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一種基于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的重組pBpp蛋白制備方法與流程

文檔序號(hào):12712578閱讀:351來(lái)源:國(guó)知局

本發(fā)明涉及基因工程及蛋白純化技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種基于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的重組pBpp蛋白制備方法。



背景技術(shù):

糖尿病是由遺傳因素、免疫功能紊亂、微生物感染及其毒素、自由基毒素、精神因素等等各種致病因子作用于機(jī)體導(dǎo)致胰島功能減退、胰島素抵抗等而引發(fā)的糖、蛋白質(zhì)、脂肪、水和電解質(zhì)等一系列代謝紊亂綜合征,臨床上以高血糖為主要特點(diǎn)。

目前,我國(guó)Ⅱ型糖尿病的患病率增長(zhǎng)較快,據(jù)1979年在我國(guó)30萬(wàn)人口中的調(diào)查,糖尿病患病率為0.6%,1989年為2.02%,年均增長(zhǎng)0.1%左右,1994年我國(guó)普查20萬(wàn)人口,患病率已上升為2.5%,目前20~75歲人群中糖尿病患病率約為3%左右。糖耐量低減患者不低于3%。一般而言,在我國(guó)富裕地區(qū)的糖尿病患病率高于貧困地區(qū),城市高于農(nóng)村,肥胖高于正常體重,高齡高于低齡。目前我國(guó)糖尿病發(fā)病率為1/1000左右,50歲以上的平均患病率為7%以上,40歲以下患病率隨著年齡的增長(zhǎng)而升高,患者高峰年齡在50~70歲。

我國(guó)患病率以北京、遼寧、寧夏、甘肅、云南、福建較高,據(jù)1979~1997年調(diào)查結(jié)果表明為全國(guó)之首,而新疆、貴州、山西較低。發(fā)病率較高的北京、遼寧與最低的貴州、新疆之間相差達(dá)10倍,城市發(fā)病率高于農(nóng)村1~4倍,廣西地區(qū)調(diào)查證明,產(chǎn)糖地區(qū)糖尿病患病率高于非產(chǎn)糖區(qū)2倍。

盡管多種治療方法可以控制血糖濃度,但目前仍未實(shí)現(xiàn)糖尿病的根治?,F(xiàn)有技術(shù)中,藥物干預(yù)仍是糖尿病治療的主要手段,其中以GLP-1類(lèi)似物、DPPIV抑制劑等應(yīng)用較為廣泛。pBpp蛋白(promotingβ-Cell proliferation protein),是指可誘導(dǎo)胰腺中β細(xì)胞增殖、進(jìn)而促進(jìn)胰島素分泌的一類(lèi)功能性蛋白,由于其不直接參與人體糖代謝機(jī)制,因此降糖作用較為溫和,對(duì)人體副作用較小。然而,此類(lèi)蛋白的規(guī)?;a(chǎn)是目前制約其臨床應(yīng)用的直接技術(shù)問(wèn)題,其中人源蛋白的獲取較為困難,而其他生物來(lái)源的pBpp蛋白其藥效及安全性又難以得到保障。



技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

本發(fā)明旨在針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)缺陷,提供一種基于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的重組pBpp蛋白制備方法,以解決現(xiàn)有技術(shù)中pBpp蛋白難以規(guī)?;苽涞募夹g(shù)問(wèn)題。

本發(fā)明要解決的另一技術(shù)問(wèn)題是以基因工程手段獲得的、由微生物所表達(dá)的重組pBpp蛋白,其純化較為困難。

為實(shí)現(xiàn)以上技術(shù)目的,本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:

一種基于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的重組pBpp蛋白制備方法,包括以下步驟:

1)以斑馬魚(yú)糞便菌群的總DNA為模板,以序列如SEQ ID No.1所示和序列如SEQ ID No.2所示的片段分別為上、下游引物執(zhí)行PCR擴(kuò)增,得到序列如SEQ ID No.3所示的DNA片段,即為pBpp蛋白表達(dá)基因;

2)取步驟1)所獲得的pBpp蛋白表達(dá)基因,先經(jīng)NcoI和XhoI雙酶切,酶切產(chǎn)物純化后采用T4連接酶連接到pET28c上,即得到重組質(zhì)粒pET28c-pBpp;

3)取步驟2)所得的重組質(zhì)粒pET28c-pBpp,轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coli Top10中,得到重組菌株;

4)培養(yǎng)步驟3)所得的重組菌株,從中提取重組質(zhì)粒pET28c-pBpp,將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌E.coli BL21,即得到重組表達(dá)菌株pET28c-pBpp-BL21;

5)利用含有100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)步驟4)所得的重組表達(dá)菌株pET28c-pBpp-BL21,收集菌體;

6)利用EQ Buffer重懸步驟5)所得菌體,超聲破碎,而后以10000rpm的轉(zhuǎn)速離心10min,取上清;取鎳珠,懸浮于EQ Buffer中,以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心15min,收集沉淀,懸浮于EQ Buffer中,再以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心15min,收集沉淀,重懸于EQ Buffer中,得到鎳珠懸液,將其加入至所述上清中,于4℃條件下保持2h,而后以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心15min,收集沉淀,懸浮于Wash Buffer中,而后在旋轉(zhuǎn)混勻儀上常溫旋轉(zhuǎn)10min,而后以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心15min,收集沉淀,重懸于EQ Buffer中,再以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心15min,收集沉淀,重懸于EQ Buffer中,再以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心15min,收集沉淀;

7)取步驟6)所得沉淀物懸浮于洗脫Buffer中,在旋轉(zhuǎn)混勻儀上常溫旋轉(zhuǎn)15min,以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心15min,收集上清,再以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心15min收集上清;

8)取步驟7)所得的上清液,以13000rpm的轉(zhuǎn)速離心30~60min,取上清裝入透析袋,先利用1×PBS緩沖液透析3h,再用25%體積濃度的甘油水溶液透析3h,即得到所述pBpp蛋白。

作為優(yōu)選,步驟5)中,初始向培養(yǎng)基中接入的重組表達(dá)菌株pET28c-pBpp-BL21菌液量為培養(yǎng)基體積的1%。

作為優(yōu)選,步驟5)中培養(yǎng)至培養(yǎng)液OD值為0.6時(shí)向其中加入終濃度為1mmol/L的IPTG,于25℃條件下誘導(dǎo)6~8h,結(jié)束培養(yǎng)。

作為優(yōu)選,步驟6)中所述的超聲破碎,直至溶液澄清為止。

作為優(yōu)選,步驟6)中所述的以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心15min,被離心物均是裝滿(mǎn)于15ml離心管中進(jìn)行離心的。

作為優(yōu)選,步驟6)鎳珠在EQ Buffer中的懸浮,二者的體積比為1:15。

作為優(yōu)選,步驟8)利用1×PBS緩沖液透析3h的過(guò)程中,先后更換PBS緩沖液3次。

同時(shí),本發(fā)明還提供了一種上述pBpp蛋白的功能驗(yàn)證方法,包括以下步驟:

1)取小鼠,連續(xù)5d以每天50mg/kg的劑量注射鏈脲佐菌素,得到II型糖尿病模型小鼠;

2)取所述pBpp蛋白,以尾靜脈注射方式對(duì)步驟1)所得的II型糖尿病模型小鼠給藥,每隔7天監(jiān)測(cè)所述II型糖尿病模型小鼠的血糖變化。

本發(fā)明提供了一種基于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的重組pBpp蛋白制備方法,該技術(shù)方案以斑馬魚(yú)糞便菌群DNA為模板,擴(kuò)增得到pBpp表達(dá)基因,再利用pET28c質(zhì)粒為載體,先于大腸桿菌TOP10中擴(kuò)增質(zhì)粒,而后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21中進(jìn)行蛋白表達(dá)。在此基礎(chǔ)上,本發(fā)明針對(duì)重組菌株的特性設(shè)計(jì)了適宜的蛋白表達(dá)及誘導(dǎo)條件,對(duì)于胞內(nèi)表達(dá)的pBpp蛋白,本發(fā)明對(duì)菌體進(jìn)行超聲破碎后,先利用鎳珠結(jié)合游離的蛋白,再進(jìn)行蛋白洗脫,最后分別利用PBS和甘油進(jìn)行透析,從而實(shí)現(xiàn)了pBpp蛋白的有效純化。

在此基礎(chǔ)上,為考察pBpp蛋白的降糖效果,本發(fā)明建立了相應(yīng)的功能驗(yàn)證方法,該方法先利用鏈脲佐菌素構(gòu)建II型糖尿病模型小鼠,而后采用尾靜脈注射的方式進(jìn)行pBpp蛋白給藥,以給藥后小鼠血糖變化情況來(lái)對(duì)pBpp蛋白的降糖效果進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),本發(fā)明所制備的pBpp蛋白可確切誘導(dǎo)胰腺中β細(xì)胞的增殖,從而對(duì)因胰島β細(xì)胞損傷所導(dǎo)致的糖尿病起到治療效果。

具體實(shí)施方式

以下將對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)描述。為了避免過(guò)多不必要的細(xì)節(jié),在以下實(shí)施例中對(duì)屬于公知的結(jié)構(gòu)或功能將不進(jìn)行詳細(xì)描述。除有定義外,以下實(shí)施例中所用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員普遍理解的相同含義。

以下實(shí)施例中所用的試驗(yàn)試劑耗材,如無(wú)特殊說(shuō)明,均為常規(guī)生化試劑;所述實(shí)驗(yàn)方法,如無(wú)特殊說(shuō)明,均為常規(guī)方法;以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn),均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn),結(jié)果取平均值;以下實(shí)施例中的%,如無(wú)特別說(shuō)明,均為質(zhì)量百分含量。

以下實(shí)施例中,所用到的E.coli Top10,E.coli BL21,pET28c載體質(zhì)粒購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司;所用到的限制性?xún)?nèi)切酶、T4DNA連接酶、DNA連接酶購(gòu)自NEB公司;所用到的LB固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基由本實(shí)驗(yàn)室自行配制。

以下實(shí)施例中,各緩沖液配方如下:

4L EQ Buffer:NaH2PO4.H2O 1.46g;Na2HPO4.7H2O:50.76g;最后加水到4L,過(guò)濾除菌,調(diào)PH為8.0,滅菌。

Wash Buffer:加0.34g咪唑在500ml EQ Buffer中,調(diào)ph為8.0.滅菌。(現(xiàn)配現(xiàn)用)。

洗脫Buffer:加1.7g咪唑到EQ buffer,終體積為100ml,調(diào)pH為8.0,滅菌(現(xiàn)配現(xiàn)用)。

100mM IPTG:2.4g IPTG溶于100ml水中,過(guò)濾除菌。

實(shí)施例1

1、pBpp蛋白重組表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建

以斑馬魚(yú)糞便菌群DNA為模板,以SEQ ID No.1和SEQ ID No.2序列為引物,PCR擴(kuò)增獲得SEQ ID No.3所示的pBpp片段,命名為pBpp。

已獲得的pBpp片段和質(zhì)粒pET28c,經(jīng)NcoI和XhoI雙酶切,酶切產(chǎn)物純化后,采用T4連接酶連接到pET28c(SEQ ID No.4)質(zhì)粒中,重組質(zhì)粒命名為pET28c-pBpp,并轉(zhuǎn)化進(jìn)入E.coli BL21中,獲得的重組表達(dá)菌株命名為pET28c-pBpp-BL21。

2、pBpp蛋白的表達(dá)與純化

(1)pBpp蛋白表達(dá):配制200ml LB培養(yǎng)基,待冷卻后加入200ul氨芐母液,使其終濃度為100ug/ml;挑選pET28c-pBpp-BL21單菌落進(jìn)行過(guò)夜搖瓶培養(yǎng);按1%接種量接入新鮮含有氨芐抗生素的LB培養(yǎng)基中;待其OD為0.6時(shí)加入終濃度為1mM IPTG進(jìn)行誘導(dǎo),25℃連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)6-8h后離心菌體,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)pBpp蛋白純化:

A結(jié)合蛋白:將步驟(1)中收獲的菌體35ml EQ Buffer懸浮,超聲破碎呈現(xiàn)澄清透亮的溶液后,10000rpm/min離心10min,收集上清備用;取1ml鎳珠,用15ml離心管重懸鎳珠(裝滿(mǎn)15mL),4000rpm離心15分鐘,重復(fù)兩次;用1mL EQ Buffer重懸鎳珠;將洗滌好的鎳珠加入蛋白上清中,置于4度中令鎳珠和蛋白結(jié)合2h;4000rpm離心15分鐘,棄上清。用Wash Buffer重懸鎳珠,將其置于15ml離心管中,加Wash Buffer至15ml,置于旋轉(zhuǎn)儀器上于常溫旋轉(zhuǎn)10分鐘,4000rpm離心15分鐘。重復(fù)該操作3次。

B洗脫蛋白:將步驟A中收獲的沉淀用1ml洗脫Buffer懸浮,并在常溫下于旋轉(zhuǎn)儀上旋轉(zhuǎn)15分鐘,4000轉(zhuǎn)離心15分鐘,本步驟重復(fù)兩次,回收總體積為2mL蛋白溶液,同時(shí)回收鎳珠。

C洗滌:將洗脫的上清轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中,最大轉(zhuǎn)速13000rpm離心30-60min,小心取上清,裝于透析袋中,采用1×PBS透析3h,更換PBS溶液重復(fù)3次;最后采用25%的甘油透析3h,小心吸取蛋白上清,測(cè)定濃度后,分裝,-80凍存?zhèn)溆?,并采用SDS-PAGE膠驗(yàn)證蛋白大小及純度;

3、pBpp蛋白的功能性驗(yàn)證

試劑配置:0.1M枸櫞酸緩沖液(PH4.5):0.1M枸櫞酸液4.5mL(0.21014枸櫞酸溶于10mL蒸餾水中)+0.1M枸櫞酸鈉液5.5mL(0.29412枸櫞酸鈉溶于10mL蒸餾水中);7.5mg/mL無(wú)菌STZ溶液(取37.5mgSTZ溶于5mL枸櫞酸緩沖液,與超凈臺(tái)0.22um濾器過(guò)濾,分裝存于-20℃即可)(注意避光)

實(shí)驗(yàn)流程:

(1)劑量及給藥方式:陽(yáng)性組:50mg/kg/天STZ溶液;陰性組:與陽(yáng)性組同等劑量枸櫞酸緩沖液;

給藥方式:腹腔注射;

(2)取12只健康雄性老鼠,觀察24h,無(wú)異常后進(jìn)行試驗(yàn);小鼠隨機(jī)分為2組,稱(chēng)重;第一次給藥前饑餓處理24h,禁食不禁水;稱(chēng)重后,按照陽(yáng)性組劑量換算后,與超凈臺(tái)中腹腔注射STZ藥物,打完后,正常給予飼料,無(wú)菌水喂養(yǎng),連續(xù)5天同一時(shí)間注射STZ藥物;并于打完第3,7,10,14,21,28天用試紙測(cè)定小鼠空腹8h后的血糖和接著喂食2h后的血糖,若陽(yáng)性組大于11.1mmol/L,則造模成功;

(3)造模成功后,每日尾靜脈注射pBpp蛋白,頻率2天一次,正常飲食;陰性組,尾靜脈注射無(wú)菌PBS作為對(duì)照;

(4)在第7天,第14天,第21天檢測(cè)小鼠空腹8h后的血糖及接著喂食2h后的血糖,觀察血糖有無(wú)下降;

實(shí)施例2

一種基于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的重組pBpp蛋白制備方法,包括以下步驟:

1)以斑馬魚(yú)糞便菌群的總DNA為模板,以序列如SEQ ID No.1所示和序列如SEQ ID No.2所示的片段分別為上、下游引物執(zhí)行PCR擴(kuò)增,得到序列如SEQ ID No.3所示的DNA片段,即為pBpp蛋白表達(dá)基因;

2)取步驟1)所獲得的pBpp蛋白表達(dá)基因,先經(jīng)NcoI和XhoI雙酶切,酶切產(chǎn)物純化后采用T4連接酶連接到pET28c上,即得到重組質(zhì)粒pET28c-pBpp;

3)取步驟2)所得的重組質(zhì)粒pET28c-pBpp,轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coli Top10中,得到重組菌株;

4)培養(yǎng)步驟3)所得的重組菌株,從中提取重組質(zhì)粒pET28c-pBpp,將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌E.coli BL21,即得到重組表達(dá)菌株pET28c-pBpp-BL21;

5)利用含有100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)步驟4)所得的重組表達(dá)菌株pET28c-pBpp-BL21,收集菌體;

6)利用EQ Buffer重懸步驟5)所得菌體,超聲破碎,而后以10000rpm的轉(zhuǎn)速離心10min,取上清;取鎳珠,懸浮于EQ Buffer中,以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心15min,收集沉淀,懸浮于EQ Buffer中,再以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心15min,收集沉淀,重懸于EQ Buffer中,得到鎳珠懸液,將其加入至所述上清中,于4℃條件下保持2h,而后以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心15min,收集沉淀,懸浮于Wash Buffer中,而后在旋轉(zhuǎn)混勻儀上常溫旋轉(zhuǎn)10min,而后以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心15min,收集沉淀,重懸于EQ Buffer中,再以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心15min,收集沉淀,重懸于EQ Buffer中,再以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心15min,收集沉淀;

7)取步驟6)所得沉淀物懸浮于洗脫Buffer中,在旋轉(zhuǎn)混勻儀上常溫旋轉(zhuǎn)15min,以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心15min,收集上清,再以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心15min收集上清;

8)取步驟7)所得的上清液,以13000rpm的轉(zhuǎn)速離心30~60min,取上清裝入透析袋,先利用1×PBS緩沖液透析3h,再用25%體積濃度的甘油水溶液透析3h,即得到所述pBpp蛋白。

在以上技術(shù)方案的基礎(chǔ)上,滿(mǎn)足以下條件:

步驟5)中,初始向培養(yǎng)基中接入的重組表達(dá)菌株pET28c-pBpp-BL21菌液量為培養(yǎng)基體積的1%。

步驟5)中培養(yǎng)至培養(yǎng)液OD值為0.6時(shí)向其中加入終濃度為1mmol/L的IPTG,于25℃條件下誘導(dǎo)6~8h,結(jié)束培養(yǎng)。

步驟6)中所述的超聲破碎,直至溶液澄清為止。

步驟6)中所述的以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心15min,被離心物均是裝滿(mǎn)于15ml離心管中進(jìn)行離心的。

步驟6)鎳珠在EQ Buffer中的懸浮,二者的體積比為1:15。

步驟8)利用1×PBS緩沖液透析3h的過(guò)程中,先后更換PBS緩沖液3次。

實(shí)施例3

一種基于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的重組pBpp蛋白制備方法,包括以下步驟:

1)以斑馬魚(yú)糞便菌群的總DNA為模板,以序列如SEQ ID No.1所示和序列如SEQ ID No.2所示的片段分別為上、下游引物執(zhí)行PCR擴(kuò)增,得到序列如SEQ ID No.3所示的DNA片段,即為pBpp蛋白表達(dá)基因;

2)取步驟1)所獲得的pBpp蛋白表達(dá)基因,先經(jīng)NcoI和XhoI雙酶切,酶切產(chǎn)物純化后采用T4連接酶連接到pET28c上,即得到重組質(zhì)粒pET28c-pBpp;

3)取步驟2)所得的重組質(zhì)粒pET28c-pBpp,轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coli Top10中,得到重組菌株;

4)培養(yǎng)步驟3)所得的重組菌株,從中提取重組質(zhì)粒pET28c-pBpp,將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌E.coli BL21,即得到重組表達(dá)菌株pET28c-pBpp-BL21;

5)利用含有100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)步驟4)所得的重組表達(dá)菌株pET28c-pBpp-BL21,收集菌體;

6)利用EQ Buffer重懸步驟5)所得菌體,超聲破碎,而后以10000rpm的轉(zhuǎn)速離心10min,取上清;取鎳珠,懸浮于EQ Buffer中,以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心15min,收集沉淀,懸浮于EQ Buffer中,再以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心15min,收集沉淀,重懸于EQ Buffer中,得到鎳珠懸液,將其加入至所述上清中,于4℃條件下保持2h,而后以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心15min,收集沉淀,懸浮于Wash Buffer中,而后在旋轉(zhuǎn)混勻儀上常溫旋轉(zhuǎn)10min,而后以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心15min,收集沉淀,重懸于EQ Buffer中,再以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心15min,收集沉淀,重懸于EQ Buffer中,再以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心15min,收集沉淀;

7)取步驟6)所得沉淀物懸浮于洗脫Buffer中,在旋轉(zhuǎn)混勻儀上常溫旋轉(zhuǎn)15min,以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心15min,收集上清,再以4000rpm的轉(zhuǎn)速離心15min收集上清;

8)取步驟7)所得的上清液,以13000rpm的轉(zhuǎn)速離心30~60min,取上清裝入透析袋,先利用1×PBS緩沖液透析3h,再用25%體積濃度的甘油水溶液透析3h,即得到所述pBpp蛋白。

以上對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明,但所述內(nèi)容僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例,并不用以限制本發(fā)明。凡在本發(fā)明的申請(qǐng)范圍內(nèi)所做的任何修改、等同替換和改進(jìn)等,均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 南昌大學(xué)

<120> 一種基于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的重組pBpp蛋白制備方法

<130> 2017

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cgtgccatgg ggatgaacaa gcgtaactgg ttgctg 36

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

taagctcgag gcggctcgtt tcagtcaagt c 31

<210> 3

<211> 783

<212> DNA

<213> 天然序列(斑馬魚(yú))

<400> 3

atgaacaagc gtaactggtt gctggccttg tcactgagtc tggccttctc accctgttat 60

gccgactggg ccaagctcaa ggccgcagcg tccgatctgg gagcggcagt gagcgagacc 120

agcaaggagg tgtggcagga tgtcagcgat ttctccaaga agagctgggc ttccatctct 180

gcatggggtg aagaggcgtt caataccgcc ggggtctgga ccgacaagag catcgcgacc 240

ggcaaggagt ggctgaaggc agccgacaag gagctcaacg agatgctcaa ccccaagacg 300

gcgaaagagg cgaggatcgc gatcaatacc atggccgaca ctgcgctgat ccggttgttc 360

aacgagcagc catcagccaa gttgttgttt gacaaggctt atggttatgc ggtgttcgat 420

tcgcgcaagt tctccctgat gctgcatacc aatcaggggg ccggggtggc agtcaatcgc 480

aaaaccggca agcacaccta tatgaagatg tttggtgcgg gtctggcggc cgggattggc 540

ggcaagttct atcagcaggt gatcctgttt gaagacaagg ccagattcga tgccttcgtg 600

acccaggggt gggaagctac ctccgaagtg ggtgtggtgg ccggcaagga gagcgctgag 660

ctgaccgcca aatataatgg cggcatggcc atctaccaga ttggcgagaa gggtttgctg 720

ctcgatgcca atatctccgg ctctaaatac tggattgaca aggacttgac tgaaacgagc 780

cgc 783

<210> 4

<211> 5367

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atccggatat agttcctcct ttcagcaaaa aacccctcaa gacccgttta gaggccccaa 60

ggggttatgc tagttattgc tcagcggtgg cagcagccaa ctcagcttcc tttcgggctt 120

tgttagcagc cggatctcag tggtggtggt ggtggtgctc gagtgcggcc gcaagcttgt 180

cgacggagct cgaattcgga tccgacccat ttgctgtcca ccagtcatgc tagccatatg 240

gctgccgcgc ggcaccaggc cgctgctgtg atgatgatga tgatggctgc tgcccatggt 300

atatctcctt cttaaagtta aacaaaatta tttctagagg ggaattgtta tccgctcaca 360

attcccctat agtgagtcgt attaatttcg cgggatcgag atctcgatcc tctacgccgg 420

acgcatcgtg gccggcatca ccggcgccac aggtgcggtt gctggcgcct atatcgccga 480

catcaccgat ggggaagatc gggctcgcca cttcgggctc atgagcgctt gtttcggcgt 540

gggtatggtg gcaggccccg tggccggggg actgttgggc gccatctcct tgcatgcacc 600

attccttgcg gcggcggtgc tcaacggcct caacctacta ctgggctgct tcctaatgca 660

ggagtcgcat aagggagagc gtcgagatcc cggacaccat cgaatggcgc aaaacctttc 720

gcggtatggc atgatagcgc ccggaagaga gtcaattcag ggtggtgaat gtgaaaccag 780

taacgttata cgatgtcgca gagtatgccg gtgtctctta tcagaccgtt tcccgcgtgg 840

tgaaccaggc cagccacgtt tctgcgaaaa cgcgggaaaa agtggaagcg gcgatggcgg 900

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ttggcgttgc cacctccagt ctggccctgc acgcgccgtc gcaaattgtc gcggcgatta 1020

aatctcgcgc cgatcaactg ggtgccagcg tggtggtgtc gatggtagaa cgaagcggcg 1080

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ttaactatcc gctggatgac caggatgcca ttgctgtgga agctgcctgc actaatgttc 1200

cggcgttatt tcttgatgtc tctgaccaga cacccatcaa cagtattatt ttctcccatg 1260

aagacggtac gcgactgggc gtggagcatc tggtcgcatt gggtcaccag caaatcgcgc 1320

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ttgccaacga tcagatggcg ctgggcgcaa tgcgcgccat taccgagtcc gggctgcgcg 1560

ttggtgcgga tatctcggta gtgggatacg acgataccga agacagctca tgttatatcc 1620

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gagaagcagg ccattatcgc cggcatggcg gccccacggg tgcgcatgat cgtgctcctg 2220

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atacgcgagc gaacgtgaag cgactgctgc tgcaaaacgt ctgcgacctg agcaacaaca 2340

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ctgcttacat aaacagtaat acaaggggtg ttatgagcca tattcaacgg gaaacgtctt 4020

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ccgctacagg gcgcgtccca ttcgcca 5367

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