本發(fā)明涉及一種從傳統(tǒng)中藥材中篩選具有肽酶抑制活性組分的方法。

背景技術(shù)：

肽酶，亦稱蛋白水解酶，其與蛋白酶的區(qū)別在于蛋白酶將蛋白質(zhì)水解為多肽，而肽酶將蛋白質(zhì)水解為氨基酸。肽酶是一種能夠水解肽鏈的酶。他們是所有生物存活所必需的一種酶，而且在所有蛋白質(zhì)的編碼中，編碼肽酶的基因占了2％。在對500個人的肽酶的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，有14％的的肽酶可以作為藥物的靶點(Southan，2001)。肽酶在許多生物過程中扮演重要的角色，包括消化食物蛋白、胞內(nèi)蛋白循環(huán)、凝血級聯(lián)系統(tǒng)、抗原提呈作用及活化各種蛋白質(zhì)，包括酶、肽類激素及神經(jīng)遞質(zhì)等。

20世紀(jì)60年代初，Umezawa提出了酶抑制的概念，由此引發(fā)了酶抑制劑類藥物研究的熱潮。在目前上市的藥物中，以受體為作用靶點的藥物占52％，以酶為靶點的藥物占22％，以離子通道為靶點的藥物占6％，以核酸為靶點的藥物占3％。由此可見，酶抑制劑的開發(fā)已經(jīng)成為新藥來源的一個主要途徑。酶抑制劑的來源主要有兩種：一是化學(xué)合成物。二是天然產(chǎn)物，包括動植物，各種微生物及天然中藥材等。天然產(chǎn)物中的酶抑制劑以其成本低廉，藥效高，副作用小而備受關(guān)注。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及一種從傳統(tǒng)中藥材中篩選具有肽酶抑制活性組分的方法。其特征在于利用多肽組學(xué)和本草物質(zhì)組學(xué)的手段，有效發(fā)現(xiàn)能夠選擇性抑制某一種或某一類肽酶的抑制劑以及對應(yīng)肽酶。本方法具體步驟如下：

1)中草藥中多肽成分的雙液相結(jié)合提取

將天麻，遠(yuǎn)志，酸棗仁等中藥材分別采用粉碎機處理3min，得到中藥材粉末。

上述粉末首先用0.2％乙酸水溶液按照1g：4ml的比例勻漿結(jié)合超聲提取兩次，離心后取上清液，上清液合并后采用10kda超濾膜過濾，即得中藥材中 多肽的水相提取液。

采用30％乙腈0.2％乙酸水溶液，50％乙腈0.2％乙酸水溶液分別按照上述步驟將剩余沉淀物提取一次，所得提取液合并后即得中藥材中多肽的有機相提取液。

2)大鼠或小鼠腦組織勻漿物樣本制備

取大鼠或小鼠腦組織，勻漿2min(中間間隔10s)得到腦勻漿物。分成60mg等份樣本備用。每個樣本加入90uL的Tris緩沖液(16mM，pH＝7.8，用以提供適宜酶解實驗的酸堿環(huán)境)以及30uL的ZnCl2溶液(10mM，用以促進(jìn)酶解，以保持樣本酶解狀態(tài)的平行性)。

3)不同中藥材提取物作用于動物腦組織的酶解抑制實驗

取上述樣本3份，分別加入30uL的天麻，遠(yuǎn)志，酸棗仁提取液，勻漿混合10min(中間間隔20s)。37℃水浴孵化3h。取出后加入30uL去離子水。

4)空白對照實驗

空白實驗：取上述樣本1份，加入30uL的去離子水，勻漿混合10min(中間間隔20s)。37℃水浴孵化3h。取出后加入30uL去離子水。

5)加熱抑制酶活性對照實驗

取上述樣本1份，加入30uL的去離子水，80-90℃水浴加熱2min，勻漿混合10min(中間間隔20s)。37℃水浴孵化3h。取出后加入30uL去離子水。

6)不同中藥材提取物作用于動物腦組織的酶解抑制實驗對照樣本制備

取上述樣本3份，分別加入30uL的去離子水，勻漿混合10min(中間間隔20s)。37℃水浴孵化3h。取出后分別加入30uL天麻，遠(yuǎn)志，酸棗仁提取液。

7)采用定量多肽組學(xué)技術(shù)檢測結(jié)果評價樣本的酶活性抑制程度

將3)-6)步所得樣本分別加入720uL含有0.25％乙酸的乙腈溶液(總濃度為80％乙腈0.2％乙酸水溶液)，勻漿結(jié)合超聲提取其中的多肽，離心后取上清液，上清液合并后采用10kda超濾膜過濾，即得腦組織中多肽的提取液。

將上述提取液真空凍干后，重新溶解于200uL乙酸水溶液中。采用UPLC-QTOF分析其中的NAAG含量，用以評價不同中藥提取物的肽酶抑制活性。

采用本發(fā)明與傳統(tǒng)方法相比具有以下優(yōu)點：

1)采用本方法可以高效低成本提取分離篩選出傳統(tǒng)中藥材中的肽酶抑制成分。通過該方法獲得的肽酶抑制劑相比化學(xué)合成法具有成本低廉，工藝簡單，副產(chǎn)物少，毒副作用小等優(yōu)勢。

2)本方法過程中采用加熱抑制肽酶活性，加入化學(xué)抑制劑抑制肽酶活性，加入商業(yè)化酶抑制劑抑制肽酶活性及酶解后加入中藥提取液的多重對照實驗組，實驗結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

3)實驗結(jié)果采用UPLC-QTOF分析，并采用在大鼠及小鼠腦組織中含量較高的NAAG作為標(biāo)志物，結(jié)果靈敏準(zhǔn)確。

具體實施方式

現(xiàn)結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明，實施例僅限于說明本發(fā)明，而非對本發(fā)明的限定。

實施例1

200mg天麻粉末置于2mL勻漿管中，加入800ul 0.2％乙酸水溶液，4顆瓷珠，勻漿提取2min，4℃恒溫20000r/min離心60min，收集上清液。剩余沉淀物加入800ul 0.2％乙酸水溶液重復(fù)提取。兩次上清液合并，采用10kda超濾膜過濾，所得濾液即為天麻多肽提取液，于4℃恒溫儲存?zhèn)溆谩Ｈ〈笫蠡蛐∈竽X組織，勻漿2min得到腦勻漿物。分成60mg等份樣本備用。每個樣本加入90uL的Tris緩沖液(16mM，pH＝7.8)以及30uL的ZnCl2溶液(10mM)。取上述鼠腦組織樣本1份，加入30uL的天麻多肽提取液，勻漿混合10min。37℃水浴孵化3h。取出后加入30uL去離子水。

所得樣本加入720uL含有0.25％乙酸的乙腈溶液，勻漿結(jié)合超聲提取其中的多肽，離心后取上清液，上清液合并后采用10kda超濾膜過濾，即得腦組織中多肽的提取液。將上述提取液真空凍干后，重新溶解于200uL乙酸水溶液中。采用UPLC-QTOF定量分析其中的NAAG多肽含量，用以評價天麻多肽提取物的肽酶抑制活性。

實施例2

200mg遠(yuǎn)志粉末置于2mL勻漿管中，加入800ul 0.2％乙酸水溶液，4顆瓷珠，勻漿提取2min，4℃恒溫20000r/min離心60min，收集上清液。剩余沉淀物加入800ul 0.2％乙酸水溶液重復(fù)提取。兩次上清液合并，采用10kda 超濾膜過濾，所得濾液即為遠(yuǎn)志多肽提取液，于4℃恒溫儲存?zhèn)溆?。取大鼠或小鼠腦組織，勻漿2min得到腦勻漿物。分成60mg等份樣本備用。每個樣本加入90uL的Tris緩沖液(16mM，pH＝7.8)以及30uL的ZnCl2溶液(10mM)。取上述鼠腦組織樣本1份，加入30uL的遠(yuǎn)志多肽提取液，勻漿混合10min。37℃水浴孵化3h。取出后加入30uL去離子水。所得樣本加入720uL含有0.25％乙酸的乙腈溶液，勻漿結(jié)合超聲提取其中的多肽，離心后取上清液，上清液合并后采用10kda超濾膜過濾，即得腦組織中多肽的提取液。將上述提取液真空凍干后，重新溶解于200uL乙酸水溶液中。采用UPLC-QTOF分析其中的NAAG含量，用以評價遠(yuǎn)志多肽提取物的肽酶抑制活性。

實施例3

200mg酸棗仁粉末置于2mL勻漿管中，加入800ul 0.2％乙酸水溶液，4顆瓷珠，勻漿提取2min，4℃恒溫20000r/min離心60min，收集上清液。剩余沉淀物加入800ul 0.2％乙酸水溶液重復(fù)提取。兩次上清液合并，采用10kda超濾膜過濾，所得濾液即為酸棗仁多肽提取液，于4℃恒溫儲存?zhèn)溆?。取大鼠或小鼠腦組織，勻漿2min得到腦勻漿物。分成60mg等份樣本備用。每個樣本加入90uL的Tris緩沖液(16mM，pH＝7.8)以及30uL的ZnCl2溶液(10mM)。取上述鼠腦組織樣本1份，加入30uL的酸棗仁多肽提取液，勻漿混合10min。37℃水浴孵化3h。取出后加入30uL去離子水。所得樣本加入720uL含有0.25％乙酸的乙腈溶液，勻漿結(jié)合超聲提取其中的多肽，離心后取上清液，上清液合并后采用10kda超濾膜過濾，即得腦組織中多肽的提取液。將上述提取液真空凍干后，重新溶解于200uL乙酸水溶液中。采用UPLC-QTOF分析其中的NAAG含量，用以評價酸棗仁多肽提取物的肽酶抑制活性。