以特定時(shí)期，例如20、30、35、40、50、60天，緩慢且持續(xù)釋放至鄰近的組織內(nèi)。如此處所用的，該措辭“治療”系定義為投予有效量的此配方給病患，該病患有腫 瘤、腫瘤征兆、腫瘤衍生的疾病或癥狀或易患腫瘤的體質(zhì)，以達(dá)到治愈、緩和、減輕、醫(yī)治或 改善腫瘤、腫瘤征兆、腫瘤衍生的疾病或癥狀或易患腫瘤的體質(zhì)的目的?！安』肌敝傅氖侨嘶蚍侨藙?dòng)物。非人動(dòng)物的實(shí)例包括所有脊椎動(dòng)物，例如，哺乳物， 諸如非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物(特別是高級(jí)靈長(zhǎng)類動(dòng)物)、狗、嚙齒類動(dòng)物(例如，小鼠或大鼠)、天 竺鼠、貓及非哺乳動(dòng)物類，諸如鳥(niǎo)類、兩棲動(dòng)物、爬行動(dòng)物等等。在優(yōu)選的具體實(shí)施例中，該 病患為人類。在另一具體實(shí)施例中，該病患為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物或適合當(dāng)作疾病模型的動(dòng)物。待治 療腫瘤、癌或其他細(xì)胞增殖癥狀的病患可經(jīng)由此癥狀的標(biāo)準(zhǔn)診斷技術(shù)加以辨別。腫瘤為經(jīng)由細(xì)胞的不正常生長(zhǎng)所形成的瘤或病害。其可能為良性瘤或惡性瘤(亦 艮口，癌)。癌指的是一疾病的種類，其中一群細(xì)胞展現(xiàn)不受控制的生長(zhǎng)、侵害及有時(shí)候轉(zhuǎn)移。 能治療的癌的實(shí)例包括，但不限于，多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、肺癌、肝細(xì)胞癌、結(jié)腸癌、黑色素 瘤、乳腺癌、神經(jīng)胚細(xì)胞瘤、畸胎瘤或人類白血病。該措辭“有效量”指的是賦予待治療的病患治療效果的配配方或化合物量。治療 方法可于體內(nèi)或體外進(jìn)行，單獨(dú)或與其他藥物或治療法聯(lián)合。在體內(nèi)方法中，將一化合物或 配方投給一病患。一般而言，該化合物或配方系制備于醫(yī)藥上可接受的載劑(例如，生理食 鹽水)中而且經(jīng)口或經(jīng)由靜脈注射投予，或經(jīng)皮下、肌肉內(nèi)、鞘內(nèi)、腹膜內(nèi)、直腸內(nèi)、葉鞘內(nèi)、 鼻內(nèi)、胃內(nèi)、氣管內(nèi)或肺內(nèi)注射或植入。較佳地，該配方可經(jīng)皮下、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、組織間或顱內(nèi)植入癌癥患者體內(nèi)。在一 具體實(shí)施例中，該配方，以各種不同形態(tài)，可被植入該癌癥部分或其近處而不管該腫瘤有沒(méi) 有被移除。所需的劑量取決于投予途徑的選擇；該配方的本質(zhì)；該患者患病的特質(zhì)；該病患 的體型、重量、表面積、年齡及性別；其他被投予的藥物；及主治醫(yī)師的意見(jiàn)。適合的劑量為 在0. 01至100mg/kg的范圍內(nèi)。所需劑量的變化能綜觀各式各樣可取得的化合物及各種不 同投予途徑的效率而預(yù)期。該配方可配合手術(shù)或放射線治療一起使用。也可 與一種或更多其他化學(xué)治 療藥劑合并。該等化學(xué)治療藥劑可為，舉例來(lái)說(shuō)，如拓?fù)涮婵?topotecan)的喜樹(shù) 堿類(camptothecins)、如者β 沙辛(doxorubicin)的蒽環(huán)類抗生素(anthracycline antibiotics)、如環(huán)磷酰胺的烷化劑類或如紫杉醇(paclitaxel)、帝摩多(temozolomide) 或卡氮芥(carmustin)的抗微管藥劑(antimicrotubuleagent)。


以下，結(jié)合附圖來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)施方案，其中
圖1為顯示ρ (CPP-SA)共聚物的1H NMR波譜的圖形。CPP的芳香族部分的特征信 號(hào)于6. 9至8. 2ppm下觀察到。另一 SA的亞甲基部分的特征信號(hào)于1. 3ppm下觀察到。圖2為顯示ρ (CPP-SA)共聚物的FTIR光譜的圖形。CPP與SA之間的酸酐鍵的特 征信號(hào)于1812. 76cm-1下觀察到。
圖 3 為顯示 ρ (CPP-SA) _2 % BCNU 膜片( )、ρ (CPP-SA) _3 % Bdph 膜片(■)及 ρ (CPP-SA)-10% Bdph膜片(▲)的釋放動(dòng)力學(xué)的圖形。在所有配方中均觀察到Bdph或 BCNU的持續(xù)釋放。圖4Α至4D為顯示ρ (CPP-SA)-10 % Bdph-誘發(fā)大鼠惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng) 抑制的圖形及照片，其中(A)以10% Bdph-膜片治療大鼠惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株RG 24 小時(shí)。通過(guò)MTT分析測(cè)定細(xì)胞成活力。此數(shù)據(jù)表示3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的具有標(biāo)準(zhǔn)偏差的平 均值。*p<0.05。(B)利用膜片治療的RG2惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)。(C)利 用ρ (CPP-SA)-3% Bdph治療24小時(shí)的RG2惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)。(D)利用 ρ (CPP-SA)-10% Bdph治療24小時(shí)的RG2惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)。圖5為顯示Bdph-誘發(fā)Nur77轉(zhuǎn)錄的照片。以IC50濃度的Bdph治療大鼠GBM細(xì) 胞(RG2)達(dá)到指定時(shí)間(0、0.5、1、3及6小時(shí))。以藥物塔養(yǎng)之后，收集細(xì)胞而且分離出全 部RNA。用GADPH當(dāng)作內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)物。圖6為顯示Bdph-誘發(fā)Nur77從細(xì)胞核遷移至細(xì)胞質(zhì)的一組照片，其中以 Bdph (100 μ g/mL)治療DBTRG-05NG細(xì)胞24小時(shí)，接著以抗_Nur77抗體然后對(duì)應(yīng)的 Rhodamine標(biāo)記的IgG 二級(jí)抗體進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色以顯示Nur77蛋白。同時(shí)，以DAPI 把細(xì)胞染色以顯示出細(xì)胞核。以熒光顯微鏡把熒光影像可視化。圖7為顯示Bdph-誘發(fā)RG2細(xì)胞內(nèi)的Nur77核質(zhì)移位的一組照片。把RG2細(xì)胞植 入IOcm碟子內(nèi)而且培養(yǎng)至90%聚滿(confluence)。以Bdph (100 μ g/ml)治療細(xì)胞達(dá)到不 同時(shí)期(0、6、12、24及48小時(shí))。獲取細(xì)胞而且分離出細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)部分。用蛋白質(zhì)印 跡分析法監(jiān)視測(cè)定細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)的Nur77的量。圖8為顯示該Bdph-誘發(fā)生長(zhǎng)抑制中的發(fā)信途徑的影響的一組照片。依指示以 Bdph (100 μ g/ml)治療RG2細(xì)胞達(dá)到0至180分鐘的各種不同時(shí)期。為pJNK、pPKC、ρΑΚΤ、 AKT、pERK、ERK、JNK、pp38及p38抗體進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。用β-肌動(dòng)蛋白的表現(xiàn)當(dāng)作內(nèi) 標(biāo)組。圖9Α至9C為顯示經(jīng)由同基因大鼠GBM模型中的p(CPP-SA)-Bdph抑制腫瘤生長(zhǎng) 的圖形及一組照片。同基因F344大鼠(6只/組)接受IX IO6個(gè)RG2細(xì)胞的皮下背部植 入體。把RG2細(xì)胞(5Χ106)皮下植入F344大鼠的后側(cè)腹內(nèi)。在RG2細(xì)胞移植5日之后， 僅植入RG2細(xì)胞的7大鼠為對(duì)照組(·)而且其他大鼠分別以膜片(D)J1^Bdph-膜片 (▲)、10% Bdph-膜片(■)及3% BCNU-膜片(X)治療。圖9Α把該腫瘤大小表示成具有 標(biāo)準(zhǔn)偏差的平均值。圖9Β中的體重也表示成具有標(biāo)準(zhǔn)偏差的平均值。圖9C于GBM組織內(nèi) 進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色的分析(于該RG2細(xì)胞植入之后第30日)。該膜片組、3%Bdph-膜 片組、10% Bdph-膜片組及3% BCNU-膜片組的片段的代表性照片。GBM腫瘤(對(duì)于ki_67 的免疫組織化學(xué)染色)、半胱氨酸蛋白酶3及Nur77。把該Ki_67_、半胱氨酸蛋白酶3-或 Nur77-正性細(xì)胞染成褐色(400x)。圖IOA至IOD為顯示ρ (CPP-SA) -Bdph抑制異種皮移植人類GBM裸小鼠模型中的腫瘤生長(zhǎng)的圖形及一組照片。把DBTRG-05MG細(xì)胞(2X106)皮下植入裸Foxnl nu/nu小 鼠的后側(cè)腹區(qū)域內(nèi)。在DBTRG-05MG細(xì)胞移植5日之后，分別以膜片( )、3% Bdph-膜片 (■)及10% Bdph膜片(▲)治療小鼠。(A)把該腫瘤大小表示成具有標(biāo)準(zhǔn)偏差的平均 值。(B)體重也表示成具有標(biāo)準(zhǔn)偏差的平均值。(C)及(D)照片顯示以該膜片、3% Bdph-膜 片或10% Bdph-膜片治療裸小鼠體內(nèi)的腫瘤。P < 0. 01.圖11為顯示Bdph調(diào)降A(chǔ)xl蛋白表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡結(jié)果的一組照片。圖12顯示評(píng)估腫瘤細(xì)胞遷移及侵襲分析的孔杯系統(tǒng)。圖中BD細(xì)胞基質(zhì)為可降解 的基底膜，系由黏蛋白、膠原IV、硫酸肝素蛋白多醣、內(nèi)肌動(dòng)蛋白、巢蛋白組成。圖中薄膜的 孔徑為8 μ m。 圖13A及圖13B為顯示Bdph以劑量依賴的方式抑制腫瘤細(xì)胞遷移的一組照片及 圖形。其中圖13A中，1為Bdph濃度為0 μ L/mL時(shí)的遷移照片，2為Bdph濃度為25 μ L/mL 時(shí)的遷移照片，3為Bdph濃度為50 μ L/mL時(shí)的遷移照片，4為Bdph濃度為75 μ L/mL時(shí)的 遷移照片，5為Bdph濃度為100 μ L/mL時(shí)的遷移照片，6為Bdph濃度為150 μ L/mL時(shí)的遷 移照片。圖13B顯示了不同Bdph劑量下腫瘤細(xì)胞遷移率的變化。圖14為顯示Bdph以劑量相依的方式抑制腫瘤細(xì)胞侵襲的一組照片及圖形。其中 圖14A中，1為Bdph濃度為0 μ L/mL時(shí)的遷移照片，2為Bdph濃度為25 μ L/mL時(shí)的遷移照 片，3為Bdph濃度為50 μ L/mL時(shí)的遷移照片，4為Bdph濃度為75 μ L/mL時(shí)的遷移照片，5 為Bdph濃度為100 μ L/mL時(shí)的遷移照片，6為Bdph濃度為150 μ L/mL時(shí)的遷移照片。圖 14B顯示了不同Bdph劑量下腫瘤細(xì)胞遷移率的變化。圖15為顯示通過(guò)DBTRG腦瘤細(xì)胞內(nèi)的Axl表現(xiàn)逆轉(zhuǎn)Bdph抑制的腫瘤細(xì)胞增殖的圖形。圖16A至圖16B為顯示用于偵測(cè)細(xì)胞遷移及侵襲的OrisTM系統(tǒng)的一組照片及圖 形。其中圖16A中，1為施加遮蔽物(以黑色顯示)而且添加細(xì)胞至孔內(nèi)；2為培養(yǎng)以使細(xì) 胞能附著于孔的外部區(qū)域；3為移除堵塞器；4為培養(yǎng)以使細(xì)胞能遷移至該等孔的偵測(cè)帶 內(nèi)；5中，未遷移至該偵測(cè)帶內(nèi)的細(xì)胞受阻礙而看不到；6中，利用顯微鏡或盤式儀(plate reader)評(píng)定遷移。圖16B為細(xì)胞遷移及侵襲的OrisTM系統(tǒng)終點(diǎn)偵測(cè)的照片。圖17為顯示Bdph抑制的細(xì)胞遷移可能以劑量相依的方式被DBTRG腦瘤細(xì)胞內(nèi)的 Axl表現(xiàn)逆轉(zhuǎn)的一組照片及圖形。圖18為顯示Bdph抑制的細(xì)胞侵襲可能被DBTRG腦瘤細(xì)胞內(nèi)的Axl表現(xiàn)逆轉(zhuǎn)的一 組照片及圖形。
具體實(shí)施例方式不用進(jìn)一步闡明，相信上述說(shuō)明已經(jīng)能適當(dāng)完成本發(fā)明。因此，將下列實(shí)施例解釋 為僅為例示，而且不會(huì)以任何方式限制揭示內(nèi)容的其余部分。在此所引用的所有刊物在此 以引用方式將其全文并入本文。實(shí)施例1 聚合物的合成SA預(yù)聚物SA單體使用乙醇重結(jié)晶兩次。使2. 7g SA單體在60ml醋酸酐中于135至140°C 時(shí)在真空(10_4托耳)之下回流30分鐘。把未反應(yīng)的醋酸酐移除。使SA預(yù)聚物在真空之下于60°C時(shí)干燥而且接著溶于干燥甲苯中。將此溶液加至于體積比1 10的無(wú)水乙醚與 石油醚的1 1 ν/ν混合物而且使其靜置過(guò)夜而使該SA預(yù)聚物(10 1 ν/ν)沈淀出來(lái)。 等該乙醚及石油醚被移除之后，使該SA預(yù)聚物在真空之下干燥。CPP預(yù)聚物 使3g CPP單體以50ml醋酸酐于150°C時(shí)在真空(10_4托耳)之下回流30分鐘。 冷卻之后，過(guò)濾該反應(yīng)混合物。通過(guò)移除一些未反應(yīng)的醋酸酐而濃縮濾液而且使該CPP預(yù) 聚物于o°c下結(jié)晶化。移除剩余的未反應(yīng)的醋酸酐。以醚清洗該CPP預(yù)聚物而且在真空之 下干燥。將DMF及無(wú)水乙醚(DMF 無(wú)水乙醚=1 9)依序加至該CPP預(yù)聚物。經(jīng)過(guò)12 小時(shí)之后，移除DMF及乙醚而且再度使該CPP預(yù)聚物晶體在真空之下干燥。ρ (CPP-SA)共聚物把比例20 80的CPP預(yù)聚物及SA預(yù)聚物填入一玻璃試管(2 X 20cm)內(nèi)而且于 180°C下在一油浴內(nèi)加熱1分鐘。把壓力降至10_4mmHg。在整個(gè)聚合過(guò)程中每15分鐘消除 真空。以二氯甲烷清洗該試管而且接著添加石油醚以使P (CPP-SA)共聚物沉淀出來(lái)，以無(wú) 水乙醚清洗該共聚物而且在真空之下干燥。通過(guò)IR及1H NMR來(lái)定義該ρ (CPP-SA)共聚物的特征。參見(jiàn)圖1及2。在此IR光 譜研究中，于1812. 76cm"1下觀察到酸酐鍵的特征信號(hào)。在此1HNMR光譜研究中，于6. 9至 8. 2ppm下觀察到CPP的芳香族部分的特征信號(hào)而且于1. 3ppm下測(cè)得SA的亞甲基部分的 特征信號(hào)。再者，根據(jù)該1HNMR光譜研究中的CPP及SA的特征峰強(qiáng)度鑒別出該共聚物內(nèi)的 CPP及SA的比例為1 4至1 5。Bdph-p (CPP-SA)配方使ρ (CPP-SA)聚合物與Bdph混合以提供含有以重量計(jì)3 %或10 %的Bdph的混合 物。也制備成含有97% p(CPP-SA)及3% 1，3_雙(2-氯乙基)-1-亞硝基脲(BCNU)的混合 物。使該混合物以10% (w/v)的濃度溶于二氯甲烷中。使該溶液在真空之下干燥72小時(shí)。 如Walter 等人，Cancer Res. 1994，54 (8) :2207_12 ；Leong等人，J Biomed Mater Res. 1985， 19(8) :941-55 ；及 Storm 等人，J Neurooncol. 2002,56(3) :209_17 中所說(shuō)明的，利用不銹 鋼模(內(nèi)徑，13mm)在Carver Press的輕微壓力之下于200psi下壓縮由此所獲得的干燥粉 末以形成Bdph ρ (CPP-SA)圓盤(IOOmg/圓盤)。實(shí)施例2 釋放動(dòng)力學(xué)把Bdph-p (CPP-SA)圓盤置于具有1. Oml的0. IM磷酸鹽緩沖食鹽水(pH 7. 4)及
1.Oml正辛醇的閃爍瓶?jī)?nèi)而且于37°C下培養(yǎng)。利用新鮮緩沖液于各不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)替換該溶 液。如Weingart等人，Int. J. Cancer. 1995,62(5) :605_9中說(shuō)明的，利用一光譜儀測(cè)量于 310nm的波長(zhǎng)下的吸收度以測(cè)量Bdph于該緩沖液中的濃度。獲致Bdph持續(xù)釋放。參見(jiàn)圖2。實(shí)施例3 體內(nèi)控制釋放及細(xì)胞毒作用(Cytotoxic effect) 進(jìn)行分析以檢查ρ (CPP-SA)-10% Bdph對(duì)于惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤RG2的生長(zhǎng)抑制 作用。據(jù)發(fā)現(xiàn)該P(yáng)(CPP-SA)-10%Bdph的生長(zhǎng)抑制作用與對(duì)照組相比為50%。此外，在 ρ (CPP-SA)-10% Bdph的治療之后觀察經(jīng)逐漸改變及卸下的培養(yǎng)平板底部的GBM腫瘤細(xì)胞 的形態(tài)(圖4)。比起未反應(yīng)的細(xì)胞，大部分卸下的GBM細(xì)胞在經(jīng)過(guò)ρ (CPP-SA)-10% Bdph 治療之后凋亡(圖4B&C)。
注意數(shù)據(jù)系表示成平均值士SD或SE (分別為標(biāo)準(zhǔn)偏差及標(biāo)準(zhǔn)誤差)。經(jīng)由T檢驗(yàn) (Student' s t-test)及Mantel-Cox檢定來(lái)分析統(tǒng)計(jì)顯著性。利用Kaplan-Meier方法進(jìn) 行存活分析。將<0.05的P值視為顯著的。實(shí)施例4 凋亡涂徑及由D (CPP-SA) -Bdph所誘發(fā)的Nurr移位為了確認(rèn)以寡聚脫氧核苷酸為基礎(chǔ)的微陣列分析的結(jié)果，通過(guò)RT-PCR檢查經(jīng) Bdph治療的RG2細(xì)胞內(nèi)的孤兒受體(orphan儀(；印切『8川(《-1、恥1^1及恥『77的表現(xiàn)。禾Ij 用Bdph治療特定時(shí)期之后，于二 GBM細(xì)胞株內(nèi)以時(shí)間相依的方式誘發(fā)該Nurr77的Mrna表 現(xiàn)。從Bdph治療之后半小時(shí)至該治療之后6小時(shí)明顯誘發(fā)出Nurr77 mRNA表現(xiàn)(圖5)。 Nur77，其在Bdph治療之后被高度誘發(fā)出來(lái)，據(jù)發(fā)現(xiàn)與生長(zhǎng)抑制及細(xì)胞凋亡有牽連，暗示 Nur77誘發(fā)可能是GBM細(xì)胞內(nèi)Bdph-誘發(fā)凋亡的初期現(xiàn)象。為了檢查是否響應(yīng)Bdph而發(fā)生Nur77的移位，利用對(duì)應(yīng)的Nur77特有抗體進(jìn)行該 Nur77的免疫熒光檢查定位而且利用熒光顯微鏡來(lái)測(cè)量。結(jié)果顯示Nur77在細(xì)胞核內(nèi)比 在細(xì)胞液內(nèi)更多許多。經(jīng)過(guò)Bdph治療24小時(shí)之后，把Nur77從該細(xì)胞核移位至該細(xì)胞質(zhì) (圖6)。為了進(jìn)一步確認(rèn)，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析法(Western blot analysis)檢查細(xì)胞液 及細(xì)胞核部分。免疫印跡法(Immimoblotting)顯示Nur77主要位于欠缺Bdph治療的細(xì)胞 核內(nèi)(圖7)。最后，利用蛋白質(zhì)印跡分析法測(cè)定Bdph-誘發(fā)Nur77的基因表現(xiàn)所涉及的信號(hào)轉(zhuǎn) 導(dǎo)途徑。如圖8所示，經(jīng)過(guò)Bdph處理1小時(shí)之后JNK、AKT、ERK均被顯著磷酸化。再者，MTT 分析結(jié)果顯示RG2細(xì)胞在利用5至20nM的pJNK抑制劑預(yù)處理而且利用Bdph處理之后細(xì) 胞成活力提高了。實(shí)施例5 動(dòng)物研究從國(guó)家實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物中心(臺(tái)北，臺(tái)灣)獲得雄性F344大鼠(230至260g)及雄性 Foxnl nu/nu小鼠(10至12周)。所有程序遵守國(guó)立東華大學(xué)(花蓮，臺(tái)灣)的實(shí)驗(yàn)室動(dòng) 物中心及中國(guó)醫(yī)藥大學(xué)附設(shè)醫(yī)院(臺(tái)中，臺(tái)灣)的標(biāo)準(zhǔn)作業(yè)程序。于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中使用RG2 細(xì)胞(大鼠GBM)及DBTRG-05MG細(xì)胞(人類GBM)以監(jiān)視ρ (CPP-SA) -3%或10% Bdph配方 及ρ (CPP-SA) -3% BCNU的抗腫瘤活性。同基因F344大鼠(6只/組)接受1 X IO6個(gè)RG2細(xì)胞的皮下背部植入體 (subcutaneous back implants)。通過(guò)皮下植入體利用 ρ (CPP-SA)-3%、ρ (CPP-SA)-10% Bdph配方、p(CPP-SA)-3% BCNU或在該腫瘤細(xì)胞植入之后從原始注入部位移除的至少 1. 5cm之單獨(dú)聚合物的治療各組內(nèi)的動(dòng)物。此外，F(xiàn)oxnl nu/nu小鼠(5至6只/組)接受1 X IO6個(gè)DBTRG-05MG細(xì)胞的皮下 植入，ρ (CPP-SA)-3%,ρ (CPP-SA)-10% Bdph 配方、ρ (CPP-SA)-3% BCNU 或在該腫瘤細(xì)胞植 入之后從原始注入部位移除的至少1. 5cm之單獨(dú)聚合物的皮下植入。利用測(cè)徑器測(cè)量腫瘤大小而且將體積計(jì)算為L(zhǎng)XHXWX0. 5236。當(dāng)腫瘤的體積在 大鼠體內(nèi)超過(guò)25cm3而且在小鼠體內(nèi)超過(guò)IOOOmm3時(shí)則將動(dòng)物放棄。利用該日期來(lái)計(jì)算大 鼠及小鼠的最終存活日期。實(shí)施例6 :p (CPP-SA) -Bdph在動(dòng)物模型內(nèi)的治療效果
F344大鼠及免疫缺陷裸小鼠接受5 X 104個(gè)RG2細(xì)胞而且利用ρ (CPP-SA) _3 % Bdph、ρ (CPP-SA)-10% Bdph、單獨(dú) ρ (CPP-SA)或 ρ (CPP-SA) -3 % BCNU 做皮下治療。與該ρ (CPP-SA) -3 % Bdph 治療組、P (CPP-SA)-3% BCNU 治療組及 ρ (CPP-SA)治療組(圖 9Α，ρ
<0. 005)相比時(shí)，該ρ (CPP-SA)-10% Bdph治療組觀察到顯著的抑制效果。該RG2組第30日時(shí)的平均腫瘤大小為2070. 79 士 784. 90mm3,該ρ (CPP-SA)治 療組為 1586. 30 士 243. 69mm3,該 ρ (CPP-SA)-3 % Bdph 治療組為 346. 71 士 521. 68mm3,該 ρ (CPP-SA)-10% Bdph 治療組為 87. 89 士 167. 44mm3,以及該 ρ (CPP-SA)-3 % BCNU 治療組為 357. 48 士 27. 30mm3。ki-67的免疫組織化學(xué)染色(immunoshitochemical stain)，其指示細(xì)胞增殖，顯 示該ρ (CPP-SA)-10% Bdph治療組明顯減少。此外，該硫胱氨酸蛋白酶(caspase)的免疫組 織化學(xué)染色，其指示凋亡，顯示該P(yáng)(CPP-SA)-10% Bdph治療組明顯減少。最后，在該ρ (CPP-SA)-10% Bdph治療組的動(dòng)物體內(nèi)，通過(guò)體重及各個(gè)不同器官的 組織分析來(lái)評(píng)估時(shí)，沒(méi)有觀察到與藥物有關(guān)的毒性，但是在該P(yáng) (CPP-SA) -3% BCNU治療組 中觀察到顯著體重喪失(圖9B)。t施例7 (CPP-SA)-BdDh在異種皮移棺腫瘤牛長(zhǎng)方面的治療效果給裸小鼠注入人類DBTRG-05MG細(xì)胞而且在第5日植入ρ (CPP-SA)-Bdph (0%、3% 及10%)。在該3%及10% Bdph-膜片治療組中觀察到腫瘤生長(zhǎng)的明顯抑制(圖10)。對(duì) 照組在第39日時(shí)的腫瘤大小平均值為1098. 46 士 170. 11mm3，該ρ (CPP-SA)-3 % Bdph治療 組為 605. 8士98. 8mm3 而且該 P(CPP-SA)-IO % Bdph 治療組為 504. 4士38. 9mm3(圖 IOC ；ρ
<0. 05)。實(shí)施例8 =Bdph抑制人類多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的遷移及侵襲利用 BioCoat 細(xì)胞基質(zhì)侵襲艙(matrigel invasion chamber)系統(tǒng) (BDBioscience, Bedford, ΜΑ)檢查DBTRG-05MG細(xì)胞株的侵襲力。BD細(xì)胞基質(zhì)本體是由在 含有8μπι細(xì)孔的聚對(duì)苯二甲酸乙二酯(PET)膜上層黏蛋白(Iaminin)、膠原IV、巢蛋白/ 內(nèi)肌動(dòng)蛋白(nidogen/entaction)及蛋白多醣(proteoglycan)組成的。參見(jiàn)圖12及16。 在體內(nèi)遷移分析中，在Falcon培養(yǎng)杯(culture insert) (BD Bioscience)上的應(yīng)用低細(xì) 孔密度PET徑跡蝕刻膜(track-etched membranes)。將該膜置于細(xì)胞基質(zhì)艙(Matrigel chamber)或Falcon培養(yǎng)杯的上方孔與下方孔之間。首先使該等細(xì)胞再懸浮于含有10%胎 牛血清的PRMI 1640內(nèi)而且播種于該艙的上方孔內(nèi)(每孔50，000個(gè)細(xì)胞)。于37°C下培 養(yǎng)24小時(shí)之后，利用Liu著色劑(Handsel科技股份有限公司，臺(tái)北，臺(tái)灣)將透過(guò)該膜侵 入或遷移的細(xì)胞染色而且在顯微鏡之下計(jì)數(shù)。各實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行三次。用上述系統(tǒng)檢查Bdph對(duì)于人類多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的遷移及侵襲的影響。據(jù)發(fā) 現(xiàn)Bdph以劑量相依的方式抑制人類多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的遷移及侵襲。參見(jiàn)圖12至14。實(shí)施例9 =Bdph經(jīng)由阻遏Axl而抑制腫瘤遷移及侵襲利用反轉(zhuǎn)錄酶(reverse transcriptase)-聚合酶連鎖反應(yīng)(RT-PCR)檢查Bdph對(duì) 于GBM細(xì)胞株內(nèi)的基因表現(xiàn)圖譜的影響以闡釋Bdph對(duì)惡性腦瘤起作用的可能機(jī)制。據(jù)發(fā) 現(xiàn)該Axl受體酪氨酸激酶(RTK)的mRNA表現(xiàn)在Bdph存在的情況之下調(diào)降。再者，經(jīng)由將 pcDNA3. O-Axl質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至該GBM細(xì)胞株內(nèi)所引起的Axl過(guò)度表達(dá)可能逆轉(zhuǎn)Bdph對(duì)于Axl 介導(dǎo)的增殖、遷移及侵襲的抑制效果。另外進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析法以檢查在Bdph存在的情況之下該等GBM細(xì)胞的Axl 蛋白含量。結(jié)果(圖11)顯示該Axl蛋白含量降低了。另外參見(jiàn)圖15及17。
現(xiàn)在已能接受蛋白酪氨酸激酶在細(xì)胞增殖及分化的調(diào)節(jié)中以及在包括人類神經(jīng) 膠質(zhì)瘤的許多瘤形成的發(fā)端中扮演重要的角色。除此之外，據(jù)記載腫瘤遷移及侵襲中涉及 Axl。上述結(jié)果暗示Bdph阻遏Axl受體酪氨酸激酶的蛋白表現(xiàn)而且藉以抑制該GBM細(xì)胞株 的遷移及侵襲能力。
本說(shuō)明中所揭示的所有特征可以任何組合合并。用于相同、等效或相似目的的選 擇性特征均可替代此說(shuō)明書(shū)中所揭示的各特征。因此，除非另行明確說(shuō)明，否則所揭示的各 特征僅為等效或相似特征的基因系列的實(shí)例。從上述說(shuō)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可輕易確定本發(fā)明的基本特征，而且不會(huì)悖離其精 神及范圍，可進(jìn)行本發(fā)明的各種不同改變及修飾使其適于各種不同用法及條件。因此，其他 具體實(shí)施例也在下列申請(qǐng)專利范圍的范圍以內(nèi)。
權(quán)利要求
1. 一種醫(yī)藥配方，其包含正丁烯基苯酞；及多元酸酐，其系由雙(對(duì)羧基苯氧基)丙 烷、雙(對(duì)羧基苯氧基)丁烷、雙(對(duì)羧基苯氧基)戊烷、雙(對(duì)羧基苯氧基)庚烷、雙(對(duì) 羧基苯氧基)己烷、雙(對(duì)羧基苯氧基)辛烷、間苯二甲酸、1，4_苯二丙酸、十二烷二酸、草 酸、丙二酸、丁二酸、戊二酸、己二酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、癸二酸、鄰苯二甲酸、間苯二 甲酸、對(duì)苯二甲酸或其混合物制備而成；其中該正丁烯基苯酞系與該多元酸酐混合。
2.如權(quán)利要求1所述的醫(yī)藥配方，其中該多元酸酐系由雙(對(duì)羧基苯氧基)丙烷、雙 (對(duì)羧基苯氧基)己烷、間苯二甲酸、1，4-苯二丙酸、十二烷二酸、癸二酸或其混合物制備而 成。
3.如權(quán)利要求2所述的醫(yī)藥配方，其中該多元酸酐系由雙(對(duì)羧基苯氧基)丙烷及癸 二酸的混合物制備而成。
4.如權(quán)利要求3所述的醫(yī)藥配方，其中該雙(對(duì)羧基苯氧基)丙烷與該癸二酸之間的 比例為1 2至1 10。
5.如權(quán)利要求4所述的醫(yī)藥配方，其中該雙(對(duì)羧基苯氧基)丙烷與該癸二酸之間的 比例為約1 4至1 5。
6.如權(quán)利要求1或5所述的醫(yī)藥配方，其中該正丁烯基苯酞的重量百分比為該配方的 3%至 20%。
7.如權(quán)利要求6所述的醫(yī)藥配方，其中該正丁烯基苯酞的重量百分比為該配方的約 10%。
8.如權(quán)利要求7所述的醫(yī)藥配方，其中該配方系呈粉末、膜片、薄片、棒、微球、納米球、 糊或膠的形態(tài)。
9.一種醫(yī)藥配方的用途，該醫(yī)藥配方系用于制造治療病患體內(nèi)的腫瘤用的藥劑，其中 該藥劑依該治療所需包含有效量的該醫(yī)藥配方，該醫(yī)藥配方含有(1)正丁烯基苯酞及(2) 多元酸酐，其系由癸二酸、雙(對(duì)羧基苯氧基)丙烷、雙(對(duì)羧基苯氧基)己烷、間苯二甲 酸、1，4-苯二丙酸、十二烷二酸或其混合物制備而成，其中該正丁烯基苯酞系與該多元酸酐混合。
10.如權(quán)利要求9所述的用途，其中該腫瘤為多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(glioblastoma multiforme)、肺癌、肝細(xì)胞癌、結(jié)腸癌、黑色素瘤、乳腺癌、神經(jīng)胚細(xì)胞瘤、畸胎瘤或人類白 血病。
11.如權(quán)利要求9所述的用途，其中該多元酸酐系由雙(對(duì)羧基苯氧基)丙烷、雙(對(duì) 羧基苯氧基)己烷、間苯二甲酸、1，4_苯二丙酸、十二烷二酸、癸二酸或其混合物制備而成。
12.如權(quán)利要求11所述的用途，其中該多元酸酐系由雙(對(duì)羧基苯氧基)丙烷及癸二 酸的混合物制備而成。
13.如權(quán)利要求9所述的用途，其中該雙(對(duì)羧基苯氧基)丙烷與該癸二酸之間的比例 為 1 2 至 1 10。
14.如權(quán)利要求13所述的用途，其中該雙(對(duì)羧基苯氧基)丙烷與該癸二酸之間的比 例為1 4至1 5。
15.如權(quán)利要求第9所述的用途，其中該正丁烯基苯酞的重量百分比為該配方的3%至 20%。
16.如權(quán)利要求15所述的用途，其中該正丁烯基苯酞的重量百分比為該配方的10%。
17.如權(quán)利要求9所述的用途，其中該癌癥為多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤。
18.如權(quán)利要求9或17所述的用途，其中該藥劑適于皮下植入、組織間植入或顱內(nèi)植入 該病患體內(nèi)。
全文摘要
本發(fā)明系有關(guān)一種醫(yī)藥配方，其含有正丁烯基苯酞及多元酸酐。本發(fā)明也揭示此配方用于治療腫瘤的用途。
文檔編號(hào)A61P35/02GK102000065SQ201010138618
公開(kāi)日2011年4月6日 申請(qǐng)日期2010年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月28日
發(fā)明者林欣榮, 邱紫文, 韓鴻志 申請(qǐng)人:國(guó)立東華大學(xué)