本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種多動(dòng)癥標(biāo)記物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

兒童多動(dòng)癥又稱注意力缺陷多動(dòng)癥(ADHD)，是一種常見的兒童行為異常疾病。據(jù)國外報(bào)道多動(dòng)癥的患病率在5％～10％之間，國內(nèi)調(diào)查在10％以上。這類患兒的智力正?；蚧菊?但學(xué)習(xí)、行為及情緒方面有缺陷，主要表現(xiàn)為注意力不集中，注意短暫，活動(dòng)過多，情緒易沖動(dòng)，學(xué)習(xí)成績普遍較差，如不能得到及時(shí)治療，部分患兒成年后仍有癥狀，明顯影響患者學(xué)業(yè)、身心健康以及成年后的家庭生活和社交能力。

藥物能改善注意缺陷，降低活動(dòng)水平，在一定程度上提高學(xué)習(xí)成績，短期內(nèi)改善患者與家庭成員的關(guān)系。目前臨床上普遍使用的哌甲酯有助于改善注意力，高劑量能夠改善多動(dòng)、沖動(dòng)癥狀，減少行為問題。但其副作用如食欲下降、失眠、頭痛、煩躁和易怒等癥狀明顯。被列為ADHD的一線治療藥物托莫西汀不良反應(yīng)少，起效時(shí)間緩慢，不適用于治療急性ADHD患者。因此，探索新的治療藥物和藥物靶點(diǎn)極為重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術(shù)的至少一個(gè)不足，提供一種新的兒童多動(dòng)癥的生物標(biāo)記物以及治療兒童多動(dòng)癥的藥物。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供一種多動(dòng)癥標(biāo)記物，所述標(biāo)記物為ghrelin。所述人體內(nèi)ghrelin(胃饑餓素)是一種胃腸道分泌生成的、由28個(gè)氨基酸組成的內(nèi)源性腦腸肽，具有包括刺激食欲在內(nèi)的多種生理功能。

進(jìn)一步，可以通過采集人體外周血/腦脊液，檢測其中標(biāo)記物ghrelin的表達(dá)量，來篩選潛在的多動(dòng)癥患者。檢測到ghrelin的表達(dá)量減少，可以相應(yīng)篩選潛在的多動(dòng)癥患者。

本發(fā)明還提供一種上述的多動(dòng)癥標(biāo)記物在制備檢測多動(dòng)癥的試劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供一種上述的多動(dòng)癥標(biāo)記物的受體GHSR-1a在制備治療多動(dòng)癥藥物中的應(yīng)用，所述ghrelin受體作為治療多動(dòng)癥的藥物靶點(diǎn)。

本發(fā)明還提供一種上述的多動(dòng)癥標(biāo)記物的受體激動(dòng)劑在制備治療多動(dòng)癥藥物中的作用。本發(fā)明中的ghrelin受體激動(dòng)劑包括：alexamorelin,anamorelin,anamorelin fumarate,anamorelin hydrochloride,mesylate,ibutamoren mesylate,GHRP，ghrelin，?；痝hrelin等。

進(jìn)一步，所述受體激動(dòng)劑為甲磺酸(mesylate)。

本發(fā)明還提供一種檢測多動(dòng)癥的試劑盒，所述試劑盒中含有檢測人體外周血或腦脊液中g(shù)hrelin的含量的試劑。通過檢測個(gè)體中g(shù)hrelin表達(dá)量的減少，即可檢測是否為潛在的多動(dòng)癥患者。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明提供了一種新的多動(dòng)癥標(biāo)記物及治療多動(dòng)癥的藥物靶點(diǎn)及藥物，所述標(biāo)記物可以通過檢測外周血/腦脊液即可篩選潛在的多動(dòng)癥患者。而本發(fā)明提供的新的治療多動(dòng)癥的藥物給多動(dòng)癥患者提供了新的治療的可能和希望。

為讓本發(fā)明的上述和其它目的、特征和優(yōu)點(diǎn)能更明顯易懂，下文特舉較佳實(shí)施例，并配合附圖，作詳細(xì)說明如下。

附圖說明

圖1A為實(shí)施例1中TALEN的結(jié)合位點(diǎn)。

圖1B為實(shí)施例1中斑馬魚基因型的鑒定。

圖1C為PCR產(chǎn)物測序結(jié)果。

圖2A為成年雄性斑馬魚的運(yùn)動(dòng)距離的比較。

圖2B為幼魚運(yùn)動(dòng)距離的比較。

圖3A為光刺激下成年斑馬魚的運(yùn)動(dòng)圖。

圖3B為光刺激下成年斑馬魚活性的比較。

圖4為運(yùn)用不同濃度的YIL781處理野生型幼魚的結(jié)果。

圖5為采用mesylate處理ghrelin突變斑馬魚的對比圖。

圖6為哌甲酯處理ghrelin突變的斑馬魚后的結(jié)果。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

斑馬魚ghrelin突變體的鑒定。

(1)采用TALEN制造突變體

人工制造斑馬魚ghrelin突變體，其編碼ghrelin的核苷酸序列為SEQ NO.2所示。圖1A為本實(shí)施例中TALEN的結(jié)合位點(diǎn)。

野生斑馬魚編碼ghrelin的核苷酸序列SEQ NO.1，所述基因突變體的核苷酸序列如SEQ NO.2所示。與SEQ NO.1相比，所述ghrelin基因突變體為缺失9個(gè)核苷酸(TGTGTCTCG)，經(jīng)測序鑒定其產(chǎn)生了一個(gè)終止密碼，僅能編碼MPLRCRASSMFLLLCVSLS*，而不能合成完整的ghrelin前體多肽。含有該基因突變體的個(gè)體，其ghrelin前體多肽的表達(dá)量會下降。而研究表明，含有該基因突變體的個(gè)體會表現(xiàn)出多動(dòng)癥癥狀，因此該基因突變體及ghrelin前體多肽的表達(dá)量均可作為多動(dòng)癥的標(biāo)記物。

而且由于缺失破壞了Xho1酶切位點(diǎn)，因此突變的序列不能被Xho1酶切。

(2)基因型鑒定

設(shè)計(jì)一對引物，序列為primer F：AGACC TACTG AGGCA GCCTC ATCA，Primer R：CCGAT CGTCT TCTTT GATCA CTGG。模板基因組由上海捷瑞生物提供的基因組抽提試劑盒制備。PCR所有試劑由青島takara公司生產(chǎn)。按照下列反應(yīng)體系加樣：

Ghrelin PCR體系

PCR產(chǎn)物經(jīng)跑膠確定擴(kuò)增效果，PCR擴(kuò)增后的部分產(chǎn)物送南京金斯瑞生物公司測序鑒定。部分PCR產(chǎn)物用Xho1(賽默飛)進(jìn)一步酶切鑒定。其反應(yīng)體系按照下表配置：

圖1B為實(shí)施例1中斑馬魚基因型的鑒定。圖1C為PCR產(chǎn)物測序結(jié)果。如圖1B所示，PCR產(chǎn)物經(jīng)過Xho1酶切，在1.5％瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果。圖1C的PCR產(chǎn)物測序結(jié)果中，Ghrelin突變體在2號外顯子上有9個(gè)核苷酸的缺失(TGTGTCTCG)，生成了一個(gè)新的終止密碼TAG。

實(shí)施例2

斑馬魚行為的追蹤。

(1)為了檢測ghrelin突變體是否存在多動(dòng)癥類似的表型，3-8月齡成年斑馬魚(對照組)與ghrelin突變體分別放置在單獨(dú)的魚缸中，(Ghrelin+/-自交產(chǎn)生的后代中產(chǎn)生的ghrelin+/+(AB或者Control)，ghrelin-/-(ghrelin突變體)分別自交后產(chǎn)生的3-8月齡成年斑馬魚放置在單獨(dú)的魚缸中，運(yùn)用viewpoint行為記錄儀追蹤斑馬魚的活力，測定總時(shí)長為10分鐘，縱坐標(biāo)為總的運(yùn)動(dòng)距離，圖2A。

運(yùn)用viewpoint行為記錄儀追蹤斑馬魚的活力。行為記錄儀上的參數(shù)設(shè)置按下表進(jìn)行：

成魚行為記錄參數(shù)

圖2A是成年雄性斑馬魚ghrelin突變體與對照組的對比圖。如圖2A所示，成年雄性斑馬魚的運(yùn)動(dòng)距離比對照組成魚的顯著增加。ghrelin突變體表現(xiàn)出ADHD樣的多動(dòng)表型。

(2)3dpf(day post fertilization)的斑馬魚胚胎由親本雜合子ghrelin+/-(heterozygous)自交獲取。挑單個(gè)出殼的3dpf幼魚至96孔板中，行為測定按下表進(jìn)行。測試完，通過PCR，酶切確定單尾幼魚的基因型。

幼魚行為記錄參數(shù)

圖2B是斑馬魚幼魚中g(shù)hrelin突變體、雜合子與對照組的對比圖。如圖2B所示，ghrelin突變體幼魚運(yùn)動(dòng)距離Ghrelin突變的幼魚的活力比對照斑馬魚活力增加了1倍，而ghrelin雜合子與對照組沒有顯著差異。

實(shí)施例3

光刺激下，斑馬魚行為學(xué)的追蹤。

3-8月齡成年斑馬魚放置在單獨(dú)的魚缸中，運(yùn)用viewpoint行為記錄儀追蹤斑馬魚的活力。行為記錄儀上的參數(shù)設(shè)置按實(shí)施例1中進(jìn)行，光刺激的強(qiáng)度和時(shí)間設(shè)置按下表進(jìn)行：

幼魚行為記錄參數(shù)

圖3A為光刺激下成年斑馬魚的運(yùn)動(dòng)圖。圖3B為光刺激下成年斑馬魚活性的比較。如圖3A和圖3B所示，光刺激下成年斑馬魚運(yùn)動(dòng)增加。而光刺激下ghrelin突變體相對于對照組運(yùn)動(dòng)距離顯著增多。

實(shí)施例4

ghrelin受體GHSR-1a的拮抗劑可以誘導(dǎo)斑馬魚活力增強(qiáng)。

AB親本產(chǎn)下的胚胎在6hpf時(shí)處理不同濃度的YIL781(0.08uM,0.4uM,2uM,10uM,50uM)至3dpf，運(yùn)用viewpoint行為追蹤儀測定幼魚的行為，具體方案如下：

幼魚行為記錄參數(shù)

圖4運(yùn)用不同濃度的YIL781處理野生型幼魚的結(jié)果。結(jié)果表明50uM的YIL781競爭性抑制內(nèi)源性ghrelin的功能，誘導(dǎo)正常的斑馬魚產(chǎn)生多動(dòng)樣的表型。濃度在2uM之前，運(yùn)動(dòng)距離的趨勢有所下降，但跟對照組相比沒有顯著差異。

實(shí)施例5

ghrelin受體GHSR-1a的激動(dòng)劑可以挽救ghrelin突變體多動(dòng)癥表型。

由ghrelin+/+,ghrelin-/-親本自交產(chǎn)生的胚胎在6hpf時(shí)處理10uMMesylate。挑單個(gè)出殼的3dpf幼魚至96孔板中，行為測定按下表進(jìn)行。測試完，通過PCR，酶切確定單尾幼魚的基因型。

幼魚行為記錄參數(shù)

圖5是采用mesylate處理ghrelin突變斑馬魚的對比圖。

從圖5可以看出，在ghrelin-/-胚胎發(fā)育到6hpf時(shí)處理10uM mesylate，3dpf時(shí)用行為記錄儀測定游泳的距離，經(jīng)過mesylate處理后的ghrelin突變斑馬魚，其運(yùn)動(dòng)距離減少，且與對照組斑馬魚沒有顯著差異，即多動(dòng)癥癥狀得以挽救。

本發(fā)明構(gòu)建了ghrelin突變的斑馬魚，檢測發(fā)現(xiàn)成年斑馬魚及幼魚均表現(xiàn)出過度活躍的癥狀，此表型可以被ghrelin受體GHSR-1a的激動(dòng)劑挽救。同時(shí)，GHSR-1a的阻斷劑可以誘導(dǎo)類似于ghrelin突變體過度活躍的癥狀。

實(shí)施例6

哌甲酯(methyphenadate)可以用于治療ghrelin突變導(dǎo)致的多動(dòng)癥樣表型。

由ghrelin+/+,ghrelin-/-親本自交產(chǎn)生的胚胎在72hpf時(shí)處理哌甲酯一個(gè)小時(shí)。挑單個(gè)出殼的幼魚至96孔板中，行為測定按下表進(jìn)行。測試完，通過PCR，酶切確定單尾幼魚的基因型。

幼魚行為記錄參數(shù)

圖6是哌甲酯處理ghrelin突變的斑馬魚后的結(jié)果。

ghrelin-/-胚胎發(fā)育到3dpf時(shí)處理10uM哌甲酯1h，后用行為記錄儀測定游泳的距離。

從圖6可以看出，經(jīng)過哌甲酯處理后的ghrelin突變的斑馬魚相對于未處理的ghrelin突變的斑馬魚，其游泳距離大大減少。因此治療人類多動(dòng)癥的藥物哌甲酯對ghrelin突變的斑馬魚具有治療效果。

實(shí)施例8

人體樣本中總的ghrelin以及?；痝hrelin的ELISA檢測。

一：實(shí)驗(yàn)步驟

鋪板

將抗體(50％甘油混勻，-20℃保)按照1：4000稀釋于1×PBS中，在96孔ELISA板中每孔加入100μL并密封置于4℃冰箱中過夜。

目的(標(biāo)準(zhǔn))蛋白孵育

第二天取出ELISA板，倒出底物液并在紙巾上倒扣拍干，每孔加入200μL PBST泡洗3次，其中最后一次需泡30min，30分鐘后倒出拍干。

在各孔中加入各人血漿100μL(可按需用1×PBS稀釋)，3次重復(fù)，密封置于37℃恒溫培養(yǎng)箱孵育2h。

一抗孵育

血漿孵育2小時(shí)后倒出孔內(nèi)液體，PBST洗三次(無需長時(shí)間泡洗)并拍干。各孔按照1：4000稀釋比例(稀釋于PBST中)加入兔抗Ghrelin多克隆抗體(biotin)100μL。密封置于37℃恒溫培養(yǎng)箱孵育1h。

二抗孵育

一抗孵育1小時(shí)后倒出孔內(nèi)液體，PBST洗三次(無需長時(shí)間泡洗)并拍干。各孔按照1：8000稀釋比例(稀釋于PBST中)加入100μL。密封置于37℃恒溫培養(yǎng)箱孵育1h。

HRP顯色

待二抗孵育1小時(shí)后倒出孔內(nèi)液體，PBST洗三次(無需長時(shí)間泡洗)并拍干。每孔加入100μL TMB單組份顯色液(避光儲存在4℃，倒出適量的單組份TMB顯色液，待達(dá)到室溫后即可使用)，在室溫或37℃下避光孵育10-30min或更長時(shí)間，待顯色至預(yù)期深淺時(shí)加入100μL 1M鹽酸或硫酸溶液終止反應(yīng)，孔中反映液由藍(lán)色變?yōu)辄S色。

終止反應(yīng)后30min內(nèi)在450nm處測定吸光值。

保存并導(dǎo)出數(shù)據(jù)，用散點(diǎn)圖制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線公式后，計(jì)算ghrelin或?；痝hrelin的含量。

以上所述是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)鄰域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 溫州康寧醫(yī)院股份有限公司

<120> 多動(dòng)癥標(biāo)記物及其應(yīng)用和試劑盒

<130> 2017

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 472

<212> DNA

<213> 斑馬魚(Barchydanio rerio var)

<400> 1

atgcctctga ggtgccgtgc cagcagcatg tttctgctcc tgtgtgtttc tctttccttg 60

tgtctcgagt ctgtgagcgg tggcaccagc ttcctcagtc cgactcagaa accgcagggt 120

cgaaggccac caagagtggg cagaagagaa gctgctgatc cagagatacc agtgatcaaa 180

gaagacgatc ggtttatgat gagcgctcca tttgaactgt ccatgtctct gagcgaagct 240

gaatatgaga aatatggtcc cgtgcttcag aatcttctgg aggatcttct tagagactct 300

tctttcgagt tctgacaaga gtcctacaaa gttcctcctt ataagcaatt gacaatattc 360

acaatttatt aatgatgtca tttatgggtt taacaaataa agaatgataa taaattattc 420

tctattctat gttctttatt ctgtagcaaa gtgggtgcat tgttacattg tt 472

<210> 2

<211> 463

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgcctctga ggtgccgtgc cagcagcatg tttctgctcc tgtgtgtttc tctttcctag 60

tctgtgagcg gtggcaccag cttcctcagt ccgactcaga aaccgcaggg tcgaaggcca 120

ccaagagtgg gcagaagaga agctgctgat ccagagatac cagtgatcaa agaagacgat 180

cggtttatga tgagcgctcc atttgaactg tccatgtctc tgagcgaagc tgaatatgag 240

aaatatggtc ccgtgcttca gaatcttctg gaggatcttc ttagagactc ttctttcgag 300

ttctgacaag agtcctacaa agttcctcct tataagcaat tgacaatatt cacaatttat 360

taatgatgtc atttatgggt ttaacaaata aagaatgata ataaattatt ctctattcta 420

tgttctttat tctgtagcaa agtgggtgca ttgttacatt gtt 463