本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及植物抗逆性相關(guān)蛋白GhMYB4及編碼基因與應(yīng)用，特別涉及來(lái)源于陸地棉的抗逆性相關(guān)蛋白GhMYB4及編碼基因與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

世界上存在大面積的鹽漬化的土地。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界共有8億hm²鹽堿地，在灌溉地區(qū)還有占耕地面積33％的次生鹽漬化土地，土壤的鹽潰化嚴(yán)重影響現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展。就我國(guó)而言，在全國(guó)18億畝耕地中有近十分之一的次生鹽潰化土地，另外還有2000萬(wàn)hm²鹽堿荒地。一般來(lái)說(shuō)，鹽濃度在0.2％-0.5％會(huì)影響作物的生長(zhǎng)，但是鹽堿地的鹽分大都在0.6％-10％。大面積的鹽漬化土地的存在嚴(yán)重影響了糧食生產(chǎn)，成為限制農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要因素。

并且隨著全球氣候的變化異常、生態(tài)平衡的破壞以及人口數(shù)量的急劇增長(zhǎng)，水資源匱乏也已成為當(dāng)今農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展面臨的最嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)之一。FAO調(diào)查結(jié)果顯示，干旱脅迫是造成發(fā)展中國(guó)家糧食安全最主要的原因，對(duì)糧食生產(chǎn)造成的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)洪澇、地震、臺(tái)風(fēng)、泥石流等自然災(zāi)害(FAOSTAT，2006)。由于全球氣候變化異常、降雨年際變化大以及降雨時(shí)空分布不均勻等因素的影響，我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)受干旱災(zāi)害的影響越來(lái)越嚴(yán)重，糧食安全面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。

植物的生長(zhǎng)發(fā)育與外界環(huán)境密切相關(guān)，植物的各個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育階段都會(huì)受到各種逆境脅迫影響，包括非生物脅迫和生物脅迫。非生物脅迫如干旱、高鹽、低溫等是制約植物生長(zhǎng)、降低農(nóng)作物產(chǎn)量與質(zhì)量的重要因素。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，由非生物脅迫造成的作物產(chǎn)量的損失使得全球主要農(nóng)作物的平均產(chǎn)量減少50％以上。植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化及適應(yīng)過(guò)程中，逐步形成了一系列抵御外界不良環(huán)境變化的機(jī)制。植物的抗逆機(jī)理相當(dāng)復(fù)雜，它涉及到生長(zhǎng)發(fā)育、形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理特征以及代謝調(diào)節(jié)等諸多方面。當(dāng)植物受到鹽脅迫時(shí)，植物的形態(tài)、生理生化等方面都會(huì)發(fā)生一系列的變化，才能維持其生存。鹽害抑制植物組織、器官的生長(zhǎng)和分化，影響植物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞膜透性增大，降低光合速率，導(dǎo)致大量電解質(zhì)和非電解質(zhì)外滲，膜脂組分發(fā)生改變，膜蛋白的組分和活性受到影響，進(jìn)而影響植物的生理代謝。

植物在逆境脅迫條件下，會(huì)采用一定的策略去阻止或減輕脅迫帶來(lái)的的危害，在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中，植物發(fā)展出了一系列的抗逆機(jī)制。隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，植物抗逆生理生化機(jī)制日益明確，使得克隆與植物抗逆相關(guān)基因成為可能。加強(qiáng)植物抗逆生理的研究，探明植物在逆境下的生命活動(dòng)規(guī)律并加以人為調(diào)控，培育具有抵抗不良環(huán)境性狀的優(yōu)良品種，以提高作物的產(chǎn)量和品質(zhì)，對(duì)于獲得農(nóng)業(yè)高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)具有重要意義。

棉花是重要的纖維和油料作物之一，是中度耐鹽作物，被作為鹽堿地的先鋒作物。近年來(lái)，我國(guó)棉區(qū)逐漸向西北內(nèi)陸鹽堿旱地以及濱海地區(qū)轉(zhuǎn)移；因此，我國(guó)鹽堿地、旱地種植棉面積不斷擴(kuò)大。培育高度耐鹽抗旱、農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量性狀優(yōu)良的棉花新材料，是目前棉花育種工作中迫切需要解決的問(wèn)題，提高棉花抗逆性具有重要的理論及現(xiàn)實(shí)意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

技術(shù)問(wèn)題：為了解決現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供了一種植物抗逆性相關(guān)蛋白及其編碼基因，還提供了上述蛋白的應(yīng)用。

技術(shù)方案：本發(fā)明提供的與植物抗逆性相關(guān)蛋白，其名稱(chēng)為GhMYB4(MYB轉(zhuǎn)錄因子)，來(lái)源于陸地棉(Gossypiumhirsutum)，是如下(a)或(b)：

a)由序列表中序列SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；

b)將序列表中序列SEQ ID NO：2的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗逆性相關(guān)的由SEQ ID NO：2衍生的蛋白質(zhì)。

本發(fā)明還提供了編碼蛋白GhMYB4的基因。

所述基因，是如下(i)-(iii)中任何一種的DNA分子；

i.其核苷酸序列為SEQ ID NO：1所示的DNA分子；

ii.在嚴(yán)格條件下與(1)限定的DNA序列雜交且編碼植物抗逆性相關(guān)蛋白的DNA分子；

iii.與(1)或(2)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或者至少具有99％同源性且編碼植物抗逆性相關(guān)蛋白的DNA分子。

上述嚴(yán)格條件可為用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下雜交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

序列表中的序列SEQ ID NO：1由1224個(gè)堿基組成，編碼序列表中序列SEQ ID NO：2所示的蛋白。

本發(fā)明還提供了含有所述與植物抗逆性相關(guān)蛋白的編碼基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。

所述重組載體為將上述基因插入表達(dá)載體中即得。

具體地，所述重組載體是在載體pCBGUS的多克隆位點(diǎn)間插入所述編碼基因得到的。

其中，所述載體pCBGUS是通過(guò)包括如下步驟的方法得到的：

(1)將pCAMBIA1301載體經(jīng)過(guò)HindIII和EcoRI雙酶切，回收載體大片段；

(2)將pBI121載體經(jīng)過(guò)HindIII和EcoRI雙酶切，回收包含gusA基因的片段；

(3)將步驟(1)中回收的載體大片段與步驟(2)中回收的包含gusA基因的片段連接，得到重組載體pCBGUS。

所述pCAMBIA1301載體購(gòu)自CAMBIA公司；所述pBI121載體購(gòu)自Clontech公司。

本發(fā)明還提供了擴(kuò)增所述與植物抗逆性相關(guān)蛋白的編碼基因全長(zhǎng)或其任意片段的引物對(duì)。

具體地，所述引物對(duì)序列如下：

GhMYB4-GC-F：5’-CACATAGGGAGATGGGGAGG-3’

GhMYB4-GC-R：5’-CAGTTTACAAAGAAAACAAAGCA-3’

本發(fā)明還提供了蛋白GhMYB4、其編碼基因或其重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌在提高植物耐鹽性中的應(yīng)用；所述植物為雙子葉植物或單子葉植物；所述雙子葉植物為擬南芥和水稻。

本發(fā)明還提供了一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括以下步驟：將上述蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参?，即得?/p>

具體地，上述蛋白的編碼基因是通過(guò)上述的重組載體導(dǎo)入目的植物；所述植物具體為雙子葉植物或單子葉植物；所述雙子葉植物為擬南芥和水稻。

有益效果：本發(fā)明提供的GhMYB4基因所編碼的蛋白可以提高植物的抗逆性，具有重要的應(yīng)用價(jià)值，為提高植物抗逆性的研究提供重要的依據(jù)。

本發(fā)明的蛋白及其編碼基因?qū)ε嘤鼓嫘灾参锲贩N具有重要的應(yīng)用價(jià)值，從而提高農(nóng)作物產(chǎn)量具有重要意義，將在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用空間和市場(chǎng)前景。

附圖說(shuō)明

圖1本發(fā)明陸地棉GhMYB4基因植物表達(dá)載體簡(jiǎn)圖。

圖2本發(fā)明GhMYB4轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的PCR檢測(cè)結(jié)果圖。

圖3本發(fā)明GhMYB4轉(zhuǎn)基因擬南芥植株在200mMNaCl和25％PEG6000的MS培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)和生根情況，WT為野生型擬南芥植株，#3和#6為轉(zhuǎn)基因擬南芥植株。

圖4本發(fā)明GhMYB4轉(zhuǎn)基因擬南芥植株抗逆性和抗旱性盆栽鑒定，WT為野生型擬南芥植株，#3和#6為轉(zhuǎn)基因擬南芥植株。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但不限制本發(fā)明。

下述實(shí)施例中，所用的試驗(yàn)材料及其來(lái)源包括：

陸地棉(Gossypiumhirsutum)品種‘中G5’，由淮陰工學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院江蘇省植物生產(chǎn)與加工實(shí)踐教育中心實(shí)驗(yàn)室保存。

擬南芥(Arabidopsis thaliana)的種子經(jīng)過(guò)2.5％(v/v)CaClO₂消毒后種植在黑土：蛭石：珍珠巖(1:1:1)的混合基質(zhì)中，22℃，16h光照培養(yǎng)(16h光照，8h黑暗，冷光源)生長(zhǎng)2周。

大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α由淮陰工學(xué)院生命科學(xué)與食品工程學(xué)院江蘇省植物生產(chǎn)與加工實(shí)踐教育中心實(shí)驗(yàn)室保存?？寺≥d體PMD-18-Simple T、各類(lèi)限制性內(nèi)切酶、Taq聚合酶、連接酶、dNTP、10×PCR buffer和DNA marker購(gòu)自寶生物工程大連有限公司。所有的化學(xué)試劑都從美國(guó)西格瑪化學(xué)公司和上海國(guó)藥化學(xué)試劑公司購(gòu)買(mǎi)。

本發(fā)明中常規(guī)的分子生物學(xué)操作具體參見(jiàn)《分子克隆》【Molecular Cloning.2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989】。

下述實(shí)施例中常規(guī)的基因操作參照分子克隆文獻(xiàn)進(jìn)行【Sambook J,Frets EF,Mannsdes T et al.In:Molecular Cloning.2nd ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989】。

實(shí)施例1陸地棉抗逆性相關(guān)的蛋白及其編碼基因的獲得

1.實(shí)驗(yàn)材料

參照Z(yǔ)hang等(2011)【Zhang X,Zhen J,Li Z,Kang D,Yang Y,KongJ,Hua J.Expression profile of early responsive genes under salt stress in upland cotton(Gossypiumhirsutum L.).Plant Molecular Biology Reporter,2011,29(3):626-637】的方法，將陸地棉品種‘中G5’的水培苗材料取下，液氮速凍，-80℃保存。

2.葉片總RNA提取和純化

取中G5葉片約2.0g，在液氮中研磨成粉狀，加入10mL離心管，用Applygen植物RNA提取試劑盒(Applygen Technologies Inc，Beijing)提取甘薯塊根總RNA，試劑盒中包括：Plant RNA Reagent，植物組織裂解、分離RNA、去除植物多糖和多酚；Extraction Reagent，有機(jī)抽提去除蛋白質(zhì)、DNA、多糖和多酚；Plant RNA Aid，去除植物多糖多酚和次生代謝產(chǎn)物。利用QIAGEN Oligotex Mini mRNA Kit(QIAGEN，GmbH，Germany)從總RNA中純化mRNA。最后，取1μL于1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，另取2μL稀釋至500μL，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)其質(zhì)量(OD260)和純度(OD260/OD280)，提取的PN40024無(wú)菌苗葉片總RNA，經(jīng)非變性膠瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，28S和18S條帶清晰，且二者亮度比值為1.5～2︰1，表明總RNA沒(méi)有降解，純化所得mRNA符合實(shí)驗(yàn)要求，可用于葡萄GhMYB4蛋白cDNA全長(zhǎng)的克隆。

3.GhMYB4蛋白cDNA的全長(zhǎng)克隆

以NCBI(National Center for Biotechnology Information)上的GhMYB4的cDNA序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行GhMYB4蛋白cDNA的全長(zhǎng)克隆。

引物序列如下：

GhMYB4-GC-F：5’-CACATAGGGAGATGGGGAGG-3’

GhMYB4-GC-R：5’-CAGTTTACAAAGAAAACAAAGCA-3’

以中G5葉片總RNA經(jīng)Oligo(dT)反轉(zhuǎn)錄為模板，用高保真的FastPfu酶，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR條件為95℃1min，隨后95℃20s，53℃20s和72℃1min，進(jìn)行36個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5min。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，獲得1362bp長(zhǎng)度的擴(kuò)增片段。

綜合上述步驟的結(jié)果，獲得了目的cDNA序列，其核苷酸序列如序列表中序列SEQ ID NO 1所示。序列表中序列SEQ ID NO 1由1362個(gè)堿基組成，自5’端第1位-第1362位堿基為其開(kāi)放閱讀框，編碼具有序列表中序列SEQ ID NO 2所示的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。序列表中序列SEQ ID NO 2由453個(gè)氨基酸殘基組成。將該基因命名為GhMYB4，將其編碼的蛋白命名為GhMYB4。

實(shí)施例2 GhMYB4基因過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建

將實(shí)施例1中測(cè)序鑒定正確的含有序列表SEQ ID NO 1所示核苷酸的DNA片段用BamHI和SacI進(jìn)行雙酶切，用1％瓊脂糖凝膠回收DNA片段，通過(guò)T₄DNA連接酶將回收的GhMYB4基因片段與含有雙35S啟動(dòng)子pYPx245質(zhì)粒連接，酶切鑒定和序列分析測(cè)定獲得了含有葡萄GhMYB4基因的重組質(zhì)粒AH128。該表達(dá)載體還包含gusA報(bào)告基因和帶內(nèi)含子卡那霉素抗性標(biāo)記基因，載體如圖1所示。

實(shí)施例3 GhMYB4基因轉(zhuǎn)化擬南芥

將實(shí)施例2構(gòu)建的葡萄GhMYB4基因的植物表達(dá)載體pCAMBIA1301-GhMYB4用蘸花法轉(zhuǎn)化擬南芥，具體方法如下：

1.農(nóng)桿菌的準(zhǔn)備

(1)將pCAMBIA1301-GhMYB4用電擊法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌LBA4404菌株(Biovector Co.,LTD)，得到含有pCAMBIA1301-GhMYB4的重組農(nóng)桿菌，并涂布于含有卡那霉素抗性的平板篩選轉(zhuǎn)化子。

(2)挑取農(nóng)桿菌單菌接種于5mL LB液體培養(yǎng)基(利福平50μg/mL，氯霉素100μg/mL)中，28℃，250rpm培養(yǎng)20h。

(3)取1mL菌液轉(zhuǎn)接入20-30mL LB液體培養(yǎng)基(利福平50μg/mL，氯霉素100μg/mL)中，28℃，250rpm培養(yǎng)約12h，測(cè)OD 600≈1.5。

(4)8000rpm，4℃，10min離心收集菌體，重懸于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化滲透液(5％蔗糖，0.05％Silwet L-77)并稀釋至OD 600≈0.8。

2.擬南芥蘸花法轉(zhuǎn)化

(1)將擬南芥的花薹浸入上述侵染液中，輕輕攪動(dòng)約10s后取出，全部轉(zhuǎn)化完畢后，用保鮮袋罩住擬南芥，以保持濕潤(rùn)環(huán)境，水平放置，22℃避光培養(yǎng)，24h后去掉保鮮袋直立培養(yǎng)。

(2)初次轉(zhuǎn)化四天后，可再進(jìn)行一次轉(zhuǎn)化，重復(fù)兩次，總共轉(zhuǎn)化三次，這樣可以對(duì)花序上發(fā)育的不同時(shí)期的花蕾進(jìn)行轉(zhuǎn)化，提高轉(zhuǎn)化效率。

(3)生長(zhǎng)約兩個(gè)月后，收集種子，4℃冰箱儲(chǔ)存待用。

經(jīng)過(guò)蘸花法轉(zhuǎn)化的擬南芥生長(zhǎng)約兩個(gè)月后，正常開(kāi)花結(jié)子。

實(shí)施例4 GhMYB4基因轉(zhuǎn)基因擬南芥植株P(guān)CR檢測(cè)

1.轉(zhuǎn)基因擬南芥種子的篩選

(1)稱(chēng)25-30mg種子放入1.5mL離心管。

(2)1mL 75％乙醇消毒1min(不停搖晃振蕩)，8000rpm離心5s，去上清。

(3)加入1mL過(guò)濾后的漂白粉(2.5％)消毒15min(不停搖晃振蕩，充分消毒)，8000rpm離心5s，去上清。

(4)無(wú)菌水洗滌3-4次。

(5)將種子均勻的播撒到1/2MS平板(潮霉素50μg/mL)上，Parafilm膜封口，4℃冰箱放置兩天，22℃，16h光照培養(yǎng)10天。

(6)將抗性植株移栽到盆中培養(yǎng)，苗稍大后，進(jìn)行GUS活性檢測(cè)，選出陽(yáng)性植株(T₁)培養(yǎng)至開(kāi)花結(jié)實(shí)，收集T₁植株上所結(jié)T₂種子，進(jìn)一步篩選得到T₃種子。

2.轉(zhuǎn)基因擬南芥植株P(guān)CR檢測(cè)

(1)試驗(yàn)方法

用CTAB法提取T₃擬南芥轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株的基因組DNA。用常規(guī)方法進(jìn)行PCR檢測(cè)，所使用的GhMYB4基因引物為：Primer 1：5’-GAACTCGCCGTAAAGACTGG-3’和Primer2：5’-AAGAAAACAAAGCATCAGAATTGAA-3’。在0.2mL Eppendorf離心管中加入10×PCR buffer 2μL、4dNTP(10mol/L)1μL、引物(10μmol/L)均為1μL、模板DNA(50ng/uL)2μL、Taq DNA聚合酶0.25μL，加ddH₂O至總體積20μL。反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，55℃復(fù)性30s，72℃延伸2min，共35個(gè)循環(huán)。

(2)試驗(yàn)結(jié)果

電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖2(圖2中，泳道M為Maker；泳道W：水；泳道P：陽(yáng)性對(duì)照(重組質(zhì)粒pCAMBIA1301-GhMYB4)；泳道Col-0：野生型擬南芥植株；泳道#2、#3、#4、#6：為轉(zhuǎn)化pCAMBIA1301-GhMYB4的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株)。從圖中可見(jiàn)，轉(zhuǎn)化pCAMBIA1301-GhMYB4的擬南芥擬轉(zhuǎn)基因植株和陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增出1423bp的目標(biāo)條帶，表明GhMYB4基因已經(jīng)整合到擬南芥的基因組中，并證明這些再生植株為轉(zhuǎn)基因植株；野生型擬南芥植株沒(méi)有擴(kuò)增出1423bp的目標(biāo)條帶。轉(zhuǎn)基因植株為后續(xù)功能分析。

實(shí)施例5 GhMYB4基因轉(zhuǎn)基因擬南芥植株耐鹽性和抗旱性鑒定

1.轉(zhuǎn)基因植株耐鹽性和抗旱性離體鑒定

(1)試驗(yàn)方法

將轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型種子，消毒滅菌后播種繼代培養(yǎng)于200mMNaCl和25％PEG6000的1/2MS培養(yǎng)基上，脅迫培養(yǎng)2周后，觀察擬南芥植株的生長(zhǎng)狀態(tài)和生根情況。

(2)試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的生長(zhǎng)狀態(tài)和生根情況顯著優(yōu)于野生型植株，轉(zhuǎn)基因植株根長(zhǎng)和植株鮮重均顯著優(yōu)于野生型植株(圖3)，表明轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性和抗旱性較野生性有顯著提高。

2.轉(zhuǎn)基因植株耐鹽性和抗旱性盆栽鑒定

(1)試驗(yàn)方法

將轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型種子在1/2MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)2周后，將植株移栽到盆中培養(yǎng)2周后，進(jìn)行鹽、干旱脅迫處理。用含有300mMNaCl的1/2霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液每個(gè)2天灌溉1次，每次200mL，處理4周，觀察植株生長(zhǎng)情況并統(tǒng)計(jì)存活率；干旱處理6周后，觀察植株生長(zhǎng)情況并統(tǒng)計(jì)存活率。

(2)試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果顯示，通過(guò)耐鹽性和抗旱性盆栽鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖4，鹽處理4周或干旱處理6周后，轉(zhuǎn)基因植株的生長(zhǎng)狀態(tài)顯著優(yōu)于野生型植株，轉(zhuǎn)基因植株的存活率顯著高于野生性植株。表明過(guò)表達(dá)GhMYB4基因顯著提高轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的耐鹽性和抗旱性。

SEQUENCE LISTING

<110> 淮陰工學(xué)院

<120> 植物抗逆性相關(guān)蛋白GhMYB4及編碼基因與應(yīng)用

<130> 20170110001

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1362

<212> DNA

<213> 棉花（Gossypiumhirsutum）

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1362)

<400> 1

atggggaggg cgccttgttg cgaaaaagtg gggttgaaga aggggagatg gacggcggaa 60

gaggatgtgt tattgaccaa gtatattcaa gctaacggtg aaggctcctg gagatcatta 120

cccaagaatg caggattact gaggtgtggg aagagttgca gactaaggtg gattaattac 180

ttgagagctg acttgaaaag gggaaacttt acttcccaag aggaagaagt catcattaac 240

ttgcatgcta ctttgggaaa taggtggtct ttaattgcca gttacttacc aggaagaaca 300

gacaacgaga ttaagaacta ttggaactct catttgagta gaaaaatcca tagctttaga 360

aggccattaa ctcaaagcat gccagtcatc atggacctca ccaagacggc cgtgattgct 420

aagcggaaag gaggtagaac tagcgaaggg tcgatgaagg aaaacaaaag ctgcagtacc 480

cagaaagata ctggaagttg ttcaaataaa cctactgaaa acgtttgtgt taatgaagtt 540

gagccattcc catccactcc attgttagaa aaagaaacct tgtccactac agccattgaa 600

gatcgcatgg tactggatca acatggagaa gataaggaga gaacaaccca tgttgtaccc 660

agtccttgtc acgacaccgt tgttgaagga atgttgggtt caagcgagga gagagagagc 720

ctggtgactg aggaaggaac catagagaat tcaatgcagt gccctagtgg caacgctgag 780

aaagggactg gtattttagc accacatgag agtattgata gcagtgagat agagtggttt 840

aatgatatcc tggatagtga attgctacag ccaagtgggc atttgacgtt tactgaacta 900

ggagaggaca ggtggaatgt gaaaacacac acaactgcag ctaataacga ggaaatagtg 960

agtaggaact gtagtgcaga tagtggtggg gtcttgagct catgtacttc aacaacattt 1020

tactttgttg atgattggga aaatgttgtt ccaagaagtg agctttggga tgagaaggaa 1080

tacatgtgtt cttggctgtg ggagccaagc gactatcatg ggaaaggaga gagacataaa 1140

gtggatgata atggctttga ggggcacaat cccatgattg ctgctaacgt cgcttttctc 1200

ctaatgctcc tccttgttcc tcctgcttta gtgtctagct acacttccat gtcaatattt 1260

tatctaggta gacagtgtga acatgtcctg ccgttttttc tttttgtttt acttttagat 1320

tttgcttctc ttttcaattc tgatgctttg ttttctttgt aa 1362

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<213> GhMYB4

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Met Gly Arg Ala Pro Cys Cys Glu Lys Val Gly Leu Lys Lys Gly Arg

1 5 10 15

Trp Thr Ala Glu Glu Asp Val Leu Leu Thr Lys Tyr Ile Gln Ala Asn

20 25 30

Gly Glu Gly Ser Trp Arg Ser Leu Pro Lys Asn Ala Gly Leu Leu Arg

35 40 45

Cys Gly Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Ile Asn Tyr Leu Arg Ala Asp

50 55 60

Leu Lys Arg Gly Asn Phe Thr Ser Gln Glu Glu Glu Val Ile Ile Asn

65 70 75 80

Leu His Ala Thr Leu Gly Asn Arg Trp Ser Leu Ile Ala Ser Tyr Leu

85 90 95

Pro Gly Arg Thr Asp Asn Glu Ile Lys Asn Tyr Trp Asn Ser His Leu

100 105 110

Ser Arg Lys Ile His Ser Phe Arg Arg Pro Leu Thr Gln Ser Met Pro

115 120 125

Val Ile Met Asp Leu Thr Lys Thr Ala Val Ile Ala Lys Arg Lys Gly

130 135 140

Gly Arg Thr Ser Glu Gly Ser Met Lys Glu Asn Lys Ser Cys Ser Thr

145 150 155 160

Gln Lys Asp Thr Gly Ser Cys Ser Asn Lys Pro Thr Glu Asn Val Cys

165 170 175

Val Asn Glu Val Glu Pro Phe Pro Ser Thr Pro Leu Leu Glu Lys Glu

180 185 190

Thr Leu Ser Thr Thr Ala Ile Glu Asp Arg Met Val Leu Asp Gln His

195 200 205

Gly Glu Asp Lys Glu Arg Thr Thr His Val Val Pro Ser Pro Cys His

210 215 220

Asp Thr Val Val Glu Gly Met Leu Gly Ser Ser Glu Glu Arg Glu Ser

225 230 235 240

Leu Val Thr Glu Glu Gly Thr Ile Glu Asn Ser Met Gln Cys Pro Ser

245 250 255

Gly Asn Ala Glu Lys Gly Thr Gly Ile Leu Ala Pro His Glu Ser Ile

260 265 270

Asp Ser Ser Glu Ile Glu Trp Phe Asn Asp Ile Leu Asp Ser Glu Leu

275 280 285

Leu Gln Pro Ser Gly His Leu Thr Phe Thr Glu Leu Gly Glu Asp Arg

290 295 300

Trp Asn Val Lys Thr His Thr Thr Ala Ala Asn Asn Glu Glu Ile Val

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Ser Arg Asn Cys Ser Ala Asp Ser Gly Gly Val Leu Ser Ser Cys Thr

325 330 335

Ser Thr Thr Phe Tyr Phe Val Asp Asp Trp Glu Asn Val Val Pro Arg

340 345 350

Ser Glu Leu Trp Asp Glu Lys Glu Tyr Met Cys Ser Trp Leu Trp Glu

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Pro Ser Asp Tyr His Gly Lys Gly Glu Arg His Lys Val Asp Asp Asn

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Gly Phe Glu Gly His Asn Pro Met Ile Ala Ala Asn Val Ala Phe Leu

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Leu Met Leu Leu Leu Val Pro Pro Ala Leu Val Ser Ser Tyr Thr Ser

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Met Ser Ile Phe Tyr Leu Gly Arg Gln Cys Glu His Val Leu Pro Phe

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Phe Leu Phe Val Leu Leu Leu Asp Phe Ala Ser Leu Phe Asn Ser Asp

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Ala Leu Phe Ser Leu

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<212> DNA

<213> GhMYB4-GC-R

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cagtttacaa agaaaacaaa gca 23