本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地涉及調(diào)節(jié)糖代謝的多肽及其在制備用于治療與糖代謝異常有關(guān)之疾病的藥物中的用途。

背景技術(shù)：

糖尿病是世界范圍內(nèi)主要且日益增長的健康問題。糖尿病是一種體內(nèi)胰島素相對或絕對不足或靶細胞對胰島素敏感性降低，或胰島素本身存在結(jié)構(gòu)上的缺陷而引起的碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂的一種慢性疾病。糖尿病在臨床上表現(xiàn)為多飲、多食、多尿和體重減少，并伴隨各種并發(fā)癥如酮癥酸中毒、肢體壞疽、多發(fā)性神經(jīng)炎、失明和腎功能衰竭等。根據(jù)發(fā)病機理，將糖尿病可分為1型和2型，其中95％患者為2型。2型糖尿病又稱非胰島素依賴型糖尿病，多在35-40歲之后發(fā)病，其體內(nèi)產(chǎn)生胰島素的能力并非完全喪失甚至出現(xiàn)代償性增高，但體內(nèi)產(chǎn)生胰島素抵抗，造成相對缺乏。

現(xiàn)有治療2型糖尿病并沒有可徹底治愈的方法出現(xiàn)，而且治療藥物必須伴隨一生，并會伴有其他副作用，所以目前糖尿病的治療還有很大的缺陷，需要開發(fā)性能更優(yōu)的新藥。

骨鈣素是由成骨細胞合成和分泌的一種維生素K依賴性鈣結(jié)合蛋白，一種非膠原酸性糖蛋白，其分子中的維生素K依賴性谷氨酸殘基是骨鈣素和Ca²⁺結(jié)合的重要功能基團^[1,2]。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明人出人意料的發(fā)現(xiàn)了一種來源于骨鈣素的能夠調(diào)節(jié)糖代謝的多肽；其具有促進胰島素分泌的能力，能夠維持血糖穩(wěn)態(tài)，特別是在經(jīng)口服用的情況下，同樣可以取得良好的效果。

本發(fā)明的一些方面涉及調(diào)節(jié)糖代謝的多肽，所述多肽由式M₁-Z_a-M₂表示，其中：

M₁、M₂各自獨立地為具有不超過5、4、3、2或1個氨基酸殘基的多肽區(qū)段或者不存在；

Z_a為Tyr-Leu-X₁-X₂-X₃-X₄-Gly-Ala-X₅-X₆-Pro-X₇-Pro-Asp-X₈-Leu-Glu-Pro-X₉，其中：

X₁為Tyr、Asn、Asp或不存在，

X₂為Gln、Asn、His、Pro、Ser或不存在，

X₃為Trp、Gly或不存在，

X₄為Leu或不存在，

X₅為Pro或Ser，

X₆為Ala或Val，

X₇為Tyr或Ser，

X₈為Thr或Pro，

并且所述Z_a可任選地具有中氨基酸替換、插入或缺失并且所述氨基酸替換、插入和缺失的總數(shù)不超過4，優(yōu)選不超過3，更優(yōu)選不超過2，最優(yōu)選不超過1。

進一步地，本發(fā)明的一些實施方案中，所述多肽中的Z_a選自以下之一：

SEQ ID NO.1：YLGASVPSPDPLEP，

SEQ ID NO.2：YLYQWLGAPVPYPDPLEP

SEQ ID NO.3：YLYQWLGAPVPYPDPLEP，

SEQ ID NO.4：YLNNGLGAPAPYPDPLEP，

SEQ ID NO.5：YLYQWLGAPVPYPDTLEP，

SEQ ID NO.6：YLYQWLGAPVPYPDPLEP，

SEQ ID NO.7：YLDHWLGAPAPYPDPLEP，

SEQ ID NO.8：YLDPGLGAPAPYPDPLEP，

SEQ ID NO.9：YLDHGLGAPAPYPDPLEP，

SEQ ID NO.10：YLDQGLGAPAPAPDPLEP，

SEQ ID NO.11：YLDSGLGAPVPYPDPLEP。

進一步地，本發(fā)明的另一些實施方案中，所述多肽中的M₁、M₂均不存在；或者在又一些實施方案中，所述多肽中Z_a為YLYQWLGAPVPYPDPLEP、M₁不存在且M₂為Arg，即該多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；在又一些實施方案中，所述多肽中Z_a為YLGASVPSPDPLEP，M₁不存在且M₂為Thr，即該多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.22所示。

本發(fā)明的另一些方面涉及調(diào)節(jié)糖代謝的多肽，其包含選自以下任一序列之至少6個連續(xù)氨基酸且其氨基酸殘基總數(shù)不超過18，例如不超過17、16、15、14：

SEQ ID NO.1：YLGASVPSPDPLEP，

SEQ ID NO.2：YLYQWLGAPVPYPDPLEP

SEQ ID NO.3：YLYQWLGAPVPYPDPLEP，

SEQ ID NO.4：YLNNGLGAPAPYPDPLEP，

SEQ ID NO.5：YLYQWLGAPVPYPDTLEP，

SEQ ID NO.6：YLYQWLGAPVPYPDPLEP，

SEQ ID NO.7：YLDHWLGAPAPYPDPLEP，

SEQ ID NO.8：YLDPGLGAPAPYPDPLEP，

SEQ ID NO.9：YLDHGLGAPAPYPDPLEP，

SEQ ID NO.10：YLDQGLGAPAPAPDPLEP，

SEQ ID NO.11：YLDSGLGAPVPYPDPLEP。

進一步地，其包含以下任一：

SEQ ID NO.12：PVPYPDPLEP，

SEQ ID NO.13：PYPDPLEP，

SEQ ID NO.14：PDPLEP，

SEQ ID NO.15：SVPSPDPLEP，

SEQ ID NO.16：PSPDPLEP。

更進一步地，其為

SEQ ID NO.12：PVPYPDPLEP，

SEQ ID NO.13：PYPDPLEP，

SEQ ID NO.14：PDPLEP，

SEQ ID NO.15：SVPSPDPLEP，

SEQ ID NO.16：PSPDPLEP。

本發(fā)明的一些方面涉及本發(fā)明的多肽的可藥用鹽。

本發(fā)明的一些方面涉及這樣的本發(fā)明多肽或其可藥用鹽，其具有提高胰島素水平、降低血糖的活性。

本發(fā)明的一些方面涉及多核苷酸，其編碼本發(fā)明的多肽。

本發(fā)明的一些方面涉及載體，其包含前述的多核苷酸。

本發(fā)明的一些方面涉及宿主細胞，其轉(zhuǎn)染有前述的載體并且能夠在可表達蛋白質(zhì)的條件下產(chǎn)生本發(fā)明的多肽。

本發(fā)明的一些方面涉及藥物組合物，其包含治療有效量的前述本發(fā)明多肽或其可藥用鹽。

本發(fā)明的一些方面涉及本發(fā)明的多肽或其可藥用鹽或藥物組合物在制備用于治療與糖代謝異常有關(guān)之疾病的藥物中的用途，所述疾病為可受益于胰島素升高、血糖降低的疾病，優(yōu)選為2型糖尿病、胰島素抵抗、高血糖。

本發(fā)明的一些方面涉及治療與糖代謝異常有關(guān)之疾病的方法，其包括向由此需要的對象施用治療有效量的本發(fā)明的多肽或其可藥用鹽或藥物組合物。

本發(fā)明的一些方面涉及治療可受益于胰島素升高、血糖降低之疾病的方法，其包括向由此需要的對象施用治療有效量的本發(fā)明的多肽或其可藥用鹽或藥物組合物，所述疾病優(yōu)選為2型糖尿病。

在一些實施方案中，本發(fā)明的多肽或其可藥用鹽或藥物組合物可用于治療與糖代謝異常有關(guān)之疾病，優(yōu)選受益于胰島素升高、血糖降低的疾病，最優(yōu)選2型糖尿病。

在一些實施方案中，本發(fā)明的藥物組合物可與任何已知用于治療與糖和脂肪代謝異常有關(guān)之疾病的藥物和方法組合物一起施用。

在一些實施方案中，本發(fā)明的多肽或其可藥用鹽或藥物組合物可以通過各種常規(guī)的方式施用，優(yōu)選經(jīng)口施用。經(jīng)口施用減少了常規(guī)多肽施用的諸多不便，而且本發(fā)明多肽的殘基很少，大大降低了成本，具有作為藥物的非常顯著的潛在優(yōu)勢。

附圖說明

圖1示出了在體外實驗中證明ISAP₁可促進βTC-6細胞表達更多的胰島素mRNA，實時定量PCR分析胰島素mRNA的表達。βTC-6細胞在多肽刺激前在含1％FBS的無糖培養(yǎng)基中饑餓4小時后用不同濃度的多肽刺激1小時。所有實驗兩個并列組、重復(fù)3次。結(jié)果：平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤*:P<0.05,**:P<0.01(t檢驗)

圖2示出了ISAP₁可促使胰島表達更多的胰島素mRNA實時定量PCR分析胰島素mRNA的表達。胰島在多肽刺激前在含1％FBS的無糖培養(yǎng)基中饑餓4小時后用不同濃度的多肽刺激1小時。所有實驗兩個并列組、重復(fù)3次。結(jié)果：平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤*:P<0.05,**:P<0.01(t檢驗)

圖3示出了糖耐量檢測中，ISAP₁導(dǎo)致小鼠的血糖水平降低；(A)各時間點的趨勢圖，(B)A中結(jié)果的曲線下面積比較。

圖4示出了腹腔注射ISAP₁對肥胖-T2DM小鼠空腹血糖的影響。*P<0.05,**P<0.01；與HFD+載劑組相比。

圖5示出了腹腔注射ISAP₁對肥胖-T2DM小鼠血清中胰島素水平的影響。*P<0.05,**P<0.01

圖6示出了經(jīng)ISAP₁、OCN(小鼠骨鈣素)處理過的T2DM小鼠胰島增大。F中示出A-E的定量統(tǒng)計結(jié)果，ISAP₁、OCN均促使胰島面積增大。ISAP₁能夠顯著回復(fù)肥胖-T2DM小鼠胰腺中胰島的大小。(A)飼喂普通飼料(ND)及(B)高脂飼料(HFD)以及HFD加之每日腹腔注射(C)OCN(6pmol/g/d)或(D)ISAP₁(20pmol/g/d)或(E)ISAP₁(2pmol/g/d),(F)雙盲條件下計算出的連續(xù)切片中胰島面積。放大倍數(shù)均為40×。*:P<0.05,**:P<0.01,***:P<0.001，與HFD+載劑組相比；每組6只小鼠。

圖7示出了灌胃施用OCN、ISAP₁、ISAP₂、ISAP3對高脂飼料(HFD)的小鼠的血糖水平的影響。

圖8示出了ISAP₁和ISAP₂分別與人GPRC6A的結(jié)合及其內(nèi)化。A)人GPRC6A在Hela細胞中過表達；(B)ISAP₁、OCN和OCN-22；以及ISAP₂、hOCN和hOCN-22；與huGPRC6A過表達的Hela細胞的細胞膜的結(jié)合實驗；(C)帶有Cy-5標(biāo)記的OCN(Cy5-OCN)、帶有Cy-5標(biāo)記的OCN-22(Cy5-Ocn22)，帶有Cy-5標(biāo)記的ISAP₂(Cy5-ISAP₂)在GPRC6A過表達的Hela細胞中對GPRC6A內(nèi)化的影響。

圖9示出了灌胃施用ISAP₁、ISAP₄、ISAP₅、ISAP₆對于飼喂高脂飼料的小鼠的血糖的影響：(A)對血糖的影響，(B)對GLP1的影響。

圖10示出了來自不同物種的ISAP的序列的比較。

具體實施方式

定義

本發(fā)明的“調(diào)節(jié)糖代謝的多肽”也稱作“胰島素分泌相關(guān)多肽(Insulin Secretion Association Peptide，ISAP)”，是指來源于骨鈣素或由其衍生的能夠調(diào)節(jié)糖代謝的多肽。

本文所使用的術(shù)語“保守氨基酸替換”是指用具有相似性質(zhì)的另一個氨基酸殘基對原氨基酸序列進行的替換。例如，賴氨酸殘基、精氨酸殘基和組氨酸殘基在具有堿性側(cè)鏈方面是相似的。此外，天冬氨酸殘基和谷氨酸殘基在具有酸性側(cè)鏈方面是相似的。此外，天冬酰胺殘基、谷氨酰胺殘基、絲氨酸殘基、蘇氨酸殘基、酪氨酸殘基和半胱氨酸殘基在具有不帶電的極性側(cè)鏈方面是相似的，并且甘氨酸殘基、丙氨酸殘基、纈氨酸殘基、亮氨酸殘基、異亮氨酸殘基、脯氨酸殘基、色氨酸殘基、苯丙氨酸殘基和甲硫氨酸殘基在具有非極性側(cè)鏈方面是相似的。此外，酪氨酸殘基、苯丙氨酸殘基、色氨酸殘基和組氨酸殘基在具有芳族側(cè)鏈方面是相似的。因此，對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，在具有上述相似性質(zhì)的氨基酸組中進行的氨基酸替換不會引起性質(zhì)的任何變化。

本文中所使用的氨基酸簡寫及中文名稱對照如下

本文所使用的術(shù)語“糖代謝異常有關(guān)的疾病”是指有遺傳或環(huán)境或二者共同導(dǎo)致的以糖代謝謝紊亂為特征的疾病或其并發(fā)癥，例如但不限于2型糖尿病、高血糖、胰島素抵抗等。

具體實施方式

DMEM培養(yǎng)基購自Sigma，其中每500ml培養(yǎng)基中補充10％FBS(胎牛血清)，1％非必須氨基酸，1g葡萄糖，0.75g碳酸氫鈉，0.1g牛血清白蛋白以及1.5ml HEPES(4-羥乙基哌嗪乙磺酸)。

ISAP₁序列為Tyr-Leu-Gly-Ala-Ser-Val-Pro-Ser-Pro-Asp-Pro-Leu-Glu-Pro-Thr(SEQ ID NO.22)。ISAP₂的序列為Tyr-Leu-Tyr-Gln-Trp-Leu-Gly-Ala-Ser-Val-Pro-Ser-Pro-Asp-Pro-Leu-Glu-Pro(SEQ ID NO.2)。ISAP₃的序列為Tyr-Leu-Tyr-Gln-Trp-Leu-Gly-Ala–Ser-Val-Pro-Ser-Pro-Asp-Pro-Leu-Glu-Pro-Arg(SEQ ID NO.3)。ISAP₄序列為Ser-Val-Pro-Ser-Pro-Asp-Pro-Leu-Glu-Pro(SEQ ID NO.15)。ISAP₅序列為Pro-Ser-Pro-Asp-Pro-Leu-Glu-Pro(SEQ ID NO.16)。ISAP₆序列為Pro-Asp-Pro-Leu-Glu-Pro(SEQ ID NO.14)。

βTC-6購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，這一細胞系來源于小鼠胰腺癌并向其基因組內(nèi)導(dǎo)入了SV40(猴空泡病毒40)的大T抗原，有分泌胰島素的功能。

所有的動物實驗均通過中國科學(xué)院先進技術(shù)研究院動物倫理委員會批準(zhǔn)，按照倫理委員會的要求進行。

實施例1

ISAP₁的功能

1、ISAP₁對βTC-6細胞的影響。

實驗步驟如下：

1.細胞鋪板：將βTC-6細胞懸液以1.6×10⁵/mL的密度鋪板在24孔板中，每孔0.5mL，于37℃，5％的CO₂中培養(yǎng)24小時。

2.用無糖的DMEM將ISAP₁分別稀釋至2nmol/L、200pmol/L、20pmol/L、2pmol/L冰浴保存。

3.對βTC-6細胞進行饑餓預(yù)處理，使用KRBB緩沖液(129g NaCl,5g NaHCO₃,4.8g KCl,1.2g KH₂PO₄,1.2g MgSO₄,2.5g CaCl₂,10mM HEPES和0.1％BSA在pH 7.4)處理4小時。

4.棄去細胞培養(yǎng)液，向?qū)嶒灲M和陽性對照組分別加入含有不同濃度的ISAP₁和葡萄糖的培養(yǎng)液，陰性對照組僅加入培養(yǎng)基(空白)，于37℃，5％的CO₂中作用1小時。

5.用無菌PBS清洗板底細胞兩次，添加300μL的Trizol溶液，按照RNAiso Plus(TaKaRa)說明書提取細胞RNA，經(jīng)DNA酶處理后,用SuperScript^T(Invitrogen公司,加拿大)試劑盒經(jīng)DNAEngine反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板,用SYBRGreen法對各時間點的熒光PCR產(chǎn)物進行實時監(jiān)測分析(Light Cycler Roche公司,德國)，以檢測胰島素基因的表達量。

實時定量PCR使用的引物，鼠Ins-1：

正向5’-CCAGCTATAATCAGAGACCA-3’，

反向5’-CCAGGTGGGGACCACAAAGA-3’。

GAPDH作為內(nèi)參

正向5’-AGCAGTCCCGTACACTGGCAAAC-3’

反向5’-TCTGTGGTGATGTAAATGTCCTCT--3’。

實驗結(jié)果見圖1，不同濃度的ISAP₁均可促進βTC-6細胞表達更多的胰島素mRNA。

2、ISAP₁對胰島的影響。

按照Gregory L.Szot等，Murine Pancreatic Islet Isolation，Journal of Visualized Experiments，2007所述的方法，從小鼠分離原代胰島，對原代胰島進行饑餓預(yù)處理，使用KRBB緩沖液(129g NaCl,5g NaHCO₃,4.8g KCl,1.2g KH₂PO₄,1.2g MgSO₄,2.5g CaCl₂,10mM HEPES和0.1％BSA在pH 7.4)處理4小時。棄去KRBB液，向陽性對照組加入含16.8mM葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基，實驗組則加入含有不同濃度的ISAP₁無糖DMEM培養(yǎng)液，陰性對照組僅加入無糖DMEM培養(yǎng)基(空白)，于37℃，5％的CO₂中作用1小時。實驗結(jié)果參照圖2、不同濃度的ISAP₁均可促進胰島表達更多的胰島素mRNA。

3、體內(nèi)實驗中ISAP₁對糖代謝的影響。

3.1高脂喂養(yǎng)建立2型糖尿病模型

健康6周齡雄性C57BL/6SPF級小鼠購買自廣東省實驗動物中心，體質(zhì)量18-22g。分兩組，飼養(yǎng)于本研究院SPF級動物房。對照組：給予小鼠正常飼料(ND)(正常飼料：脂肪，5％；碳水化合物，53％；蛋白，23％；總熱量25J/g)，自由攝食和飲水，喂養(yǎng)12周。實驗組：給予小鼠高脂飼料(HFD)(高脂飼料D12451，Research Diets,Inc.)，自由攝食和飲水，喂養(yǎng)12周。檢測其生理指標(biāo)。高脂飼料喂養(yǎng)的小鼠體重超過40g，認(rèn)為2型糖尿病模型(T2DM)構(gòu)建成功。

3.2代謝實驗檢測

糖耐量檢測(Glucose tolerance tests，GTT)，在將T2DM小鼠禁食16個小時后，經(jīng)腹腔注射20％葡萄糖溶液后1分鐘立刻注射生理鹽水、ISAP₁或OCN，于10分鐘，30分鐘，60分鐘，90分鐘檢測其血糖變化。ISAP₁和OCN在T2DM小鼠中具有短時間的作用。實驗結(jié)果如圖3中所示，OCN和ISAP₁與對照組(注射生理鹽水)相比，在各時間點，血糖水平均降低。證明了ISAP₁降低血糖的作用。

3.3長期施用ISAP₁對糖代謝的影響

使用T2DM小鼠，分5組，每組6只。采用相應(yīng)的飼料和施用方式；第一組，正常飼料(ND)+載劑；第二組，高脂飼料(HFD)+載劑；第三組，HFD+OCN6pmol/g/d+載劑；第四組，HFD+ISAP₁20pmol/g/d+載劑；第五組，HFD+ISAP₁ 2pmol/g/d+載劑；d代表每天腹腔注射。分別在第0、2、4周時測量血糖水平，從尾尖采取約10微升血液，使用羅氏血糖儀，按照制造商的說明書進行測量。結(jié)果參見圖4，與對照組(第二組)相比，血糖水平降低。在第0和6周使用Ultra Sensitive Mouse Insulin ELISA Kit(cystalchem公司，美國)和Multiskan^TM FC酶標(biāo)儀(Thermo公司，美國)測量血清中的胰島素水平。結(jié)果參見圖5，ISAP₁改善了血清中胰島素水平。

3.4組織形態(tài)學(xué)分析

完成步驟3.3的試驗后，使用90％濃度的二氧化碳將小鼠安樂死，取出胰臟，采集小塊組織固定于4％多聚甲醛溶液中24小時，石蠟包埋并以5μm厚度進行切片(Leica RM2235,Germany)，之后用蘇木精和伊紅(C0105,Beyotime,中國)對組織染色并觀察。實驗結(jié)果參見附圖6，使用40X放大倍數(shù)，A-E使相同的比例尺；F是對A至E的定量分析。與對照相比，實驗組的胰島面積顯著增加，而細胞體積并無明顯改變，說明ISAP₁可以促使胰島增殖。

4、ISAP₁與人GPRC6A的結(jié)合

4.1在Hela細胞中過表達hGPRC6A 1)細胞鋪板：將Hela細胞懸液以1.6×10⁵/mL的密度鋪板在6孔板中，每孔2mL DMEM培養(yǎng)基，于37℃，5％的CO₂中培養(yǎng)24小時。

2)使用Lipofectamine2000(Invitrogen)，按照廠商的說明書將hGPRC6A過表達載體(pReceiver-M61)轉(zhuǎn)染到Hela細胞中，轉(zhuǎn)染后4小時更換正常培養(yǎng)基。

3)轉(zhuǎn)染后48小時，棄掉培養(yǎng)基，用無菌PBS清洗板底細胞兩次，添加300μL的Trizol溶液，按照RNAiso Plus(TaKaRa)說明書提取細胞RNA，經(jīng)DNA酶處理后,用SuperScript^T(Invitrogen公司,加拿大)試劑盒經(jīng)DNAEngine反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板,用SYBRGreen法對各時間點的熒光PCR產(chǎn)物進行實時監(jiān)測分析(Light Cycler Roche公司,德國)，以檢測hGPRC6A的表達量。如有需要，使用嘌呤霉素篩選得到穩(wěn)定表達細胞株，之后使用qPCR檢測其基因表達，實驗結(jié)果如圖6A所示，人GPRC6A在Hela中穩(wěn)定大量表達實驗結(jié)果如圖8A所示，人GPRC6A在Hela中穩(wěn)定大量表達。

4.2ISAP₁與過表達hGPRC6A的Hela細胞的細胞膜的結(jié)合實驗，

實驗結(jié)果見圖8B，與OCN相比，ISAP₁具有幾乎一致的膜結(jié)合能力，而OCN-22不具備這種能力，證明ISAP₁是OCN的核心結(jié)構(gòu)域，與受體hGPRC6A相互作用。

5、灌胃施用ISAP₁對高脂飼料(HFD)的小鼠的血糖水平的影響

健康6周齡雄性C57BL/6小鼠，體質(zhì)量18-22g，分6組，每組5只，第一組，正常飼料(ND)；第二組，高脂飼料(HFD)；第三組，HFD+OCN2pmol/g；第四組，HFD+ISAP₁ 2pmol/g；第五組，HFD+ISAP₂ 2pmol/g；第六組，HFD+ISAP₃ 2pmol/g；其中OCN和ISAP₁、ISAP₂、ISAP₃通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的灌胃方法每天施用，使用1ml注射器和12號針頭，將多肽溶解在生理鹽水中，灌胃體積為10μL/g。

四周后，從尾尖采取約10微升血液，使用羅氏血糖儀，按照制造商的說明書進行測量。結(jié)果參見圖7，與對照相比，ISAP₁具有降低血糖的作用。

實施例2

ISAP₂的功能ISAP₂與人GPRC6A的結(jié)合

2.1在Hela細胞中過表達hGPRC6A 1)細胞鋪板：將Hela細胞懸液以1.6×10⁵/mL的密度鋪板在6孔板中，每孔2mL DMEM培養(yǎng)基，于37℃，5％的CO₂中培養(yǎng)24小時。

2)使用Lipofectamine2000(Invitrogen)，按照廠商的說明書將hGPRC6過表達載體(pReceiver-M61)轉(zhuǎn)染到Hela細胞中，轉(zhuǎn)染后4小時更換正常培養(yǎng)基。

3)轉(zhuǎn)染后48小時，棄掉培養(yǎng)基，用無菌PBS清洗板底細胞兩次，添加300μL的Trizol溶液，按照RNAiso Plus(TaKaRa)說明書提取細胞RNA，經(jīng)DNA酶處理后,用SuperScript^T(Invitrogen公司,加拿大)試劑盒經(jīng)DNAEngine反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA為模板,用SYBRGreen法對各時間點的熒光PCR產(chǎn)物進行實時監(jiān)測分析(Light Cycler Roche公司,德國)，以檢測hGPRC6A的表達量。如有需要，使用嘌呤霉素篩選得到穩(wěn)定表達細胞株，之后使用qPCR檢測其基因表達，實驗結(jié)果如圖6A所示，人GPRC6A在Hela中穩(wěn)定大量表達實驗結(jié)果如圖8A所示，人GPRC6A在Hela中穩(wěn)定大量表達。

2.2ISAP₂與過表達hGPRC6A的Hela細胞的細胞膜的結(jié)合實驗

實驗結(jié)果見圖8B，與hOCN相比，ISAP₂具有幾乎一致的膜結(jié)合能力，而hOCN-22不具備這種能力，結(jié)合實施例1中項4.2的結(jié)果，證明ISAP₁和ISAP₂分別是OCN和hOCN的核心結(jié)構(gòu)域，均與受體hGPRC6A相互作用，從而推定ISAP₁和ISAP₂具有相同的功能，通過hGPRC6A引起后續(xù)的信號傳導(dǎo)和生物學(xué)事件。

2.3帶有Cy5標(biāo)記的OCN、hOCN-22，ISAP₂在GPRC6A過表達的Hela細胞中促進GPRC6A的內(nèi)化。

將表達hGPRC6A-Hela細胞懸液以1.6×10⁵/mL的密度鋪板在預(yù)先放置明膠涂層蓋玻片的24孔板中，每孔0.5mL DMEM，于37℃，5％的CO₂中培養(yǎng)24小時。細胞在處理前，用無血清培養(yǎng)基饑餓4小時后，每孔添加100nM的Cy5-OCN、Cy5-hOCN22，Cy5-ISAP₂，37℃孵育30分鐘，使用多聚甲醇固定細胞30分鐘，并加入Triton X-100(sigma)孵育10分鐘，DAPI(Sigma)10秒按照廠商的說明書，對細胞和染色，使用熒光共聚焦顯微鏡觀察并拍照，實驗結(jié)果參見圖6C?？梢?，Cy5-OCN和Cy5-ISAP₂細胞內(nèi)部有分布，而Cy5-hOCN22則分布在胞外，再次說明了Cy5-OCN和Cy5-ISAP₂均可與受體結(jié)合并通過內(nèi)在化作用進入細胞內(nèi)，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)能量代謝的作用。

2.4灌胃施用ISAP₂對高脂飼料(HFD)的小鼠的血糖水平的影響

健康6周齡雄性C57BL/6小鼠，體質(zhì)量18-22g，分6組，每組5只，第一組，正常飼料(ND)；第二組，高脂飼料(HFD)；第三組，HFD+OCN2pmol/g；第四組，HFD+ISAP₁ 2pmol/g；第五組，HFD+ISAP₂ 2pmol/g；第六組，HFD+ISAP₃ 2pmol/g；其中OCN和ISAP₁、ISAP₂、ISAP₃通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的灌胃方法每天施用，使用1ml注射器和12號針頭，將多肽溶解在生理鹽水中，灌胃體積為10μL/g。

四周后，從尾尖采取約10微升血液，使用羅氏血糖儀，按照制造商的說明書進行測量。結(jié)果參見圖7，與對照相比，ISAP₂具有降低血糖的作用。

實施例3

ISAP₃的功能

灌胃施用ISAP₃對高脂飼料(HFD)的小鼠的血糖水平的影響

健康6周齡雄性C57BL/6小鼠，體質(zhì)量18-22g，分6組，每組5只，第一組，正常飼料(ND)；第二組，高脂飼料(HFD)；第三組，HFD+OCN2pmol/g；第四組，HFD+ISAP₁ 2pmol/g；第五組，HFD+ISAP₂ 2pmol/g；第六組，HFD+ISAP₃ 2pmol/g；其中OCN和ISAP₁、ISAP₂、ISAP₃通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的灌胃方法每天施用，使用1ml注射器和12號針頭，將多肽溶解在生理鹽水中，灌胃體積為10μL/g。

四周后，從尾尖采取約10微升血液，使用羅氏血糖儀，按照制造商的說明書進行測量。結(jié)果參見圖7，與對照相比，ISAP₃具有降低血糖的作用。

結(jié)合實施例1和2的實驗結(jié)果，對比ISAP₁、ISAP₂、ISAP₃的序列可知：相對于ISAP₁,ISAP₂具有4個插入，2個替換，和1個缺失；相對于ISAP₁，ISAP₃具有4個插入，3個替換；相對于ISAP₂，ISAP₁具有4個缺失，2個替換，和1個插入；綜上所述，可以認(rèn)為三個多肽互為變體，推定可以以這三個序列為基礎(chǔ)，進行本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的氨基酸保守替換、插入和缺失，條件是不使其調(diào)節(jié)糖代謝的能力顯著降低，例如降低不超過40％、30％、20％、10％。參見附圖10中對多種不同生物來源的同源序列進行了對比，其中SEQ ID NO.2：YLYQWLGAPVPYPDPLEP，SEQ ID NO.4：YLNNGLGAPAPYPDPLEP，SEQ ID NO.5：YLYQWLGAPVPYPDTLEP，SEQ ID NO.6：YLYQWLGAPVPYPDPLEP，SEQ ID NO.7：YLDHWLGAPAPYPDPLEP，SEQ ID NO.8：YLDPGLGAPAPYPDPLEP，SEQ ID NO.9：YLDHGLGAPAPYPDPLEP，SEQ ID NO.10：YLDQGLGAPAPAPDPLEP，SEQ ID NO.11：YLDSGLGAPVPYPDPLEP之間差異很小，兩兩比較時，多數(shù)情況下差異不超過四個氨基酸的替換，因此可以推定這些序列具有類似的生物學(xué)功能，也應(yīng)當(dāng)包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)，優(yōu)選地，其中缺失、替換和插入的總數(shù)不超過4，例如不超過3、2、1。另外SEQ ID NO.1與SEQ ID NO.22相比僅缺失了一個氨基酸殘基，因此推斷SEQ ID NO.1也具有與SEQ ID NO.22類似的功能。

同時，結(jié)合實施例2和3的實驗結(jié)果,相對于ISAP₂，ISAP₁和ISAP₃相當(dāng)于在ISAP₂末端具有1個插入；表明可以在多肽的末端添加若干個氨基酸殘基，條件是不使其調(diào)節(jié)糖代謝的能力顯著降低，例如降低不超過40％、30％、20％、10％，優(yōu)選地末端添加不超過5個，例如4個、3個、2個、1個或0個氨基酸殘基。

實施例4

類似實施例1中所述方法，選取健康6周齡雄性C57BL/6SPF級小鼠18只，分為6組，每組3只。一組為對照組，給予小鼠正常飼料(ND)；其余5組給予小鼠高脂飼料(HFD)，自由攝食和飲水，高脂飼料喂養(yǎng)的小鼠體重超過40g后進行以下實驗：

給第3-6組小鼠(HFD)，每日以2pmol/g體重、分別灌胃施用ISAP₁、ISAP₄、ISAP₅、ISAP₆；給第1組小鼠(ND)、第2組小鼠(HFD)分別灌胃施用等體積鹽水。持續(xù)進行7周，每周從尾尖采取約10微升血液，使用羅氏血糖儀監(jiān)測一次血糖水平，實驗結(jié)果參照圖9A，灌胃施用ISAP₁、ISAP₄、ISAP₅、ISAP₆均導(dǎo)致血糖水平的顯著降低。

同時，在實驗結(jié)束后，對血液中GLP1的水平，使用針對GLP1的抗體進行檢測，實驗結(jié)果參見圖9B。與兩組對照組相比，ISAP₁、ISAP₄、ISAP₅、ISAP₆均導(dǎo)致GLP1水平大幅度提高。證明了他們和ISAP₁、ISAP₂、ISAP₃在生物學(xué)功能上相當(dāng)，同時，參照圖10的序列對比，也可以看出SEQ ID NO.12：PVPYPDPLEP與SEQ ID NO.15：SVPSPDPLEP，SEQ ID NO.13：PYPDPLEP與SEQ ID NO.16：PSPDPLEP在序列上相似度非常高，同時在各個物種之間也是非常保守的序列，因而應(yīng)當(dāng)具有類似的生物活性，應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

本領(lǐng)域人員公知的，多肽的長度與合成長度有密切聯(lián)系，以本實施例進行時的市價為例，重量均為4mg，6氨基酸殘基多肽(例如ISAP₆)合成價格225元(人民幣)；8氨基酸殘基多肽(例如ISAP₅)合成價格300元(人民幣)；10氨基酸殘基多肽(例如ISAP₄)合成價格375元(人民幣)；15氨基酸殘基多肽(例如ISAP₁)合成價格562元(人民幣)；46氨基酸殘基多肽(例如小鼠OCN)合成價格1675元(人民幣)；考慮到分子量的區(qū)別，等摩爾的ISAP₆的價格約為小鼠OCN的約六十分之一，極大的降低了成本，非常適合大規(guī)模制造和使用。

同時，本發(fā)明的多肽口服即可起到作用，相比現(xiàn)有技術(shù)中，絕大部分以注射施用的多肽而言，極大的方便了患者，改善了患者依從性，因此是具有醫(yī)藥領(lǐng)域的巨大應(yīng)用前景。

通過引用并入

本文中提及的所有出版物和專利通過引用全文并入本文，如同每個單獨的出版物或?qū)＠痪唧w地且單獨地表明通過引用并入。在沖突的情況下，以本申請(包括本文中的任何定義)為準(zhǔn)。

等同方案

雖然本文中已經(jīng)明確地公開了本發(fā)明的一些具體實施方案，以上說明書是舉例說明性的而非限制性的。對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，通過瀏覽本說明書和所附權(quán)利要求，本發(fā)明的許多變化形式將變得明顯。本發(fā)明的全部范圍應(yīng)通過參照權(quán)利要求、其等同方案的全部范圍、以及本說明書和這樣的變化來確定。

序列表

<110> 深圳先進技術(shù)研究院

<120> 調(diào)節(jié)糖代謝的多肽及其用途

<160> 22

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 15

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 1

Tyr Leu Gly Ala Ser Val Pro Ser Pro Asp Pro Leu Glu Pro

1 5 10

<210> 2

<211> 18

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 2

Tyr Leu Tyr Gln Trp Leu Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu

1 5 10 15

Glu Pro

<210> 3

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ISAP3

<400> 3

Tyr Leu Tyr Gln Trp Leu Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu

1 5 10 15

Glu Pro Arg

<210> 4

<211> 18

<212> PRT

<213> 大鼠（Rattus norvegicus）

<400> 4

Tyr Leu Asn Asn Gly Leu Gly Ala Pro Ala Pro Tyr Pro Asp Pro Leu

1 5 10 15

Glu Pro

<210> 5

<211> 18

<212> PRT

<213> 倭黑猩猩（Pan troglodytes）

<400> 5

Tyr Leu Tyr Gln Trp Leu Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Thr Leu

1 5 10 15

Glu Pro

<210> 6

<211> 18

<212> PRT

<213> 獼猴（Macaca mulatta）

<400> 6

Tyr Leu Tyr Gln Trp Leu Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu

1 5 10 15

Glu Pro

<210> 7

<211> 18

<212> PRT

<213> 牛（Bos taurus）

<400> 7

Tyr Leu Asp His Trp Leu Gly Ala Pro Ala Pro Tyr Pro Asp Pro Leu

1 5 10 15

Glu Pro

<210> 8

<211> 18

<212> PRT

<213> 綿羊（Ovis aries）

<400> 8

Tyr Leu Asp Pro Gly Leu Gly Ala Pro Ala Pro Tyr Pro Asp Pro Leu

1 5 10 15

Glu Pro Arg

<210> 9

<211> 18

<212> PRT

<213> 野豬（Sus scrofa）

<400> 9

Tyr Leu Asp His Gly Leu Gly Ala Pro Ala Pro Tyr Pro Asp Pro Leu

1 5 10 15

Glu Pro

<210> 10

<211> 18

<212> PRT

<213> 裸鼢鼠（Heterocephalus glaber）

<400> 10

Tyr Leu Asp Gln Gly Leu Gly Ala Pro Ala Pro Ala Pro Asp Pro Leu

1 5 10 15

Glu Pro

<210> 11

<211> 18

<212> PRT

<213> 犬（Canis lupus）

<400> 11

Tyr Leu Asp Ser Gly Leu Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu

1 5 10 15

Glu Pro

<210> 12

<211> 10

<212> PRT

<213> 人

<400> 12

Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro

1 5 10

<210> 13

<211> 8

<212> PRT

<213> 人

<400> 13

Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro

1 5

<210> 14

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> IASP6

<400> 14

Pro Asp Pro Leu Glu Pro

1 5

<210> 15

<211> 10

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 15

Ser Val Pro Ser Pro Asp Pro Leu Glu Pro

1 5 10

<210> 16

<211> 8

<212> PRT

<213> 小鼠

<400> 16

Pro Ser Pro Asp Pro Leu Glu Pro

1 5

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 胰島素PCR正向引物

<400> 17

ccagctataa tcagagacca 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 胰島素PCR反向引物

<400> 18

ccaggtgggg accacaaaga 20

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GAPDH正向引物

<400> 19

agcagtcccg tacactggca aac 23

<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GAPDH反向引物

<400> 20

tctgtggtga tgtaaatgtc ctct 24

<210> 21

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> ISAP的一種通式

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> Xaa為Tyr、Asn、Asp或不存在

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> Xaa為Gln、Asn、His、Pro、Ser或不存在

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> Xaa為Trp、Gly或不存在

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> Xaa為Leu或不存在

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(9)

<223> Xaa為Pro或Ser

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> Xaa為Ala或Val

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> Xaa為Tyr或Ser

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> 為Thr或Pro

<400> 21

Tyr Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Ala Xaa Xaa Pro Xaa Pro Asp Xaa Leu

1 5 10 15

Glu Pro

<210> 22

<211> 15

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 22

Tyr Leu Gly Ala Ser Val Pro Ser Pro Asp Pro Leu Glu Pro Thr

1 5 10 15