本發(fā)明屬于海洋生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及玻璃海鞘粗提物的制備方法。
背景技術(shù)：
從海洋生物中提取分離活性物質(zhì)是海洋藥物研究的重要方向之一，而其中抗腫瘤活性研究是一大熱點，海洋生物中含有多達數(shù)萬種活性多肽，且許多是陸生生物中所不具有的，海洋生物多肽的潛在應(yīng)用價值使得各國科學(xué)家爭相進行實驗研究。近年來，國內(nèi)外相關(guān)研究表明，海洋生物中含有大量的具有抗腫瘤活性的多肽和蛋白，已經(jīng)得到的包括海綿多肽，?？嚯模Ｍ枚嚯?，芋螺多肽。但關(guān)于玻璃海鞘抗腫瘤活性蛋白的分離和活性研究還未見報道。
玻璃海鞘（Ciona intestinalis L.）地方名：海茄子，海鼻涕。其形態(tài)特征是：體透明，柔軟，體長55毫米～70毫米。頂端具2個不同的孔，位高者為入水孔周圍有8個裂瓣；位低者為出水孔，有6個裂瓣，每個裂瓣頂端有1紅色斑點。幼體白色，成體淡黃色。個體背腹伸長，被囊非常柔軟、半透明。產(chǎn)地、季節(jié)：主要分布于我國的黃海、渤海海域，為我國北方優(yōu)勢物種。繁殖期是5-11月，盛產(chǎn)期為8-10月。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明旨在提供一種玻璃海鞘粗提物的制備方法。
一種玻璃海鞘粗提物的制備方法，步驟如下：
（1）將采集的冷凍玻璃海鞘融化，控干海水，用淡水沖洗干凈，控干水分，收集個體；將收集的玻璃海鞘用粉碎機粉碎，紗布過濾后，加入適量純水用數(shù)顯高速分散勻質(zhì)機勻漿，勻漿時間不宜過長；
（2）將勻漿液于4℃、10000rpm離心20min，去除泥沙雜質(zhì)及不溶性物質(zhì)，收集上清液，收集離心后的上清可置于-80℃保存?zhèn)溆茫?/p>
（3）將玻璃海鞘粉碎上清液加熱到70℃，孵育30min；
（4）將上清液用EDMAN高速離心機離心，轉(zhuǎn)速10000rpm，時間20min，收集上清液備用，棄沉淀；
（5）上清液加入三倍體積的丙酮溶劑，使玻璃海鞘粗提液成為70%的丙酮溶液，進行分離純化；整個過程丙酮應(yīng)緩慢加入，邊加入邊攪拌，防止局部丙酮濃度過大，引起蛋白過度沉淀；
（6）4℃靜置過夜；
（7）用虹吸管引流，移除丙酮上清液。沉淀用EDMAN高速離心機離心，轉(zhuǎn)速10000rpm，時間20min,棄上清，留沉淀備用；
（8）沉淀放入通風(fēng)廚，12小時左右盡量除去沉淀中殘留的丙酮；
（9）將沉淀溶解于超純水中，溶液用EDMAN高速離心機離心，轉(zhuǎn)速10000rpm，時間20min，棄沉淀，取上清備用；
（10）上清液通過milipore公司的超濾儀，用5KDa的濾膜進行超濾截留，保留大于5KDa的部分；采用BCA法測定蛋白濃度后，MTT試驗檢測組份活性，將活性組份置于-20℃保存。
本發(fā)明的方法可以簡單、快速地提取到玻璃海鞘的粗提物，粗提物中的成分全面且提取率高。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。
一種玻璃海鞘粗提物的制備方法，步驟如下：
（1）將采集的冷凍玻璃海鞘融化，控干海水，用淡水沖洗干凈，控干水分，收集個體；將收集的玻璃海鞘用粉碎機粉碎，紗布過濾后，加入適量純水用數(shù)顯高速分散勻質(zhì)機勻漿，勻漿時間不宜過長；
（2）將勻漿液于4℃、10000rpm離心20min，去除泥沙雜質(zhì)及不溶性物質(zhì)，收集上清液，收集離心后的上清可置于-80℃保存?zhèn)溆茫?/p>
（3）將玻璃海鞘粉碎上清液加熱到70℃，孵育30min；
（4）將上清液用EDMAN高速離心機離心，轉(zhuǎn)速10000rpm，時間20min，收集上清液備用，棄沉淀；
（5）上清液加入三倍體積的丙酮溶劑，使玻璃海鞘粗提液成為70%的丙酮溶液，進行分離純化；整個過程丙酮應(yīng)緩慢加入，邊加入邊攪拌，防止局部丙酮濃度過大，引起蛋白過度沉淀；
（6）4℃靜置過夜；
（7）用虹吸管引流，移除丙酮上清液；沉淀用EDMAN高速離心機離心，轉(zhuǎn)速10000rpm，時間20min,棄上清，留沉淀備用；
（8）沉淀放入通風(fēng)廚，12小時左右盡量除去沉淀中殘留的丙酮；
（9）將沉淀溶解于超純水中，溶液用EDMAN高速離心機離心，轉(zhuǎn)速10000rpm，時間20min，棄沉淀，取上清備用；
（10）上清液通過milipore公司的超濾儀，用5KDa的濾膜進行超濾截留，保留大于5KDa的部分；采用BCA法測定蛋白濃度后，MTT試驗檢測組份活性，將活性組份置于-20℃保存。
玻璃海鞘經(jīng)清洗、粉碎、過濾、丙酮沉淀、重溶、超濾，分別收集分子量小于5 kDa和大于5 kDa組分，經(jīng)過BEL-7402肝癌細胞進行細胞毒測定（MTT實驗），發(fā)現(xiàn)大于 5 kDa 組分表現(xiàn)出強的抗腫瘤細胞活性，并呈劑量依賴關(guān)系。當(dāng)粗提物濃度達到 2mg/ml，培養(yǎng)時間 48 小時對腫瘤細胞的抑制率達到 50%左右。