本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種GPV感染性克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)染鵝胚拯救病毒的簡(jiǎn)便高效方法。

背景技術(shù)：

我國(guó)的養(yǎng)鵝業(yè)居于世界首位，也是鵝肉消費(fèi)大國(guó)。鵝細(xì)小病毒是1月齡內(nèi)雛鵝的一種重要疫病，死亡率可高達(dá)90％，該病自上世紀(jì)50、60年代在國(guó)內(nèi)流行。目前雖已研制了弱毒疫苗供種鵝或雛鵝使用，但該病并未從田間消失，仍然持續(xù)性對(duì)養(yǎng)鵝業(yè)造成經(jīng)濟(jì)損失。

反向遺傳技術(shù)是開展病毒研究的一種有用平臺(tái)，在闡明病毒致病機(jī)制和疫苗研制中能夠發(fā)揮重要作用。同樣，構(gòu)建鵝細(xì)小病毒感染性分子克隆，以此為基礎(chǔ)可以對(duì)GPV的特定基因展開更為有效的研究，也是GPV疫苗研制的一個(gè)有用平臺(tái)。

病毒拯救是反向遺傳操作上的重要一環(huán)，大多是將構(gòu)建的質(zhì)粒或RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物轉(zhuǎn)染細(xì)胞的途徑來實(shí)現(xiàn)拯救目的。轉(zhuǎn)染原代的鵝胚成纖維細(xì)胞拯救感染性GPV也有報(bào)道，對(duì)于細(xì)小病毒而言，細(xì)胞處于分裂期時(shí)才最適于病毒復(fù)制，因此轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞所處狀態(tài)對(duì)轉(zhuǎn)染拯救結(jié)果影響很大?？傮w來看，在細(xì)胞上進(jìn)行轉(zhuǎn)染不僅費(fèi)事，拯救效率也不高。因此，若能建立一種簡(jiǎn)便、高效的拯救方法，將極大的方便并推動(dòng)GPV相關(guān)基礎(chǔ)研究的深入開展。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種簡(jiǎn)便高效的鵝細(xì)小病毒(Goose parvovirus,GPV)感染性克隆質(zhì)粒的拯救方法。

本發(fā)明所述的鵝細(xì)小病毒感染性克隆質(zhì)粒的拯救方法，是將GPV的完整基因組克隆入載體質(zhì)粒pBSKNB，獲得重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑混合后，通過絨毛尿囊膜途徑接種非免疫鵝胚，重組質(zhì)粒在鵝胚中得到拯救；所述pBSKNB載體，是將商品化的pBluescript II(SK)質(zhì)粒上原有的EcoRV和HindIII酶切位點(diǎn)分別用NcoI和BclI位點(diǎn)替換而得到。

具體地：將重組質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000按照一定比例1:2.5(μg/μl)比例混合后，通過絨毛尿囊膜途徑接種11日齡非免疫鵝胚。鵝胚在接種后120h～192h之間死亡，胚體具有典型的GPV感染特征，表現(xiàn)為胚體出血、絨毛尿囊膜水腫的典型特征。拯救出的病毒具有與親本病毒相近的生物學(xué)特性。

進(jìn)一步地，為了排除轉(zhuǎn)染拯救過程中親本GPV毒株污染的可能，可通過overlap PCR方法，在重組質(zhì)粒的克隆基因組內(nèi)部引入兩個(gè)同義堿基突變作為遺傳標(biāo)記，得到的帶有遺傳標(biāo)記的重組質(zhì)粒再施以轉(zhuǎn)染及拯救過程。更具體地，可以是在重組質(zhì)粒的VP1基因中引入兩個(gè)突變堿基作為遺傳標(biāo)記。

本發(fā)明中，所述的重組質(zhì)粒是插入GPV LH株完整基因組pLH質(zhì)粒，或者是插入GPV LH株完整基因組并引入遺傳標(biāo)記的pLHΔ質(zhì)粒，但是，本發(fā)明的拯救方法適用于但不僅限于插入GPV LH株完整基因組的pLH質(zhì)?；騪LHΔ質(zhì)粒。對(duì)其它GPV強(qiáng)毒分離株或者鵝胚化弱毒株，以本發(fā)明內(nèi)容公開的相同構(gòu)建方法克隆其全基因組，獲得重組質(zhì)粒，重組質(zhì)粒的拯救方法同pLH質(zhì)?；騪LHΔ質(zhì)粒。

本發(fā)明所述的質(zhì)粒pLH，它的構(gòu)建方法在于：超速離心濃縮GPV LH株病毒，提取病毒的基因組單鏈DNA，體外退火后生成雙股DNA。選用BclI和NcoI酶切基因組DNA生成亞基因組片段，分別克隆入自行改造的pBSKNB載體的相應(yīng)酶切位點(diǎn)，再通過酶切-連接的常規(guī)分子操作，拼接獲得含有完整基因組的質(zhì)粒pLH。

進(jìn)一步地，通過overlap PCR方法，在pLH質(zhì)粒的VP1基因中引入兩個(gè)同義突變堿基作為遺傳標(biāo)記，獲得質(zhì)粒pLHΔ。

本發(fā)明中所述相近的生物學(xué)特性是指在鵝胚半數(shù)致死量(ELD₅₀)和感染試驗(yàn)中的雛鵝死亡率這兩個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)上，拯救病毒具有與親本病毒相近的數(shù)值。

本發(fā)明公開了LH株的完整基因組序列。LH株基因組由5047個(gè)堿基組成(SEQ IB NO.5)，LH株的ITR由414個(gè)堿基組成，其中375個(gè)堿基形成回文結(jié)構(gòu)，其余39個(gè)堿基構(gòu)成D區(qū)序列?；蚪M左側(cè)的ITR的D區(qū)序列與右側(cè)ITR的D′序列反向互補(bǔ)，這一特性將使得基因組分子能夠形成一個(gè)更大范圍的回文。

作為一個(gè)具體的操作，本發(fā)明公開了一種GPV全基因組克隆的構(gòu)建方法，該方法對(duì)其它GPV毒株同樣適用，它包括如下步驟：

(1)GPV核酸的提取

GPVLH株在鵝胚中增殖，收集的尿囊液分別經(jīng)差速和超速離心濃縮到原有體積的1/50。采用SDS-蛋白酶K消化法提取病毒核酸。經(jīng)95℃變性10min，緩慢冷卻至65℃退火，使單股DNA形成雙股DNA，經(jīng)0.8％瓊脂糖凝膠電泳，可觀察到約5.1kb基因組DNA。

(2)全基因組克隆的構(gòu)建

將提取的GPV LH株基因組雙股DNA用NcoI和BclI限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，產(chǎn)生的左中右三個(gè)片段大小分別為0.6kb、3.2kb和1.3kb，各片段切膠回收。將0.6kb的左片段克隆入載體質(zhì)粒pBSKNB的HincII-BclI之間，產(chǎn)生pBSKNB-L質(zhì)粒。將3.2kb的中間片段插入質(zhì)粒pBSKNB的BclI-NcoI之間，產(chǎn)生pBSKNB-M質(zhì)粒。將1.3kb的右片段插入pBSKNB的NcoI-SmaI位點(diǎn)之間，獲得pBSKNB-R質(zhì)粒。

在成功克隆亞基因組片段并測(cè)序的基礎(chǔ)上，通過常規(guī)的酶切-連接操作，將各亞基因組片段正確的拼接，從而獲得包含LH株完整基因組的克隆質(zhì)粒pLH。

本發(fā)明還公開了pLH質(zhì)粒中遺傳標(biāo)記引入的方法，以便于將拯救病毒與親本病毒LH株區(qū)分開(見附圖5)。

在pLH質(zhì)粒的VP1基因中引入兩個(gè)突變堿基作為遺傳標(biāo)記，不改變氨基酸組成，獲得質(zhì)粒pLHΔ。利用LH株基因組內(nèi)部在擬突變位點(diǎn)兩側(cè)分別存在單一的SexAI和NcoI位點(diǎn)的條件，設(shè)計(jì)了一組overlap PCR引物，引物代號(hào)和序列分別為：

overlap-1:GCAGGAACAATTACCAGGTACG(SexAI)(SEQ IB NO.1)

overlap-2:GTGGTCGGTAGTTCCCTGT(SEQ IB NO.2)

overlap-3:ACAGGGAACTACCGACCAC(SEQ IB NO.3)

overlap-4:CGGCCCATGGTGCCATAAGC(NcoI)(SEQ IB NO.4)

方框內(nèi)部為突變堿基，兩個(gè)突變堿基分別為G→A突變和T→C突變，突變堿基用方框表示。Overlap-1引物和Overlap-4引物內(nèi)部分別含有SexAI和NcoI位點(diǎn)。

通過overlap PCR,結(jié)合酶切連接操作，能夠?qū)?個(gè)突變堿基引入pLH質(zhì)粒，獲得質(zhì)粒pLHΔ。

本發(fā)明還公開了pLHΔ質(zhì)粒通過絨毛尿囊膜轉(zhuǎn)染鵝胚拯救病毒的具體方法：

采用Lipofectamine 2000作為轉(zhuǎn)染試劑。質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑的比例按照1：2.5(μg：μl)進(jìn)行。吸取16μg pLHΔ質(zhì)粒溶液至1個(gè)滅菌的1.5ml離心管中，用opti-DMEM培養(yǎng)液(Invitrogen，美國(guó))稀釋至1ml；另一個(gè)離心管內(nèi)加入40μl Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑，加入960μl Opti-DMEM培養(yǎng)液混勻。將稀釋后的質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑靜置5min后，輕柔混勻，室溫靜置20min后即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。每只鵝胚通過絨毛尿囊膜接種0.25ml,其中包含2.0μg質(zhì)粒。鵝胚在接種后第5天開始出現(xiàn)死亡，至轉(zhuǎn)染后第8天，死亡率達(dá)到75％。拯救病毒在鵝胚上能夠成功傳代。

本發(fā)明對(duì)拯救病毒的生物性特性進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明：拯救病毒的鵝胚半數(shù)致死量(ELD₅₀)達(dá)到每毫升5×10^4.77,與親本LH株極為相似，后者的ELD₅₀為每毫升5×10^4.36。1日齡雛鵝分別接種了攜帶遺傳標(biāo)記的拯救病毒和親本病毒，在15天的觀察期內(nèi)，接種親本病毒組雛鵝在第3天開始出現(xiàn)死亡，而拯救病毒組在攻毒后第4天出現(xiàn)死亡。到攻毒后的第9天，兩組雛鵝死亡率都達(dá)到了93.8％。而接種生理鹽水的對(duì)照組雛鵝均生長(zhǎng)健康無一死亡。拯救病毒攻毒組死亡雛鵝同樣展現(xiàn)出“小鵝瘟”特征性病變，包括典型的腸栓形成、腸粘膜脫落等病理變化(見附圖7)。實(shí)驗(yàn)表明拯救病毒具有與親本病毒相近的生物學(xué)特性。該拯救方法操作簡(jiǎn)便高效，避免了轉(zhuǎn)染細(xì)胞帶來的繁瑣和低效問題，在GPV反向遺傳學(xué)研究和疫苗創(chuàng)制上具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

附圖說明

圖1.GPV LH株的基因組DNA電泳分析.M：λDNA/HindIII分子量markers.1：提取的病毒核酸。

圖2.GPV LH株全基因組的構(gòu)建策略。

圖3是pLH質(zhì)粒圖譜。

圖4.pLH質(zhì)粒的酶切鑒定.M：1kb ladder DNA分子量標(biāo)準(zhǔn).1.NcoI酶切；2.XhoI和BamHI雙酶切；3.SphI酶切。

圖5.pLHΔ質(zhì)粒轉(zhuǎn)染拯救病毒與親本強(qiáng)毒株的區(qū)分。親本強(qiáng)毒株的擴(kuò)增靶片段用HindIII酶切，生成0.9kb和0.7kb兩條片段；而拯救病毒由于引入的堿基突變，同樣的1.6kb靶片段不能為HindIII切開。

圖6.拯救病毒和親本病毒株的攻毒試驗(yàn)。親本病毒在攻毒后第3天出現(xiàn)死亡病例，拯救病毒在攻毒后第4天出現(xiàn)死亡病例，在攻毒后第9天，兩組存活率都下降到6.2％。

圖7.pLHΔ拯救病毒攻毒試驗(yàn)中死亡雛鵝的腸道病理變化(A)以及從臟器提取病毒DNA為模板的PCR擴(kuò)增片段的序列測(cè)定結(jié)果(B)。

具體實(shí)施方式

以下方法針對(duì)我們分離的GPV LH株(Wang J,et al.,Arch Virol,2015,160(3):711-718)展開，但所敘述方法對(duì)其它GPV毒株一樣適用。

1.GPV全基因組克隆質(zhì)粒pLH的構(gòu)建

1.1.病毒擴(kuò)增

將保存的GPV LH株第2代鵝胚尿囊液，用滅菌生理鹽水按1:10比例稀釋，加入青、鏈霉素至終濃度各2000μg或IU/ml，置37℃培養(yǎng)箱中孵育30min后接種鵝胚。將經(jīng)稀釋的病毒液經(jīng)尿囊腔途徑接種12日齡鵝胚，每只0.2ml。石蠟封口后放入37℃孵化箱中，每隔8h照蛋1次，剔除48小時(shí)前死亡的鵝胚。收集48小時(shí)后死亡鵝胚，置于4℃冰箱放置4～6h后無菌收取尿囊液，儲(chǔ)存在-40℃冰箱中代用。

1.2.病毒純化

將收集到的約400ml含病毒尿囊液按11,000g離心20min，取上清后加入1/3體積的氯仿，劇烈震蕩，以同樣的離心力轉(zhuǎn)速再次離心20min，收集上層水相再經(jīng)150,000g離心力超速離心3h(SW32Ti轉(zhuǎn)子,Beckman)。棄去上清，病毒沉淀用5ml TE緩沖液(50mM Tris，20mM EDTA，pH 8.0)溶解，-70℃保存待用。

1.3 病毒DNA提取

取500μl濃縮病毒液，分別加入SDS和蛋白酶K至終濃度為1％和400μg/ml。45℃水浴2小時(shí)。用苯酚-氯仿-異戊醇(25:24:1)和氯仿-異戊醇(24:1)各抽提1次。上清液加入2.5倍體積的無水乙醇和十分之一體積的醋酸鈉(pH 5.2)，-70℃沉淀過夜。次日15,000rpm/min，離心20min，去上清，核酸沉淀用70％酒精洗滌，再次15,000rpm/min，離心10min，去上清，沉淀涼干后，用30μL STE緩沖液(10mM Tris，1mM EDTA，100mM NaCL，pH 8.0)溶解。將提取的核酸置于95℃水浴10min，使單股DNA發(fā)生熱變性，然后緩慢冷卻到65℃，此時(shí)單股DNA可退火形成雙鏈。取10μL經(jīng)0.8％瓊脂糖凝膠電泳分析DNA，見附圖1。

1.4 基因組克隆

為了便于克隆，我們對(duì)pBluescriptII(SK)質(zhì)粒(Agilent公司，美國(guó))的酶切位點(diǎn)進(jìn)行了改造，將質(zhì)粒上原有的EcoRV和HindIII酶切位點(diǎn)分別用NcoI和BclI位點(diǎn)替換，改造后的質(zhì)粒命名為pBSKNB。

將提取的GPV LH株基因組雙股DNA用NcoI和BclI限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，產(chǎn)生的左中右三個(gè)片段大小分別為0.6kb、3.2kb和1.3kb，各片段切膠回收。將0.6kb的左片段克隆入載體質(zhì)粒pBSKNB的HincII-BclI之間，產(chǎn)生pBSKNB-L質(zhì)粒。將3.2kb的中間片段插入質(zhì)粒pBSKNB的BclI-NcoI之間，產(chǎn)生pBSKNB-M質(zhì)粒。將1.3kb的右片段插入pBSKNB的NcoI-SmaI位點(diǎn)之間，獲得pBSKNB-R質(zhì)粒，構(gòu)建策略見附圖2。

在完成對(duì)各個(gè)亞片段克隆并測(cè)序的基礎(chǔ)上，對(duì)pBSKNB-L質(zhì)粒用XhoI和BclI進(jìn)行雙酶切，將內(nèi)部的0.6kb片段切膠回收，pBSKNB-M質(zhì)粒同樣用XhoI和BclI雙酶切線性化后，與0.6kb片段進(jìn)行連接產(chǎn)生重組質(zhì)粒pBSKNB-LM。然后進(jìn)一步將pBSKNB-R質(zhì)粒用NcoI和BamHI進(jìn)行雙酶切后生成的1.3kb片段插入到pBSKNB-LM質(zhì)粒的NcoI-BamHI位點(diǎn)之間，最終產(chǎn)生包含LH株全基因組的克隆質(zhì)粒pLH，質(zhì)粒pLH圖譜見附圖3。pLH質(zhì)粒的酶切鑒定見圖4。構(gòu)建的重組質(zhì)粒均轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增。

1.5 基因組序列分析

各亞基因組片段克隆送華大基因上海有限公司進(jìn)行測(cè)序。由于ITR二級(jí)結(jié)構(gòu)的干擾以及Bubble區(qū)序列存在反轉(zhuǎn)的特點(diǎn)，故ITR序列不能直接測(cè)出。利用ITR loop區(qū)存在單一的SphI酶切位點(diǎn)的事實(shí)，故對(duì)包含ITR片段的亞克隆片段分別用SphI和XhoI或BamHI進(jìn)行雙酶切，產(chǎn)生的亞片段分別克隆入pUC18或pBSK質(zhì)粒的相應(yīng)位點(diǎn)，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，陽性克隆測(cè)序后可獲得一致的ITR序列。利用DNASTAR軟件包中的SeqManII程序?qū)λ鶞y(cè)片段序列進(jìn)行拼接獲得完整的基因組序列，利用MegAlign程序進(jìn)行序列同源性分析。

2.pLH質(zhì)粒遺傳標(biāo)記的引入

為了排除拯救病毒可能來自于試驗(yàn)過程中親本病毒或GPV野毒株污染的可能，采用overlap PCR方法在pLH質(zhì)粒內(nèi)部處于VP1基因的HindIII位點(diǎn)處引入堿基突變，但不改變氨基酸的組成。

2.1 overlap PCR引物設(shè)計(jì)

利用LH株基因組內(nèi)部在擬突變位點(diǎn)兩側(cè)分別存在單一的SexAI和NcoI位點(diǎn)的條件，設(shè)計(jì)了一組重疊PCR引物，引物由大連寶生物有限公司合成，引物代號(hào)和序列分別為：

overlap-1:GCAGGAACAATTACCAGGTACG(SexAI)

overlap-2:GTGGTCGGTAGTTCCCTGT

overlap-3:ACAGGGAACTACCGACCAC

overlap-4:CGGCCCATGGTGCCATAAGC(NcoI)

方框內(nèi)部為突變堿基，兩個(gè)突變堿基分別為G→A突變和T→C突變，突變堿基用方框表示。Overlap-1引物和Overlap-4引物內(nèi)部分別含有SexAI和NcoI位點(diǎn)。

2.2 overlap PCR擴(kuò)增

采用Pfu高保真DNA聚合酶(Takara，大連)，以overlap-1引物和overlap-2引物擴(kuò)增0.7kb的A片段，overlap-3引物和overlap-4引物擴(kuò)增0.9kb的B片段。A、B擴(kuò)增片段經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分離后，分別采用凝膠回收試劑盒(天根生物科技有限公司)切膠回收目的片段。

回收的A、B產(chǎn)物各取1μl混合后作為第二步PCR擴(kuò)增反應(yīng)的模板。以overlap-1和overlap-4為上下游引物。反應(yīng)體系為：10×buffer 5μl，上下游引物各1μl，模板1μl，dNTP 4μl，pfu高保真DNA聚合酶0.5μl，超純水補(bǔ)至50μl體系。反應(yīng)程序設(shè)定為：95℃,2min變性；然后執(zhí)行94℃，30s；53℃，30s，72℃，1min,40s，共25個(gè)循環(huán)；72℃延伸5min結(jié)束。預(yù)期擴(kuò)增片段為1.6kb。

反應(yīng)結(jié)束后，將50μl PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)0.8％瓊脂糖凝膠電泳分離后，切膠回收目的片段。目的片段用SexAI和NcoI雙酶切，酒精沉淀酶切片段后，用20μl超純水溶解。

2.3 突變位點(diǎn)導(dǎo)入pLH質(zhì)粒

考慮到SexAI位點(diǎn)對(duì)甲基化質(zhì)粒不能切開，故將pLH質(zhì)粒轉(zhuǎn)入HST04宿主菌(Takara,日本)以消除質(zhì)粒甲基化。然后用SexAI和NcoI雙酶切，電泳分離線性化片段，然后切膠回收6.4kb片段。將回收的1.6kb突變片段與6.4kb片段連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布LB平板。采用HindIII酶切消化質(zhì)粒的方法來鑒定陽性的突變插入克隆，并進(jìn)一步選用自帶引物送商業(yè)化公司進(jìn)行測(cè)序，確保在突變位點(diǎn)正確引入的同時(shí)，其它位點(diǎn)未發(fā)生改變。陽性克隆命名為pLHΔ。

3.pLHΔ質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染拯救

3.1.pLHΔ質(zhì)粒的純化

挑取pLHΔ克隆單個(gè)菌落，接種于含有氨芐青霉素(100μg/ml)的LB培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)16～24h。采用Qiagen公司的Miniprep試劑盒純化質(zhì)粒，具體操作按照其說明書進(jìn)行。采用Nanodrop 2000核酸測(cè)定儀，檢測(cè)質(zhì)粒純度，確保OD260/280在1.8-2.0之間。

3.2.質(zhì)粒-轉(zhuǎn)染試劑混合物的配制

轉(zhuǎn)染混合物的配制參照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行。質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑的比例按照1:2.5(μg:μL)進(jìn)行。吸取16μg質(zhì)粒溶液至1個(gè)滅菌的指形管中，用opti-DMEM培養(yǎng)液(Invitrogen)稀釋至1ml；另一個(gè)離心管內(nèi)加入40μl Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑，加入960μl opti-DMEM培養(yǎng)液混勻。將稀釋后的質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑靜置5min后，輕柔混勻，室溫靜置20min后即可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

3.3.轉(zhuǎn)染鵝胚

上述配制好的轉(zhuǎn)染試劑，經(jīng)絨毛尿囊膜途徑接種8個(gè)11日齡鵝胚，每只鵝胚接種0.25ml,其中包含2.0μg質(zhì)粒。石蠟封口后放入孵化箱內(nèi)孵育，每隔8h照胚一次，棄去24小時(shí)內(nèi)死亡鵝胚。收集72h死亡鵝胚的尿囊液，檢查胚體病變。結(jié)果表明，pLHΔ質(zhì)粒通過絨毛尿囊膜途徑轉(zhuǎn)染11日齡鵝胚，鵝胚在接種后第5天開始死亡，至轉(zhuǎn)染后第8天，死亡率達(dá)到75％。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，絨毛尿囊膜途徑轉(zhuǎn)染質(zhì)粒適合感染性GPV的拯救，死亡鵝胚胚體呈現(xiàn)典型的GPV感染的特征性變化，表現(xiàn)為胚體出血和絨毛尿囊膜水腫增厚。

3.4 拯救病毒的傳代

將拯救出的第1代病毒尿囊液用氯仿抽提1次，用DNA酶I(Promega，美國(guó))于37℃作用30min,以降解殘存的質(zhì)粒DNA，再用PBS緩沖液做1：5稀釋后接種11日齡鵝胚。

3.5拯救病毒與親本病毒的區(qū)分

通過PCR方法，可以擴(kuò)增出覆蓋遺傳標(biāo)記位點(diǎn)的約1.6kb片段，該片段不能為HindIII所切開，而以親本病毒提取的DNA為模板擴(kuò)增出的1.6kb片段，用HindIII酶切，產(chǎn)生0.9-kb和0.7-kb的兩條片段(圖5)。試驗(yàn)結(jié)果確切的表明拯救病毒來自于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染拯救所產(chǎn)生，而不可能是親本病毒或野毒污染的結(jié)果。對(duì)拯救病毒的序列分析也表明，除了作為遺傳標(biāo)記引入的2個(gè)突變堿基，其它部分序列與親本序列完全一致。

4.拯救病毒的生物學(xué)特性

4.1 病毒滴度(ELD₅₀)的測(cè)定

將新收集的含拯救病毒或親本病毒的尿囊液稀釋成10^-3、10^-4、10^-5和10^-6四個(gè)稀釋度，通過尿囊腔接種途徑接種12日齡鵝胚。每只鵝胚接種0.2ml，每個(gè)稀釋度接種5個(gè)鵝胚。37℃孵化箱中繼續(xù)孵育，棄去24h內(nèi)死亡鵝胚，連續(xù)觀察10天，統(tǒng)計(jì)每組鵝胚死亡個(gè)數(shù)，用Reed-Muench方法計(jì)算病毒滴度。試驗(yàn)結(jié)果表明：拯救病毒的ELD₅₀達(dá)到每毫升5×10^4.77,與親本LH株極為相似，后者的ELD₅₀為每毫升5×10^4.36。

4.2 病毒中和實(shí)驗(yàn)

200ELD₅₀的拯救病毒和親本病毒LH株與等體積的經(jīng)10倍稀釋的GPV陽性血清混合，37℃溫箱孵育30min，通過尿囊腔途徑各接種5個(gè)12日齡鵝胚。對(duì)照組則以病毒液與GPV陰性血清混合?？笹PV陽性血清是以GPV疫苗株SYG61v免疫鵝群方法制備獲得。中和試驗(yàn)結(jié)果表明，用GPV抗血清作用后的拯救病毒和親本病毒接種的5個(gè)鵝胚無一死亡，而用生理鹽水處理的對(duì)照組中鵝胚全部在84-120小時(shí)之間死亡，這表明拯救病毒擁有與親本病毒相一致的抗原性。

4.3 雛鵝攻毒實(shí)驗(yàn)

將48只1日齡易感雛鵝隨機(jī)分成3組。第1組的16只雛鵝頸部皮下注射0.3ml含3×10⁴ELD₅₀的拯救病毒；第2組的16只雛鵝頸部皮下注射等量的LH株親本病毒；第3組16只雛鵝注射滅菌生理鹽水作為陰性對(duì)照組。三組雛鵝分別在單獨(dú)的房間隔離飼養(yǎng)15d，記錄死亡個(gè)數(shù)和死亡時(shí)間，所有死亡雛鵝均剖解觀察病理變化，計(jì)算在不同時(shí)間點(diǎn)的死亡率和存活率。

結(jié)果表明，兩種1日齡雛鵝分別接種了攜帶遺傳標(biāo)記的拯救病毒和親本病毒，在15天的觀察期內(nèi)，接種親本病毒組雛鵝在第3天開始出現(xiàn)死亡，而拯救病毒組在攻毒后第4天出現(xiàn)死亡。到攻毒后的第9天，兩組雛鵝死亡率都達(dá)到了93.8％(圖6)。而接種生理鹽水的對(duì)照組雛鵝均生長(zhǎng)健康無一死亡。拯救病毒攻毒組死亡雛鵝同樣展現(xiàn)出“小鵝瘟”特征性病變，包括典型的腸栓形成、腸粘膜脫落等病理變化(圖7a)。

4.4 病料中核酸檢測(cè)

取攻毒死亡雛鵝肝臟或腸道組織進(jìn)行PCR檢測(cè)。將肝臟或腸道組織剪碎，加適量PBS研磨，移入1.5ml離心管中，10000rpm離心10min。上清轉(zhuǎn)移到新的離心管中，加入等量氯仿抽提1次，10000rpm離心10min。上層水相轉(zhuǎn)移到另一離心管中，沸水中水浴10min，12000rpm離心5min，吸取上清用作擴(kuò)增模板。用overlap PCR中的overlap-1和overlap-4作為檢測(cè)引物，擴(kuò)增片段為1.6kb。PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳后，觀察擴(kuò)增條帶大小，切膠回收目的片段。用HindIII進(jìn)行酶切或PCR產(chǎn)物直接測(cè)序方法來確定死亡雛鵝是死于拯救病毒或是親本病毒。

結(jié)果表明，從肝臟、腸道組織提取病毒核酸作為DNA模板，能夠擴(kuò)增出包含遺傳標(biāo)記位點(diǎn)在內(nèi)的1.6kb的特異片段，這些擴(kuò)增片段均不能為HindIII所切開。對(duì)PCR產(chǎn)物的直接測(cè)序也證實(shí)在HindIII位點(diǎn)處均存在2個(gè)預(yù)設(shè)的堿基突變(圖7b)，這充分說明在拯救病毒攻毒組中，死亡雛鵝確實(shí)源于拯救的感染所致，可以排出攻毒試驗(yàn)期間，雛鵝感染親本病毒或其它GPV野毒的可能。當(dāng)前的試驗(yàn)結(jié)果表明，拯救病毒擁有與親本LH病毒株相似的毒力。

SEQUENCE LISTING

<110> 揚(yáng)州大學(xué)

<120> 一種鵝細(xì)小病毒感染性克隆的拯救方法

<130>

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gcaggaacaa ttaccaggta cg 22

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gtggtcggtg agtttccctg t 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

acagggaaac tcaccgacca c 21

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cggcccatgg tgccataagc 20

<210> 5

<211> 5047

<212> DNA

<213> 鵝細(xì)小病毒LH株

<400> 5

tcattggagg gttcgttcgt tcgaaccagc caatcagggg agggggaagt gacgcaagtt 60

ccggtgacgc acatccggtg acgtagttcc ggtcacgtgc ttcctgtcac gtgtttccgg 120

tcacgtgact tccggtcatg tgacttccgg tgacgtgttt ccggctgtta ggttgaccgc 180

gcgcatgcgc gcggttagcc caatagttaa gccggaaaca cgtcaccgga agtcacatga 240

ccggaagtca cgtgaccgga aacacgtgac aggaagcacg tgaccggaac tacgtcaccg 300

gatgtgcgtc accggaactt gcgtcacttc cccctcccct gattggctgg ttcgaacgaa 360

cgaaccctcc aatgagactc aaggacaaga ggatattttg cgcgccagga agtgacgtgc 420

aatgccaccc tatataaccc aggaaacttc cggtttagtt cattcgttac tctgctctca 480

gagagaacgg acctcaggtc ggagagatgg cactttctag gcctcttcag atttcttctg 540

ataaattcta tgaagttatc attagattac catcggatat tgatcaagat gtccccggtc 600

tgtctcttaa ctttgtagaa tggctttcta ccggagtttg ggagcccacg ggcatctgga 660

acatggagca tgtgaatcta ccgatggtga ccttggcaga gaagatcaag aacattttca 720

tacaaagatg gaatcagttc aaccaggacg aaacggactt cttctttcaa ctggaagaag 780

gcagtgagta cattcatctt cattgctgta ttgcccaggg caatgtacgg tcttttgttc 840

tcgggagata tatgtctcag ataaaagact ctatcataag agatgtatat gaagggaaac 900

aaatcaagat ccccgattgg tttgctatta ctaaaaccaa gaggggagga cagaataaga 960

ccgtgactgc agcatacata ctgcattacc ttattcctaa aaagcaacct gaactgcaat 1020

gggcctttac caatatgcct ttattcactg ctgctgctct ttgtctgcaa aagcggcaag 1080

aattgctgga tgcatttcaa gaaagtgatt tggctgcccc tttacctgat cctcaagcat 1140

caactgtggc accgcttatt tccaacagag cggcaaagaa ctatagcaac cttgttgatt 1200

ggctcattga aatggggata acatctgaga agcaatggct cactgagaac cgagagagct 1260

acagaagctt tcaagcaact tcttcaaata atagacaagt gaaagctgca ctggaaaatg 1320

cccgtgctga aatgttattg acaaagactg caaccgatta cctgatagga aaagaccctg 1380

tcctggacat aactaagaat agggtctatc agattctgaa aatgaataac tacaaccctc 1440

aatacatagg aagtatcctg tgcggctggg tgaagagaga gttcaacaaa agaaacgcca 1500

tatggctcta cggacctgcc accaccggga agaccaacat tgcagaagct attgcccatg 1560

ctgtaccctt ctatggctgt gttaactgga ctaatgagaa ctttcctttt aatgattgtg 1620

ttgataaaat gctgatttgg tgggaggagg gaaaaatgac taataaggtt gttgaatctg 1680

caaaagcaat tttaggaggg tctgctgtcc gggtagatca gaaatgtaaa ggatctgttt 1740

gtattgaacc tactcctgta attattacta gtaatactga tatgtgtatg attgttgatg 1800

gcaactctac tacaatggaa catagaatac cgttagagga gcgtatgttt caaatcgtcc 1860

tatcacataa attggagcct tcttttggaa aaatttctaa aaaagaagtc agagaatttt 1920

tcaaatgggc caatgataat ctagttcctg ttgtgtctga gttcaaagtc cgaacgaatg 1980

aacaaactaa cttgccagag cccgttcctg aacgagcgaa cgagccggag gagcctccta 2040

agatctgggc tcctcctact agggaggagt tagaagagct tttaagagcc agcccagaat 2100

tgttctcatc agtcgctcca attcctgtga ctcctcagaa ctcccctgag cctaagagaa 2160

gcaggaacaa ttaccaggta cgctgcgctt tgcatactta tgacaattct atggatgtat 2220

ttgaatgtat ggaatgtgag aaagcaaact ttcctgaatt tcaacctctg ggagaaaatt 2280

attgtgatga acatgggtgg tatgattgtg ctatatgtaa agagttgaaa aatgaacttg 2340

cagaaattga gcatgtgttt gaacttgatg atgctgaaaa tgaacaataa agatgactca 2400

aagcagatat gtctactttt ttagattctt ttgaagagtg gtatgaaact gcagccgcct 2460

cgtggcggaa tctgaaagct ggagcccctc acccaaaacc aaaccagcag actcagtctg 2520

tgtctccagc cagagaaccc gaacgaagag ataataaccg gggctttgta cttcctggct 2580

ataagtatct tggccctggt aacggccttg ataaagggcc acccgttaat aaggcggaca 2640

gcgtcgcgct tgaacacgac aaggcctacg accaacagct taaagcggga gacaacccat 2700

atataaaatt caatcacgct gaccaggact ttatagatag cctccaagac gaccagtcgt 2760

tcggaggtaa tcttggaaag gctgtatttc aggccaaaaa acgtatctta gaaccatttg 2820

gcctagtaga agatcctgtc aacacggcac ctgcaaaaaa aaatacaggg aagcttaccg 2880

accactaccc ggtagttaag aagcctaaac ttaccgagga agtcagtgcg ggaggtggta 2940

gtagtgccgt acaagacgga ggagccaccg cggagggcac cgaacctgtg gcagcatctg 3000

aaatggcaga gggaggaggc ggagctttgg gcgacgcttc agggggtgcc gatggagtgg 3060

gtaatgcctc gggaaattgg cattgcgatt cccaatggat gggaaacaca gtcatcacaa 3120

agaccaccag aacctgggtc ctgccaagct acaacaacca catctacaaa gcgattacca 3180

gtggaacctc tcaagatgca aatgtccagt atgcaggata cagtacccct tggggatact 3240

ttgatttcaa ccgcttccac tgccacttct cccctagaga ctggcagaga cttatcaaca 3300

accattgggg aatcagaccc aagtctctta aattcaagat cttcaatgtc caagtcaaag 3360

aagtcacaac gcaggatcag acgaagacca ttgcaaacaa tctcacgtca acaattcaag 3420

tctttacgga tgacgagcat caactcccgt atgtcctggg ctcggctacg gaaggcacca 3480

tgccgccgtt cccgtcggat gtctatgccc tgccgcagta cgggtattgc acaatgcaca 3540

ccaaccagaa cggtgcacga ttcaatgacc ggagtgcatt ctactgctta gaatacttcc 3600

ccagtcagat gctaagaaca ggcaacaact ttgagttcac gtttgacttt gaagaagttc 3660

ctttccacag catgttcgct cattcacagg acttagacag gctgatgaac cccttagtgg 3720

atcaatacct ctggaatttc aatgaggtag acagcagcag aaatgctcaa tttaaaaagg 3780

ctgtgaaagg cgcttatgga accatgggcc gcaattggct gccaggacct aaattcctgg 3840

accagagagt tagggcctat acaggcggaa cagataatta tgcaaactgg aacatctgga 3900

gtaatggaaa caaggttaat ttgaaggaca ggcagtacct cctgcaaccc ggacctgtat 3960

cagctactca tacagaagca gaggcttcca gtatcccagc ccaaaatatt ttaggtttag 4020

ctaaagatcc atacagatct ggcagcacta cagcaggaat aagtgatatt atggtcacgg 4080

acgagcagga agtagcacct acaaacggcg tagggtggaa accatatggc aagactgtaa 4140

cgaatgaaca aaacactact acagctccta caagttcaga tctggatgtt cttggagctt 4200

taccaggaat ggtttggcag aacagggata tatatctgca gggacctatt tgggcaaaaa 4260

taccgaagac tgatggtaaa ttccatcctt ctccgaatct cggaggattt ggtctgcaca 4320

atccaccacc gcaggtgttc atcaagaata caccagtgcc tgcagaccct ccagtagaat 4380

acgtgcacca gaagtggaat tcctacataa cccagtactc tacgggccag tgtacagtag 4440

agatggtgtg ggagctgaga aaagagaatt caaagagatg gaacccagaa atccagttca 4500

ccagtaattt cagtgacaga acaagcatca tgtttgcacc taatgaaact ggtggatatg 4560

tagaagatag attaattgga accagatatc taactcaaaa tctgtaaatt ctgtgtaaaa 4620

attcaaataa agcacttcct ggcgcgcaaa atatcctctt gtccttgagt ctcattggag 4680

ggttcgttcg ttcgaaccag ccaatcaggg gagggggaag tgacgcaagt tccggtgacg 4740

cacatccggt gacgtagttc cggtcacgtg cttcctgtca cgtgtttccg gtcacgtgac 4800

ttccggtcat gtgacttccg gtgacgtgtt tccggcttaa ctattgggct gaccgcgcgc 4860

atgcgcgcgg tcaacctaac agccggaaac acgtcaccgg aagtcacatg accggaagtc 4920

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caccggaact tgcgtcactt ccccctcccc tgattggctg gttcgaacga acgaaccctc 5040

caatgag 5047