本發(fā)明涉及鴨圓環(huán)病毒ORF3蛋白核定位NLS序列，以及該NLS序列在表達(dá)載體領(lǐng)域的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

將外源基因人工導(dǎo)入細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因技術(shù)是一種重要的技術(shù)，不僅僅因?yàn)樗且环N分析各種生物現(xiàn)象的基本技術(shù)，而且因?yàn)槠湓谥T如基因治療和有益動(dòng)物生產(chǎn)方面的應(yīng)用。一般而言，轉(zhuǎn)基因有兩種方法。一種是利用具有外源基因的病毒的生物學(xué)方法，另一種用物理學(xué)方法將外源基因?qū)爰?xì)胞的物理學(xué)方法。

鴨圓環(huán)病毒(Duck circovirus,DuCV)能引起鴨免疫抑制性疾病，感染的鴨子主要表現(xiàn)為羽毛凌亂、生長(zhǎng)遲緩、體重減輕，胸腺、法氏囊、脾臟、肝臟不同程度出血腫脹，淋巴細(xì)胞壞死等特征。DuCV于2003年由德國(guó)學(xué)者Hattermann發(fā)現(xiàn)，而后分別在匈牙利、美國(guó)、中國(guó)臺(tái)灣地區(qū)及中國(guó)大陸等地被發(fā)現(xiàn)或報(bào)道，眾多的病原學(xué)和血清學(xué)的檢測(cè)表明我國(guó)鴨群中DuCV的感染普遍存在，感染率在6％-84％不等。值得注意的是DuCV感染會(huì)損害免疫系統(tǒng)，感染DuCV的病鴨常常伴發(fā)鴨疫里默氏菌、多殺性巴氏桿菌、大腸桿菌、鴨肝炎病毒、鴨瘟病毒等的感染，并且感染鴨圓環(huán)病毒后，會(huì)顯著提高這些病原感染的幾率，提示DuCV在鴨傳染病混合感染中扮演重要角色。

DuCV為單股環(huán)狀DNA病毒，DuCV基因組約為1.99kb，編碼三種病毒蛋白：Rep、Cap和ORF3蛋白。根據(jù)DuCV基因組序列和cap基因序列遺傳進(jìn)化分析，DuCV可劃分為基因I型和基因II型2個(gè)基因型。ORF3蛋白是申請(qǐng)人于2012年新發(fā)現(xiàn)的DuCV病毒蛋白，對(duì)分屬兩基因型的不同DuCV代表毒株的ORF3基因序列進(jìn)行同源性分析發(fā)現(xiàn)，基因I型和II型DuCV的ORF3核酸序列同源性存在較大差異。同基因型DuCV ORF3同源性為92.9％-100％，而基因I型與II型毒株間ORF3同源性僅為77.8％-81.8％。

本發(fā)明的目的之一是提供一個(gè)系統(tǒng)，該系統(tǒng)可將導(dǎo)入細(xì)胞中的基因送入核中。更具體地，本發(fā)明的目的是提供一種重組表達(dá)載體，其包含NLS序列RRLRTCNCRACRTLKH。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

對(duì)分屬兩基因型的不同DuCV代表毒株的ORF3基因序列進(jìn)行同源性分析發(fā)現(xiàn)，基因I型和II型DuCV的ORF3核酸序列同源性存在較大差異，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)與II型DuCV ORF3基因序列相比，I型毒株的ORF3第236位核苷酸發(fā)生T→A突變，密碼子TTG(235-237)轉(zhuǎn)變?yōu)榻K止密碼子TAG，導(dǎo)致翻譯提前終止，C端缺失了20個(gè)氨基酸，而此區(qū)域富含堿性氨基酸(R,H,K占35％)，提示此區(qū)域存在潛在的核定位信號(hào)(NLS)。定位分析也發(fā)現(xiàn)基因II型DuCV ORF3蛋白定位于細(xì)胞核中，而C端差異區(qū)域敲除后喪失了胞核定位能力，與基因I型DuCV ORF3蛋白一樣，主要定位于胞漿中，說明C端差異區(qū)域存在NLS。

將ORF3C端差異區(qū)域進(jìn)行突變，確定了精確的NLS序列:RRLRTCNCRACRTLKH

將C端差異區(qū)域的NLS信號(hào)與GFP蛋白融合表達(dá)，EGFP獲得細(xì)胞核定位的能力。

本發(fā)明提供

(1).一種核定位信號(hào)多肽，其序列是RRLRTCNCRACRTLKH。

(2).編碼(1)所述多肽的基因。

(3).如(2)所述的基因，其序列是5’-CGACGATTGCGAACTTGCAATTGTCGAGCGTGCAGAACTCTAAAACAT-3’。

(4).一種重組表達(dá)載體，包括如(2)或(3)所述的基因。

(5).如(4)所述的重組表達(dá)載體，所述基因包括兩個(gè)拷貝。

(6).如(5)所述的重組表達(dá)載體，所述兩個(gè)拷貝是無間斷的連續(xù)兩個(gè)拷貝。

(7).一種多肽在將目標(biāo)蛋白定位于細(xì)胞核中的應(yīng)用，所述多肽序列為RRLRTCNCRACRTLKH。

附圖說明

圖1 pEGFP-N3質(zhì)粒圖譜即MCS位點(diǎn)

圖2本發(fā)明實(shí)施例EGFP的核漿表達(dá)分布結(jié)果

圖3不同DuCV毒株ORF3核苷酸序列比對(duì)分析

圖4不同DuCV毒株ORF3氨基酸序列比對(duì)分析

圖5 C端差異區(qū)域影響ORF3蛋白核漿定位

圖6 ORF3蛋白C端突變體質(zhì)粒構(gòu)建模式圖

圖7 C端差異區(qū)域NLS具有攜帶EGFP入核的能力

具體實(shí)施方式

核定位信號(hào)(NLS)是一段包含多個(gè)堿性氨基酸且靶向蛋白細(xì)胞核轉(zhuǎn)位的氨基酸序列，在調(diào)控蛋白核定位過程發(fā)揮非常重要作用。細(xì)胞核內(nèi)復(fù)制的病毒會(huì)編碼多種存在NLS的病毒蛋白進(jìn)入細(xì)胞核，協(xié)助完成子代病毒的復(fù)制，并影響宿主細(xì)胞基因表達(dá)、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期調(diào)控等過程。

病毒與細(xì)胞：DuCV-2 WF0701毒株和DuCV-1 FJ0601毒株保存于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物分子病原學(xué)實(shí)驗(yàn)室，CHO、DF-1細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞保藏中心。

各種抗體：HRP標(biāo)記山羊抗鴨IgG二抗購(gòu)自美國(guó)KPL公司，HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG二抗購(gòu)自Santa Cruz公司；抗Flag單克隆抗體(M2)購(gòu)自Sigma公司；抗DsRed單克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz公司，抗GAPDH單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Protein Tech公司。

各種酶類和試劑：rTaq酶，dNTPs，6bp隨機(jī)引物購(gòu)自大連TaKaRa公司；T4DNA連接酶購(gòu)自NEB公司；各種限制性內(nèi)切酶購(gòu)自Fermentas(MBI)公司：Xfect轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)于clontch公司；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)于Gibco公司；質(zhì)粒DNA大提試劑盒購(gòu)于Tiangen公司；蛋白質(zhì)maker購(gòu)自Fermentas(IVlBI)公司，DNA maker購(gòu)自Tiangen公司；ECL發(fā)光試劑盒購(gòu)于Pierce公司；二硫蘇糖醇(DTT)，蛋白酶抑制劑PMSF、Leupeptin Aprotinin購(gòu)于Sigma公司。其他普通試劑購(gòu)自國(guó)產(chǎn)試劑公司。

質(zhì)粒與細(xì)菌：真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N3購(gòu)自clotech公司，大腸桿菌DH5a菌種購(gòu)自Tiangen公司。

實(shí)施例1將ORF3C端差異區(qū)域進(jìn)行突變，確定了精確的NLS序列:RRLRTCNCRACRTLKH。

1材料和方法

1.1質(zhì)粒

pEGFP-N3、pcDNA-FJ-ORF3和pcDNA-WF-ORF3質(zhì)粒為市售產(chǎn)品或?qū)嶒?yàn)室自己制備，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌株DH5α，提取質(zhì)粒DNA，用DNA/RNA定量?jī)x測(cè)定DNA濃度，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2主要試劑

Pfu Turbo DNA Polymerase購(gòu)自Agilent公司；DpnI購(gòu)自NEB公司；Lipo2000購(gòu)自invitrogen公司。

1.3 pEGFP-FJ-ORF3和pEGFP-WF-ORF3定位分析

1.3.1基因I型和II型DuCV的ORF3序列分析

I型與II型DuCV ORF3基因序列相比，I型毒株的ORF3第236位核苷酸發(fā)生T→A突變，密碼子TTG(235-237)轉(zhuǎn)變?yōu)榻K止密碼子TAG，導(dǎo)致翻譯提前終止(如圖3)，C端缺失了20個(gè)氨基酸，而此區(qū)域富含堿性氨基酸(R,H,K占35％)(如圖4)，提示此區(qū)域存在潛在的核定位信號(hào)(NLS)。

1.3.2 pEGFP-FJ-ORF3、pEGFP-FJ-ORF3ΔC和pEGFP-WF-ORF3質(zhì)粒構(gòu)建：用pcDNA-FJ-ORF3和pcDNA-WF-ORF3質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增FJ-ORF3、FJ-ORF3ΔC和WF-ORF3基因，利用EcoRI和BamHI內(nèi)切酶將基因克隆入pEGFP-N3載體。

質(zhì)粒構(gòu)建引物：

FJ-ORF3-F：CGGAATTCACCATGTCGCATCGGCGAACTGGG

FJ-ORF3-R:CGGGATCCCCTTTGAAGATTATGTTCATGT

FJ-ORF3-ΔC-R:CGGGATCCTCGTCGGAGAGGAAAAGGGCGC

WF-ORF3-F:CGGAATTCACCATGTCGCTTCGGCCAGATCAG

WF-ORF3-R:CGGGATCCTCGTCGGCGAGGAGAAGGGCGC

1.3.3 FJ-ORF3、FJ-ORF3ΔC和WF-ORF3定位分析：

將pEGFP-N3、pEGFP-FJ-ORF3、pEGFP-FJ-ORF3ΔC和pEGFP-WF-ORF3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后24h，4％多聚甲醛固定細(xì)胞，DAPI染核，進(jìn)行熒光共聚焦分析，結(jié)果如圖5所示。

1.4 NLS的精細(xì)定位

1.4.1 FJ-ORF3突變體構(gòu)建：用突變PCR技術(shù)將FJ-ORF3C端區(qū)域進(jìn)行缺失突變或點(diǎn)突變，突變PCR體系：Reaction Buffer(10*)5ul，引物(10μM)2ul，dNTP Mix(2.5mM each)4ul，待突變模板質(zhì)粒0.2μg，用ddH₂O補(bǔ)齊至50ul；反應(yīng)程序：預(yù)變性95℃5min，95℃1min，68℃擴(kuò)增1kb/min，反應(yīng)18個(gè)循環(huán)，72℃10min后，4℃保存。擴(kuò)增完后，每管加DpnI 1ul，37℃酶切1h后，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)，挑取單克隆送公司測(cè)序。測(cè)序陽(yáng)性克隆進(jìn)行培養(yǎng)，提取質(zhì)粒。

突變引物序列：

FJ-ORF3-ΔC-F：cccttttcctctccgacgaGGTACCGCGGGCCCGGGA

FJ-ORF3-ΔC-R：TCCCGGGCCCGCGGTACCtcgtcggagaggaaaaggg

FJ-ORF3-Δ81-98-F：：cctctccgacgattgcgaGGTACCGCGGGCCCGGGA

FJ-ORF3-Δ81-98-R：TCCCGGGCCCGCGGTACCtcgcaatcgtcggagagg

FJ-ORF3-R70A-F：ctgaaggtgaggtgtacgcttcgcgcccttttcctctc

FJ-ORF3-R70A-R：gagaggaaaagggcgcgaagcgtacacctcaccttcag

FJ-ORF3-Δ86-98-F：gcgaacttgcaattgtcgaGGTACCGCGGGCCCGGGA

FJ-ORF3-Δ86-98-R：TCCCGGGCCCGCGGTACCtcgacaattgcaagttcgc

FJ-ORF3-Δ89-98-F：caattgtcgagcgtgcagaGGTACCGCGGGCCCGGGA

FJ-ORF3-Δ89-98-R：TCCCGGGCCCGCGGTACCtctgcacgctcgacaattg

FJ-ORF3-Δ92-98-F：gcgtgcagaactctaaaaGGTACCGCGGGCCCGGGA

FJ-ORF3-Δ92-98-R：TCCCGGGCCCGCGGTACCttttagagttctgcacgc

R72A-F:gtgaggtgtaccgttcggccccttttcctctccg

R72A-R:cggagaggaaaaggggccgaacggtacacctcac

FJ-ORF3-R77A-F:gcgcccttttcctctcGCacgattgcgaacttgc

FJ-ORF3-R77A-R:gcaagttcgcaatcgtGCgagaggaaaagggcgc

FJ-ORF3-R78A-F:gcccttttcctctccgaGCattgcgaacttgcaat

FJ-ORF3-R78A-R:attgcaagttcgcaatGCtcggagaggaaaagggc

FJ-ORF3-R77/78A-

F:cgcccttttcctctcGCaGCattgcgaacttgcaattg

FJ-ORF3-R77/78A-

R:caattgcaagttcgcaatGCtGCgagaggaaaagggcg

1.4.2 FJ-ORF3突變體定位分析：將FJ-ORF3野生型和突變型表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后24h，4％多聚甲醛固定細(xì)胞，DAPI染核，進(jìn)行熒光共聚焦分析。根據(jù)野生型和突變型的核漿定位變化，

定位到FJ-ORF3的精確核定位信號(hào)序列：RRLRTCNCRACRTLKH，

對(duì)應(yīng)的核苷酸序列：cgacgattgcgaacttgcaattgtcgagcgtgcagaactctaaaacat

實(shí)施例2將C端差異區(qū)域的NLS信號(hào)與GFP蛋白融合表達(dá)，EGFP獲得細(xì)胞核定位的能力

2.1 pNLS-GFP表達(dá)載體的構(gòu)建及其表達(dá)測(cè)定

pNLS-GFP質(zhì)粒構(gòu)建：合成下面兩個(gè)引物，斜線標(biāo)記為NLS序列

引物NLS-F1：

AATTCATGCGACGATTGCGAACTTGCAATTGTCGAGCGTGCAGAACTCTAAAACATG

引物NLS-R1：

GATCCATGTTTTAGAGTTCTGCACGCTCGACAATTGCAAGTTCGCAATCGTCGCATG

將上下游退火，利用EcoRI和BamHI酶切位點(diǎn)將NLS克隆入pEGFP-N3(質(zhì)粒圖譜如圖1所示)載體中，具體試驗(yàn)步驟按照常規(guī)試驗(yàn)進(jìn)行。

2.2 NLS-GFP定位分析

2.2.1熒光試驗(yàn)

1.將飛片放置于培養(yǎng)板中

2.DF-1細(xì)胞傳代于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，3*10⁵細(xì)胞/孔

3.37℃培養(yǎng)12h后，用轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體2000分別將2ugpWF-ORF3、pFJ-ORF3、pFJ-ORF3-ΔC或pEGFP-N3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入DF-1細(xì)胞中

4.轉(zhuǎn)染后24h，棄掉培養(yǎng)基，用PBS洗1-2遍后，用4％多聚甲醛室溫固定30min

5.棄去固定液，用PBS洗3次

6.用打孔液(含1％NP40的PBS)室溫穿孔10min

7.棄去打孔液，PBS洗3遍

8.用DAPI溶液室溫避光孵育5min

9.PBS洗3遍后，將飛片取出用抗熒光淬滅劑進(jìn)行封片

10.最后用熒光共聚焦掃描顯微鏡進(jìn)行觀察與分析

2.2.2免疫印跡試驗(yàn)(WB)

1.DF-1細(xì)胞傳代于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，3*10⁵細(xì)胞/孔

2.37℃培養(yǎng)12h后，用轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine 2000分別將2ug pWF-ORF3、pFJ-ORF3、pFJ-ORF3-ΔC或pEGFP-N3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入DF-1細(xì)胞中

3.轉(zhuǎn)染后24h，刮取細(xì)胞，離心棄上清

4.細(xì)胞沉淀用WB及IP細(xì)胞裂解液冰上裂解5min，然后12000rpm 4℃離心5min，上清轉(zhuǎn)移至另一新的EP管(當(dāng)分析蛋白核漿分布時(shí)如圖7，需分別提取胞漿和胞核蛋白，具體方法參照附件胞漿和胞核蛋白提取試劑盒，本實(shí)施例使用的是EnoGene^TMNuclear and Cytoplasmic Protein Extraction Kit試劑盒)

5.上清用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度(方法見附件BCA測(cè)定蛋白濃度步驟)，并加入蛋白上樣緩沖液于100℃煮沸5min

6.取40ug蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)印至NC膜上，以EGFP單抗和GAPDH單抗為一抗，HRP-羊抗鼠lgG為二抗，ECL化學(xué)發(fā)光法曝光顯色，分析目的蛋白表達(dá)變化。(分析核漿定位時(shí)，分別提取胞漿和胞核蛋白，用EGFP單抗檢測(cè)ORF3-EGFP融合蛋白，H2A作為胞核蛋白內(nèi)參，GAPDH作為胞漿蛋白內(nèi)參。目的條帶用Image-Pro Plus軟件進(jìn)行灰度分析并用GraphPad軟件分析ORF3蛋白胞核胞漿分布比例。

結(jié)果如圖7所示，其中A:pEGFP-N3和pNLS-EGFP-N3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞24h后，熒光分析GFP定位變化，可以明顯看出pNLS-EGFP-N3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，螢光集中于細(xì)胞核區(qū)；B:pEGFP-N3和pNLS-EGFP-N3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞24h后，提取胞漿和胞核蛋白，用EGFP單抗檢測(cè)ORF3-EGFP融合蛋白，H2A作為胞核蛋白內(nèi)參，GAPDH作為胞漿蛋白內(nèi)參，WB分析GFP蛋白核漿分布變化；C:免疫印跡結(jié)果的目的條帶用Image-Pro Plus軟件進(jìn)行灰度分析并用GraphPad軟件分析ORF3蛋白胞核胞漿分布比例。

實(shí)施例3不同拷貝數(shù)NLS序列的核定位效果

3.1 p2*NLS-GFP以及p3*NLS-GFP表達(dá)載體的構(gòu)建

合成下面兩組引物，斜線標(biāo)記為NLS序列

引物NLS-F2：

AATTCATGCGACGATTGCGAACTTGCAATTGTCGAGCGTGCAGAACTCTAAAACATATGCGACGATTGCGAACTTGCAATTGTCGAGCGTGCAGAACTCTAAAACATG

引物NLS-R2：

GATCCATGTTTTAGAGTTCTGCACGCTCGACAATTGCAAGTTCGCAATCGTCGCATATGTTTTAGAGTTCTGCACGCTCGACAATTGCAAGTTCGCAATCGTCGCATG

引物NLS-F3：

AATTCATGCGACGATTGCGAACTTGCAATTGTCGAGCGTGCAGAACTCTAAAACATATGCGACGATTGCGAACTTGCAATTGTCGAGCGTGCAGAACTCTAAAACATATGCGACGATTGCGAACTTGCAATTGTCGAGCGTGCAGAACTCTAAAACATG

引物NLS-R3：

GATCCATGTTTTAGAGTTCTGCACGCTCGACAATTGCAAGTTCGCAATCGTCGCATATGTTTTAGAGTTCTGCACGCTCGACAATTGCAAGTTCGCAATCGTCGCATATGTTTTAGAGTTCTGCACGCTCGACAATTGCAAGTTCGCAATCGTCGCATG

將上下游退火，利用EcoRI和BamHI酶切位點(diǎn)將NLS克隆入pEGFP-N3(質(zhì)粒圖譜如圖1所示)載體中，具體試驗(yàn)步驟按照常規(guī)試驗(yàn)進(jìn)行。

3.2 NLS-GFP定位分析以及表達(dá)效果分析

3.2.1熒光試驗(yàn)

1.將飛片放置于培養(yǎng)板中

2.DF-1細(xì)胞傳代于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，3*10⁵細(xì)胞/孔

3.37℃培養(yǎng)12h后，用轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體2000分別將2ug pEGFP-N3-1*NLS、2ug pEGFP-N3-2*NLS、2ug pEGFP-N3-3*NLS質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入DF-1細(xì)胞中

4.轉(zhuǎn)染后24h，棄掉培養(yǎng)基，用PBS洗1-2遍后，用4％多聚甲醛室溫固定30min

5.棄去固定液，用PBS洗3次

6.用打孔液(含1％NP40的PBS)室溫穿孔10min

7.棄去打孔液，PBS洗3遍

8.用DAPI溶液室溫避光孵育5min

9.PBS洗3遍后，將飛片取出用抗熒光淬滅劑進(jìn)行封片

10.最后用熒光共聚焦掃描顯微鏡進(jìn)行觀察與分析

3.2.2免疫印跡試驗(yàn)(WB)

1.DF-1細(xì)胞傳代于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，3*10⁵細(xì)胞/孔

2.37℃培養(yǎng)12h后，用轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine 2000分別將2ug pWF-ORF3、pFJ-ORF3、pFJ-ORF3-ΔC或pEGFP-N3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入DF-1細(xì)胞中

3.轉(zhuǎn)染后24h，刮取細(xì)胞，離心棄上清

4.細(xì)胞沉淀用WB及IP細(xì)胞裂解液冰上裂解5min，然后12000rpm 4℃離心5min，上清轉(zhuǎn)移至另一新的EP管(當(dāng)分析蛋白核漿分布時(shí)如圖7，需分別提取胞漿和胞核蛋白，具體方法參照附件胞漿和胞核蛋白提取試劑盒，本實(shí)施例使用的是EnoGene^TMNuclear and Cytoplasmic Protein Extraction Kit試劑盒)

5.上清用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度(方法見附件BCA測(cè)定蛋白濃度步驟)，并加入蛋白上樣緩沖液于100℃煮沸5min

6.取40ug蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)印至NC膜上，以EGFP單抗和GAPDH單抗為一抗，HRP-羊抗鼠lgG為二抗，ECL化學(xué)發(fā)光法曝光顯色，分析目的蛋白表達(dá)變化。(分析核漿定位時(shí)，分別提取胞漿和胞核蛋白，用EGFP單抗檢測(cè)ORF3-EGFP融合蛋白，H2A作為胞核蛋白內(nèi)參，GAPDH作為胞漿蛋白內(nèi)參。目的條帶用Image-Pro Plus軟件進(jìn)行灰度分析并用GraphPad軟件分析ORF3蛋白胞核胞漿分布比例)

結(jié)果如圖2所示，免疫印跡結(jié)果的目的條帶用Image-Pro Plus軟件進(jìn)行灰度分析并用GraphPad軟件分析ORF3蛋白胞核胞漿分布比例，圖2的結(jié)果顯示2倍NLS所引導(dǎo)的EGFP蛋白在細(xì)胞核中的比例遠(yuǎn)高于1倍或3倍NLS引導(dǎo)序列。

許多信號(hào)通路激活的最終結(jié)果都可引起細(xì)胞的基因表達(dá)發(fā)生改變，這通常需要在信號(hào)通路被激活時(shí)，該級(jí)聯(lián)中的某種蛋白從細(xì)胞質(zhì)移位到細(xì)胞核中，通過作用于其下游底物引起特異性的基因轉(zhuǎn)錄。真核細(xì)胞可以通過多種機(jī)制迅速誘導(dǎo)蛋白質(zhì)從胞質(zhì)移位入核。影響蛋白質(zhì)在胞質(zhì)和胞核中分布主要包括兩個(gè)因素，即與核轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)器或錨定蛋白的相互作用。對(duì)于某種信號(hào)蛋白而言，如果其分布于胞質(zhì)中，且核輸入速率低于核輸出速率，那么當(dāng)其與輸入受體-輸入素的結(jié)合增加，與輸出受體-輸出素的結(jié)合降低，或兩者同時(shí)存在時(shí)將迅速移位入核。

蛋白進(jìn)出細(xì)胞核都必須通過NPC，小于50kD的分子能通過核孔自由擴(kuò)散進(jìn)出核，而大一些的分子則需要一個(gè)NLS。NLS一般具有如下特征：(1)長(zhǎng)度一般小于20個(gè)氨基酸；(2)在蛋白入核內(nèi)后不被移除；(3)通常富含帶正電的(堿性)氨基酸。除此之外，NLS之間不存在一致的序列。核輸入過程可分為三個(gè)步驟。首先，位于胞質(zhì)中的貨物(需要移位入核的蛋白質(zhì)，具有NLS或與具有NLS的蛋白質(zhì)結(jié)合)與輸入素結(jié)合，形成的貨物-輸入素復(fù)合體，隨后被靶向到NPC上。移位過程需要小分子量GTP酶Ran、GTP的參與和生理溫度，目前該過程的具體機(jī)制尚未闡明。入核后，貨物-輸入素復(fù)合體在Ran GTP與輸入素結(jié)合后解離。貨物在核中被卸下，而輸入素返回到胞質(zhì)中進(jìn)行下一輪的轉(zhuǎn)運(yùn)。因而，NLS對(duì)于蛋白質(zhì)移位入核具有重要作用。

Seternes等利用三個(gè)串聯(lián)重復(fù)NLS序列與EGFP融合的真核表達(dá)載體證實(shí)了p38通過與其下游底物MK5的結(jié)合和對(duì)其的激活來參與其核-胞質(zhì)分布的調(diào)控。本發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)兩個(gè)串聯(lián)重復(fù)的RRLRTCNCRACRTLKH增加了EGFP融合蛋白在細(xì)胞核中的表達(dá)，對(duì)其在重組表達(dá)載體中提供了新的用途。

序列表

<110> 臨沂大學(xué)

<120> 鴨圓環(huán)病毒ORF3蛋白核定位NLS序列及其應(yīng)用

<130> 無

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> misc_feature

<222> (1)..(32)

<223>根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求而設(shè)計(jì)，作為質(zhì)粒構(gòu)建引物FJ-ORF3-F

<400> 1

cggaattcac catgtcgcat cggcgaactg gg 32

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> misc_feature

<222> (1)..(30)

<223>根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求而設(shè)計(jì)，作為質(zhì)粒構(gòu)建引物FJ-ORF3-R

<400> 2

cgggatcccc tttgaagatt atgttcatgt 30

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> misc_feature

<222> (1)..(30)

<223>根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求而設(shè)計(jì)，作為質(zhì)粒構(gòu)建引物FJ-ORF3-ΔC-R

<400> 3

cgggatcctc gtcggagagg aaaagggcgc 30

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> misc_feature

<222> (1)..(32)

<223>根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求而設(shè)計(jì)，作為質(zhì)粒構(gòu)建引物WF-ORF3-F

<400> 4

cggaattcac catgtcgctt cggccagatc ag 32

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> misc_feature

<222> (1)..(30)

<223>根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求而設(shè)計(jì)，作為質(zhì)粒構(gòu)建引物WF-ORF3-R

<400> 5

cgggatcctc gtcggcgagg agaagggcgc 30

<210> 6

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> misc_feature

<222> (1)..(37)

<223>根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求而設(shè)計(jì)，作為突變引物FJ-ORF3-ΔC-F

<400> 6

cccttttcct ctccgacgag gtaccgcggg cccggga 37

<210> 7

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> misc_feature

<222> (1)..(37)

<223>根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求而設(shè)計(jì)，作為突變引物FJ-ORF3-ΔC-R

<400> 7

tcccgggccc gcggtacctc gtcggagagg aaaaggg 37

<210> 8

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> misc_feature

<222> (1)..(36)

<223>根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求而設(shè)計(jì)，作為突變引物FJ-ORF3-Δ81-98-F

<400> 8

cctctccgac gattgcgagg taccgcgggc ccggga 36

<210> 9

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> misc_feature

<222> (1)..(36)

<223>根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求而設(shè)計(jì)，作為突變引物FJ-ORF3-Δ81-98-R

<400> 9

tcccgggccc gcggtacctc gcaatcgtcg gagagg 36

<210> 10

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> misc_feature

<222> (1)..(38)

<223>根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求而設(shè)計(jì)，作為突變引物FJ-ORF3-R70A-F

<400> 10

ctgaaggtga ggtgtacgct tcgcgccctt ttcctctc 38

<210> 11

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> misc_feature

<222> (1)..(38)

<223>根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求而設(shè)計(jì)，作為突變引物FJ-ORF3-R70A-R

<400> 11

gagaggaaaa gggcgcgaag cgtacacctc accttcag 38

<210> 12

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> misc_feature

<222> (1)..(37)

<223>根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求而設(shè)計(jì)，作為突變引物FJ-ORF3-Δ86-98-F

<400> 12

gcgaacttgc aattgtcgag gtaccgcggg cccggga 37

<210> 13

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> misc_feature

<222> (1)..(37)

<223>根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求而設(shè)計(jì)，作為突變引物FJ-ORF3-Δ86-98-R

<400> 13

tcccgggccc gcggtacctc gacaattgca agttcgc 37

<210> 14

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> misc_feature

<222> (1)..(37)

<223>根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求而設(shè)計(jì)，作為突變引物FJ-ORF3-Δ89-98-F

<400> 14

caattgtcga gcgtgcagag gtaccgcggg cccggga 37

<210> 15

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> misc_feature

<222> (1)..(37)

<223>根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求而設(shè)計(jì)，作為突變引物FJ-ORF3-Δ89-98-R

<400> 15

tcccgggccc gcggtacctc tgcacgctcg acaattg 37

<210> 16

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> misc_feature

<222> (1)..(36)

<223>根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求而設(shè)計(jì)，作為突變引物FJ-ORF3-Δ92-98-F

<400> 16

gcgtgcagaa ctctaaaagg taccgcgggc ccggga 36

<210> 17

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> misc_feature

<222> (1)..(36)

<223>根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求而設(shè)計(jì)，作為突變引物FJ-ORF3-Δ92-98-R

<400> 17

tcccgggccc gcggtacctt ttagagttct gcacgc 36

<210> 18

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> misc_feature

<222> (1)..(34)

<223>根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求而設(shè)計(jì)，作為突變引物R72A-F

<400> 18

gtgaggtgta ccgttcggcc ccttttcctc tccg 34

<210> 19

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> misc_feature

<222> (1)..(34)

<223>根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求而設(shè)計(jì)，作為突變引物R72A-R

<400> 19

cggagaggaa aaggggccga acggtacacc tcac 34

<210> 20

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> misc_feature

<222> (1)..(34)

<223>根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求而設(shè)計(jì)，作為突變引物FJ-ORF3-R77A-F

<400> 20

gcgccctttt cctctcgcac gattgcgaac ttgc 34

<210> 21

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> misc_feature

<222> (1)..(34)

<223>根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求而設(shè)計(jì)，作為突變引物FJ-ORF3-R77A-R

<400> 21

gcaagttcgc aatcgtgcga gaggaaaagg gcgc 34

<210> 22

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> misc_feature

<222> (1)..(35)

<223>根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求而設(shè)計(jì)，作為突變引物FJ-ORF3-R78A-F

<400> 22

gcccttttcc tctccgagca ttgcgaactt gcaat 35

<210> 23

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> misc_feature

<222> (1)..(35)

<223>根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求而設(shè)計(jì)，作為突變引物FJ-ORF3-R78A-R

<400> 23

attgcaagtt cgcaatgctc ggagaggaaa agggc 35

<210> 24

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> misc_feature

<222> (1)..(38)

<223>根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求而設(shè)計(jì)，作為突變引物FJ-ORF3-R77/78A-F

<400> 24

cgcccttttc ctctcgcagc attgcgaact tgcaattg 38

<210> 25

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> misc_feature

<222> (1)..(38)

<223>根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求而設(shè)計(jì)，作為突變引物FJ-ORF3-R77/78A-R

<400> 25

caattgcaag ttcgcaatgc tgcgagagga aaagggcg 38

<210> 26

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> misc_feature

<222> (1)..(57)

<223>根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求而設(shè)計(jì)，作為引物NLS-F1

<400> 26

aattcatgcg acgattgcga acttgcaatt gtcgagcgtg cagaactcta aaacatg 57

<210> 27

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> misc_feature

<222> (1)..(57)

<223>根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求而設(shè)計(jì)，作為引物NLS-R1

<400> 27

gatccatgtt ttagagttct gcacgctcga caattgcaag ttcgcaatcg tcgcatg 57

<210> 28

<211> 108

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> misc_feature

<222> (1)..(108)

<223>根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求而設(shè)計(jì)，作為引物NLS-F2

<400> 28

aattcatgcg acgattgcga acttgcaatt gtcgagcgtg cagaactcta aaacatatgc 60

gacgattgcg aacttgcaat tgtcgagcgt gcagaactct aaaacatg 108

<210> 29

<211> 108

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> misc_feature

<222> (1)..(108)

<223>根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求而設(shè)計(jì)，作為引物NLS-R2

<400> 29

gatccatgtt ttagagttct gcacgctcga caattgcaag ttcgcaatcg tcgcatatgt 60

tttagagttc tgcacgctcg acaattgcaa gttcgcaatc gtcgcatg 108

<210> 30

<211> 159

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> misc_feature

<222> (1)..(159)

<223>根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求而設(shè)計(jì)，作為引物引物NLS-F3

<400> 30

aattcatgcg acgattgcga acttgcaatt gtcgagcgtg cagaactcta aaacatatgc 60

gacgattgcg aacttgcaat tgtcgagcgt gcagaactct aaaacatatg cgacgattgc 120

gaacttgcaa ttgtcgagcg tgcagaactc taaaacatg 159

<210> 31

<211> 159

<212> DNA

<213> 人工序列

<221> misc_feature

<222> (1)..(159)

<223>根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求而設(shè)計(jì)，作為引物NLS-R3

<400> 31

gatccatgtt ttagagttct gcacgctcga caattgcaag ttcgcaatcg tcgcatatgt 60

tttagagttc tgcacgctcg acaattgcaa gttcgcaatc gtcgcatatg ttttagagtt 120

ctgcacgctc gacaattgca agttcgcaat cgtcgcatg 159