本發(fā)明涉及腫瘤的免疫治療領(lǐng)域，尤其涉及一種基于腫瘤抗原ECM1的長肽ERE1及其在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用，特別涉及通過腫瘤肽疫苗特異性誘導(dǎo)、刺激活化生物體腫瘤特異性T淋巴細(xì)胞，激發(fā)、增強(qiáng)生物體抗腫瘤免疫功能及其在特異性抗腫瘤免疫治療中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

腫瘤發(fā)病率、死亡率呈逐年上升趨勢，目前癌癥已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅人類健康的頭號(hào)殺手。盡管腫瘤的手術(shù)治療、化療、放射治療及分子靶向治療不斷取得進(jìn)展，但腫瘤的有效治療仍是亟待解決的關(guān)鍵問題。近年來，隨著人們對(duì)腫瘤的分子機(jī)理和免疫機(jī)制的不斷揭示，腫瘤特異的免疫治療日益受到重視，而獲得理想腫瘤抗原是腫瘤免疫治療的關(guān)鍵。隨著免疫學(xué)理論方法和分子生物學(xué)方法的飛速發(fā)展，大量可以誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答的腫瘤抗原的發(fā)現(xiàn)，為腫瘤免疫治療開辟了新紀(jì)元。

細(xì)胞外基質(zhì)蛋白-1（ECM1）是1994年Mathieu等從鼠的成骨基質(zhì)細(xì)胞株MN7中分離出來的一種分泌型糖蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量為85KD。ECM1蛋白質(zhì)參與多種生物學(xué)過程，包括細(xì)胞增殖，血管生成，胚胎軟骨的形成，皮膚分化等。近年來研究表明，ECM1在乳腺癌、甲狀腺癌、喉癌、肝癌、膽管癌、胃癌、結(jié)直腸癌、肺癌等多種上皮樣惡性腫瘤中高表達(dá)，因此，ECM1可作為腫瘤相關(guān)抗原成為腫瘤免疫治療靶點(diǎn)。

近年來，隨著對(duì)免疫應(yīng)答分子機(jī)制研究的深入，現(xiàn)已逐漸認(rèn)識(shí)到機(jī)體的免疫細(xì)胞并不是對(duì)應(yīng)于各種各樣的病原體或天然抗原的整體分子，而是針對(duì)各種各樣抗原分子的抗原表位，即蛋白質(zhì)抗原是通過其表位來體現(xiàn)其免疫特異性。研究表明，CD8+ T細(xì)胞所識(shí)別的腫瘤抗原需先經(jīng)抗原提呈細(xì)胞處理，之后以“抗原肽-MHC-I類分子”復(fù)合物的形式呈現(xiàn)在抗原提呈細(xì)胞或靶細(xì)胞表面，相應(yīng)的與MHC-I類分子結(jié)合的抗原肽即為CTL表位。腫瘤抗原來源的CTL表位肽能夠激活誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL細(xì)胞），可對(duì)人類白細(xì)胞抗原（HLA）配型匹配的腫瘤產(chǎn)生殺傷作用。中國人群中MHC-I類最常見的亞型型為HLA-A2。因此，篩選HLA-A2限定性CTL表位，實(shí)現(xiàn)靶向腫瘤抗原的免疫治療也成為目前腫瘤免疫治療的熱點(diǎn)。

由于單獨(dú)腫瘤抗原CTL表位肽分子量小，不穩(wěn)定，在體內(nèi)迅速被水解，其免疫效能有限，因此提升CTL表位肽的免疫活性是目前亟待解決的問題。研究表明，通過氨基酸替換修飾可增強(qiáng) CTL 表位誘導(dǎo)的靶向抗腫瘤效應(yīng)。例如，利用氨基酸替換修飾 HLA-A2限制性腫瘤抗原 Ran 表位的氨基酸序列可提升其免疫活性，同樣利用氨基酸替換修飾腫瘤抗原POTE來源 HLA-A2限制性CTL表位也獲得了免疫活性提升的修飾性表位。另有研究表明，延長表位的氨基酸序列長度也是提升表位活性的有效途徑，例如腫瘤抗原CDCA1、KIF20A來源的多表位長肽均顯著提升單獨(dú)CTL表位活性。長肽一般是由大于20個(gè)氨基酸的肽段組成，較CTL表位肽(9-10個(gè)氨基酸)長，所以長肽進(jìn)入體內(nèi)后必須經(jīng)活化的專職APC加工提呈使T細(xì)胞有效活化，而不能像表位肽那樣可直接結(jié)合在表達(dá)MHC分子的細(xì)胞上，這樣可以減少免疫耐受的發(fā)生。長肽片段中存在多個(gè)表位，可更有效的產(chǎn)生特異、持久的細(xì)胞免疫應(yīng)答。由于長肽具有CTL表位肽無法比擬的優(yōu)勢，將有可能取代CTL表位用于腫瘤患者的免疫治療。因此，研發(fā)高效、低度的腫瘤抗原來源的長肽，用于腫瘤免疫靶向治療成為目前研究熱點(diǎn)之一。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述問題，本發(fā)明目的在于提供一種基于腫瘤抗原ECM1的長肽ERE1,具體為HLA-A2限制性免疫靶向ECM1的長肽ERE1，其特征是可誘導(dǎo)ECM1特異性CTL細(xì)胞，發(fā)揮HLA-A2限制性腫瘤殺傷作用。本發(fā)明提供的HLA-A2限制性免疫靶向ECM1的長肽ERE1可用于研制靶向抗原ECM1的治療性肽疫苗，為上皮樣惡性腫瘤精準(zhǔn)免疫治療提供理論基礎(chǔ)。

本發(fā)明提供的HLA-A2限制性免疫靶向ECM1的長肽ERE1，可誘導(dǎo)產(chǎn)生ECM1特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，發(fā)揮HLA-A2限制性腫瘤殺傷作用，其氨基酸序列為。

Tyr-Leu-Thr-Ile-Asp-Ile-Ser-Arg-Val-Arg-Arg-Tyr-Leu-Thr-Ile-Asp -Ile-Ser-Arg-Val。

所述的HLA-A2限制性免疫靶向ECM1的長肽，為通過添加，缺失或替換一個(gè)或多個(gè)氨基酸而衍生自ERE1的氨基酸序列組成的突變肽。

所述的HLA-A2限制性免疫靶向ECM1的長肽，為具有ERE1或其突變肽氨基酸序列的游離型多肽、融合型多肽或嵌合型多肽；以及以上所述多肽之一為單體的各種形式的聚合體。

所述的HLA-A2限制性ECM1特異的長肽可通過人工合成，或通過原核細(xì)胞或真核細(xì)胞表達(dá)純化獲得。

本發(fā)明的有益技術(shù)效果。

本發(fā)明提供一種可誘導(dǎo)ECM1特異性CTL細(xì)胞的HLA-A2限制性免疫靶向ECM1的長肽，其體外容易合成，能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生顯著靶向抗腫瘤免疫反應(yīng)，具有非常大的商業(yè)產(chǎn)業(yè)化價(jià)值等優(yōu)點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于腫瘤免疫治療技術(shù)領(lǐng)域中。所述的HLA-A2限制性免疫靶向ECM1的長肽是將前期篩選的HLA-A2限制性ECM1來源CTL表位（詳見專利“與人MHC-I類分子結(jié)合的 ECM1多肽表位”，授權(quán)號(hào)： ZL201310654784.5）首位突變后，利用蛋白酶敏感連接臂（-RR-）串聯(lián)獲得，其可有效被DC內(nèi)吞進(jìn)而激活特異性T淋巴細(xì)胞，該長肽體外容易合成，方便臨床應(yīng)用。

附圖說明

圖1為本發(fā)明長肽的質(zhì)譜分析圖。

圖2為本發(fā)明長肽的高效液相色譜法分析圖。

圖3 ELISPOT法檢測本發(fā)明長肽誘導(dǎo)HLA-A2陽性PBMC釋放IFN-γ水平。

圖4 鈣黃素實(shí)驗(yàn)檢測本發(fā)明長肽ERE1誘導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞（HLA-A2陽性）的殺傷作用。

圖5鈣黃素實(shí)驗(yàn)檢測本發(fā)明長肽ERE1誘導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞（HLA-A2陰性）的殺傷作用。

圖6裸鼠移植瘤模型檢測本發(fā)明長肽ERE1誘導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞對(duì)乳腺癌生長的抑制作用。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。以下實(shí)施例將有助于對(duì)本發(fā)明的了解，但這些實(shí)施例僅為了對(duì)本發(fā)明加以說明，本發(fā)明并不限于這些內(nèi)容。在實(shí)施例中未作特殊說明的操作方法均為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)操作方法。

實(shí)施例一。

長肽的合成、純化及分子量測定。

采用標(biāo)準(zhǔn)Fmoc方案，應(yīng)用美國PE公司生產(chǎn)的ABI43IA型多肽合成儀進(jìn)行長肽的合成，簡述如下：按照多肽序列使肽鏈從羧基端向氨基端延伸，合成后，選用TFA/DCM進(jìn)行切割，表位肽收集液在常溫下減壓干燥至1-2 mL，然后用至少50 mL預(yù)冷乙醚沉淀，然后抽濾，得到的多肽粗產(chǎn)品；將獲得的長肽粗品用少量DMSO溶解后，用水稀釋至所需體積，濃度為10 mg/mL，經(jīng)0.22μm纖維膜過濾后，在美國Waters公司產(chǎn)品Delta600型HPLC上純化并進(jìn)行純度分析；流動(dòng)相選用含0.1%TFA水溶液和含0.1%TFA乙氰溶液；各肽的純化選用C18制備柱（美國Waters公司，7.0μm，100A，7.8mm×150mm），各肽的純度分析選用C18分析柱（美國Waters公司，5.0μm，100A，3.9mm×150mm）；各純化后長肽的相對(duì)分子質(zhì)量測定在API 2000型（美國Waters公司）質(zhì)譜儀上安常規(guī)方法進(jìn)行；其質(zhì)譜分析圖參見圖1，HPLC分析圖參見圖2，可以看出長肽的分子量實(shí)測值為2451，與理論值2452相近，在允許誤差范圍之內(nèi)，且純度均在95%以上，說明合成效果好，可用于下一步實(shí)驗(yàn)；上述多肽經(jīng)凍干處理后放于-70℃保存、備用。

實(shí)施例二。

ELISPOT實(shí)驗(yàn)檢測IFN-γ分泌水平考察長肽免疫原性。

1、PBMC的制備。

抽取HLA-A2陽性健康志愿者外周靜脈血10ml肝素抗凝，用PBS按1:1 稀釋，將稀釋的血樣緩緩的加入盛有淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，形成明顯的分層（稀釋血樣與淋巴細(xì)胞分離液比例為 2:1 )，經(jīng)1800 rpm，室溫水平離心15min；在超凈臺(tái)內(nèi)吸取試管中間層的單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）于另一無菌的離心管中，用PBS清洗 2次，計(jì)數(shù)PBMC，于AIM-Ⅴ培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

2、ECM1對(duì)PBMC致敏。

6孔板中，按照1×10⁶個(gè)/ml的密度，應(yīng)用AIM-Ⅴ培養(yǎng)基培養(yǎng)PBMC，加入5μg人 ECM1重組蛋白致敏PBMC，每周一次，共2次，培養(yǎng)至第14天收集細(xì)胞。

3、ELISPOT檢測。

（1）常溫下往預(yù)包被的96孔ELISPOT檢測板各個(gè)孔中加入200 μl RPMI-1640培養(yǎng)基，靜置10 min以活化預(yù)包被板。

（2）將致敏的PBMC加入ELISPOT檢測板各孔，每孔200μl，含1×10⁵個(gè)細(xì)胞。

（3）分別加入相應(yīng)的長肽ERE1及陰性肽，終濃度為50μg/ml，并設(shè)立陽性對(duì)照（PHA刺激）和陰性對(duì)照（僅加培養(yǎng)基）；將ELISPOT檢測板置于37℃，5% CO₂，飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育16h。

（4）孵育后傾倒培養(yǎng)基，于檢測板各孔中加入200 μl 冰冷的去離子水，于4℃放置10 min，然后傾棄培養(yǎng)板中的去離子水。

（5）每個(gè)孔用200 μl 1×Washing buffer洗滌6次，洗滌完成后將檢測板在滅菌吸水紙上扣干。

（6）將生物素標(biāo)記的抗體工作液加入到檢測板，每孔加入100μl，加入抗體工作液之后將板置于37℃孵育1小時(shí)。

（7）將酶標(biāo)親和素工作液加入檢測板各孔，每孔加入100 μl，將檢測板置于37℃孵育1小時(shí)；孵育后，1×Washing buffer清洗檢測板7次。

（8）將AEC顯色工作液加入檢測板各孔，每孔加入100μl，室溫孵育，每隔5分鐘觀察一次，見到檢測板有清晰的紅色斑點(diǎn)形成的時(shí)候傾倒孔內(nèi)顯色工作液，揭開板底座，用大量自來水洗滌終止顯色，自然晾干檢測板后合上底座。

（9）將檢測板交達(dá)科為公司進(jìn)行斑點(diǎn)計(jì)數(shù)，并作統(tǒng)計(jì)分析。

4、結(jié)果分析。

計(jì)數(shù)ELISPOT檢測板空地的斑點(diǎn)數(shù)目，比較長肽ERE1與陰性肽誘發(fā)PBMC分泌IFN-γ的水平，繪制各組IFN-γ分泌水平的柱狀圖，見圖3。

圖3所示為長肽ERE1誘導(dǎo)ECM1致敏的HLA-A2陽性健康志愿者PBMC釋放IFN-γ水平ELISPOT檢測結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖；結(jié)果表明，HLA-A2限制性ECM1特異長肽ERE1可明顯誘導(dǎo)HLA-A2陽性健康志愿者PBMC釋放IFN-γ。

實(shí)施例三。

鈣黃素（Calcein-AM）釋放實(shí)驗(yàn)檢測長肽體外對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向免疫殺傷效果。

1、效應(yīng)細(xì)胞的制備。

誘導(dǎo)成熟的人DC細(xì)胞，以PBS清洗后，無血清RPMI-1640培養(yǎng)基重懸，加50μg/ml 長肽ERE1，37℃孵育過夜；DC細(xì)胞經(jīng)PBS清洗、計(jì)數(shù)，按30μg/ml的濃度加入絲裂霉素C，37℃孵育30min；DC細(xì)胞經(jīng)冰PBS清洗、計(jì)數(shù)后，與繁殖期CD8+T細(xì)胞按1:20比例共培養(yǎng)，并加入50U/ml的IL-2，以刺激T細(xì)胞；1周刺激1次，共3次，將T細(xì)胞誘導(dǎo)成細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL），即效應(yīng)細(xì)胞。

2、靶細(xì)胞的制備。

復(fù)蘇乳腺癌細(xì)胞MCF7、MB-MDA-231，按照常規(guī)培養(yǎng)方式進(jìn)行細(xì)胞的正常培養(yǎng)、傳代；其中MCF7細(xì)胞株為HLA-A2陰性，MB-MDA-231細(xì)胞株為HLA-A2陽性。

3、鈣黃素釋放實(shí)驗(yàn)。

以10mM濃度的Calcein-AM標(biāo)記靶細(xì)胞，清洗、重懸。效應(yīng)細(xì)胞與標(biāo)記后的腫瘤細(xì)胞按照1:1、10:1、20:1、40:1、80:1的效靶比例，37℃共培養(yǎng)4h；然后收集培養(yǎng)液，1000rpm離心5min，取100μl上清液測定平均熒光強(qiáng)度，以單純靶細(xì)胞作為自發(fā)釋放量，以單純靶細(xì)胞加去垢劑作為最大釋放量。

效應(yīng)細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷率以細(xì)胞溶解率表示：細(xì)胞溶解率=（實(shí)驗(yàn)釋放量-自發(fā)釋放量）/（最大釋放量-自發(fā)釋放量）。

圖4所示為長肽ERE1誘導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞（HLA-A2陰性）的作用；圖5所示為長肽ERE1誘導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞對(duì)乳腺癌MB-MDA-231細(xì)胞（HLA-A2陽性）的作用；結(jié)果表明：長肽ERE1誘導(dǎo)的CTL對(duì)HLA-A2陽性的人乳腺癌細(xì)胞MB-MDA-231具有顯著殺傷作用，而對(duì)HLA-A2陰性的人乳腺癌細(xì)胞MCF-7細(xì)胞殺傷作用不明顯，其殺傷具有HLA-A2分子的限制性。

實(shí)施例四。

檢測長肽ERE1誘導(dǎo)的CTL對(duì)裸鼠移植瘤生長的抑制作用。

1、效應(yīng)細(xì)胞的制備。

誘導(dǎo)成熟的人DC細(xì)胞，以PBS清洗后，無血清RPMI-1640培養(yǎng)基重懸，加50μg/ml 長肽ERE1，37℃孵育過夜。DC細(xì)胞經(jīng)PBS清洗、計(jì)數(shù)，按30μg/ml的濃度加入絲裂霉素C，37℃孵育30min。DC細(xì)胞經(jīng)冰PBS清洗、計(jì)數(shù)后，與繁殖期呈CD8+T細(xì)胞按1:20比例共培養(yǎng)，并加入50U/ml的IL-2，以刺激T細(xì)胞。1周刺激1次，共3次，將T細(xì)胞誘導(dǎo)成細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL），即效應(yīng)細(xì)胞。

2、裸鼠MB-MDA-231皮下移植瘤模型的制備。

酒精消毒裸鼠右腋下皮膚，用1ml注射器抽MB-MDA-231 細(xì)胞懸液0.2ml（含MB-MDA-231細(xì)胞 2×10⁶個(gè)），以于每只裸鼠右側(cè)腋下皮膚扇形注入，見有皮丘鼓起，棉簽輕按止血。一般7天左右即可見裸鼠皮下有小的腫瘤長出。

3、觀察長肽ERE1誘導(dǎo)的CTL對(duì)裸鼠移植瘤生長的抑制作用。

4、待小鼠成瘤后，尾靜脈注射上述長肽誘導(dǎo)的CTL細(xì)胞懸液0.5ml（含CTL細(xì)胞1×10⁷個(gè)），每周1次，共2次，同步以陰性肽誘導(dǎo)CD8+T作為對(duì)照，末次注射后7d，取小鼠腫瘤組織，計(jì)算腫瘤重量以評(píng)價(jià)長肽ERE1誘導(dǎo)的CTL對(duì)裸鼠移植瘤生長的抑制作用。

圖6所示為長肽ERE1誘導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞對(duì)乳腺癌MB-MDA-231細(xì)胞（HLA-A2陽性）裸鼠皮下移植瘤的抑制作用，其中圖6-1為移植瘤實(shí)測圖；圖6-2為移植瘤重量的統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果；結(jié)果表明：長肽ERE1誘導(dǎo)的CTL顯著抑制HLA-A2陽性的人乳腺癌細(xì)胞MB-MDA-231裸鼠移植瘤的生長。

序列表

<110> 中國醫(yī)科大學(xué)

<120> 一種基于腫瘤抗原ECM1的長肽ERE1及其在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Tyr Leu Thr Ile Asp Ile Ser Arg Val Arg Arg Tyr Leu Thr Ile Asp Ile Ser Arg Val

1 5 10 15 20