本發(fā)明涉及兩種寡核苷酸以及其增效抗原和治療腫瘤的用途。
背景技術(shù)：
：：T淋巴細胞激活是激發(fā)個體對抗原發(fā)生高效免疫應(yīng)答和抗腫瘤免疫應(yīng)答的關(guān)鍵條件。T淋巴細胞激活需要獲得兩個激活信號。第一激活信號來自T淋巴細胞通過T細胞抗原受體(Tcellantigenreceptor，TCR)識別抗原提呈細胞(antigen-presentingcell，APC)或靶細胞表面的抗原肽-MHC復(fù)合物。第二激活信號來自T淋巴細胞通過CD28分子識別、結(jié)合APC或靶細胞表面的B7分子(包括CD80和CD86)。第二激活信號也稱為共刺激信號(costimulatorysignals)。僅獲得第一激活信號的T淋巴細胞不能充分激活，甚至?xí)M入免疫耐受狀態(tài)。只有獲得第一和第二激活信號后，T淋巴細胞才能被充分激活而行使功能[SharmaP.etal.Science.2015Apr3；348(6230)：56-61；GreenwaldRJ，etal.AnnuRevImmunol.2005；23：515-48]。T淋巴細胞在激活過程中也激活抑制信號通路，該抑制信號通路的激活可抑制T淋巴細胞的激活因而抑制其行使功能[SharmaP.etal.Science.2015Apr3；348(6230)：56-61；GreenwaldRJ，etal.AnnuRevImmunol.2005；23：515-48]。細胞毒性T淋巴細胞抗原4(CytotoxicT-LymphocyteAntigen4，CTLA-4，也稱CD152，是一種介導(dǎo)該抑制信號通路的蛋白質(zhì)。CTLA-4表達在激活的T淋巴細胞(包括CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞)的表面，能和CD28競爭結(jié)合APC或靶細胞表面的B7分子(CD80和CD86)。和轉(zhuǎn)導(dǎo)激活信號的CD28不同，CTLA-4在識別結(jié)合B7分子后，在T淋巴細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)激活抑制信號(負調(diào)節(jié)信號)(T.L.Walunasetal.，Immunity1，405-413(1994)。干擾、減弱、封閉CTLA-4和B7分子的相互作用可使T細胞處于持續(xù)充分的激活狀態(tài)，會在個體產(chǎn)生兩種效能：1、增強個體對抗原的免疫應(yīng)答；2、增強對腫瘤細胞的內(nèi)源性免疫應(yīng)答(endogenousimmuneresponses)。因為具有第一種效能，干擾、減弱、封閉CTLA-4和B7分子的相互作用能增強抗原的免疫效力，因此具有干擾、減弱、封閉CTLA-4和B7分子的相互作用的制劑可被用來增強抗原的效力而具有疫苗佐劑的功能。因為具有第二種效能，干擾、減弱、封閉CTLA-4和B7分子的相互作用能增強個體抗腫瘤細胞免疫反應(yīng)，因此具有干擾、減弱、封閉CTLA-4和B7分子相互作用的制劑可成為一種治療腫瘤的藥物[SharmaP.etal.Science.2015Apr3；348(6230)：56-61；R.J.GreenwaldRJ，etal.AnnuRevImmunol.2005；23：515-48]。CTLA-4抗體是可以干擾、減弱、封閉CTLA-4和B7分子的相互作用的制劑，它可以識別、結(jié)合CTLA-4而抑制T淋巴細胞激活抑制信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，進而使T細胞處于持續(xù)充分的激活狀態(tài)。CTLA-4抗體能增強個體對腫瘤細胞的免疫應(yīng)答，已成為治療腫瘤的藥物。臨床前實驗證明，用CTLA-4抗體可治療多種腫瘤，包括乳腺癌[HurwitzA.A.，etal.ProcNatlAcadSciUSA.1998Aug18；95(17)：10067-71]、黑色素瘤[vanElsasA.，etal.JExpMed.1999Aug2；190(3)：355-66]和前列腺癌[WaitzR，etal，Oncoimmunology.2012Jul1；1(4)：544-546]。臨床實驗表明，CTLA-4抗體(Ipilimumab)對腫瘤有治療作用[LeachDR，etal.Science.1996Mar22；271(5256)：1734-6]，涉及的腫瘤包括黑色素瘤[HodiFS.etal.，NEnglJMed.2010Aug19；363(8)：711-23]、腎細胞癌[YangJCetal.，JImmunother.2007Nov-Dec；30(8)：825-30]、前列腺癌[vandenEertweghAJ.etal.，LancetOncol.2012May；13(5)：509-17]、膀胱癌[CarthonB.C.etal.，ClinCancerRes.2010May15；16(10)：2861-71]、卵巢癌[HodiFS.，etal.，ProcNatlAcadSciUSA.2008Feb26；105(8)：3005-10]和非何杰金淋巴瘤[AnsellSM.，etal.ClinCancerRes.2009Oct15；15(20)：6446-53]。2011年，一種抗CTLA-4抗體(Ipilimumab)被美國食品藥品管理局(USFoodandDrugAdministration，F(xiàn)DA)批準治療黑色素瘤[SharmaP，etal.NatRevCancer.2011Oct24；11(11)：805-12；PardollDM，NatRevCancer.2012Mar22；12(4)：252-64]。臨床前實驗表明，CTLA-4抗體可以在個體增強抗原的免疫效力，涉及的抗原有經(jīng)照射處理的表達粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactor，GM-CSF)的乳腺癌細胞[HurwitzAA，etal.ProcNatlAcadSciUSA.1998Aug18；95(17)：10067-71]、經(jīng)照射處理的表達GM-CSF的黑色素瘤細胞[vanElsasA，etal.JExpMed.1999Aug2；190(3)：355-66]、轉(zhuǎn)染GM-CSF基因的同種異體前列腺癌細胞[vandenEertweghAJ，etal.，LancetOncol.2012May；13(5)：509-17]和黑色素瘤特異性gp100多肽抗原[Hodi，F(xiàn).S.etal.NEnglJMed.2010Aug19；363(8)：711-23]。技術(shù)實現(xiàn)要素：：1、本發(fā)明提供了兩種寡核苷酸，具有如序列表<400>1和<400>2所示的序列，它們可通過干擾CTLA-4mRNA而抑制CTLA-4的表達，進而干擾、減弱、封閉CTLA-4和B7分子的相互作用，使T細胞激活的抑制信號受到抑制，結(jié)果是增強個體對抗原的免疫應(yīng)答、增強個體的抗微生物和抗腫瘤免疫反應(yīng)。2、這兩種寡核苷酸可以經(jīng)過各種化學(xué)修飾或改構(gòu)。3、這兩種寡核苷酸可被用作微生物抗原和腫瘤抗原的佐劑，具有抗感染和抗腫瘤作用。4、這兩種寡核苷酸可被用于腫瘤治療。5、這兩種寡核苷酸可以和其它的佐劑聯(lián)合應(yīng)用來增強個體對微生物抗原和腫瘤抗原的免疫應(yīng)答。6、這兩種寡核苷酸可以和其它抗腫瘤制劑和腫瘤治療細胞聯(lián)合應(yīng)用來治療腫瘤。發(fā)明中的術(shù)語：除非特別強調(diào)，本發(fā)明中的術(shù)語具有可以被本發(fā)明所屬領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員所理解的通常意義。若出現(xiàn)含義上的沖突，應(yīng)遵從本發(fā)明中的解釋、界定或說明?！肮押塑账帷保汗押塑账崾怯啥鄠€核苷酸組成的分子，其核苷酸的數(shù)量可以是幾個或幾十個。核苷酸(nucleotide)是核酸、也是寡核苷酸的基本組成單位。核苷酸由核苷(nucleoside)和磷酸組成。核苷由戊糖(pentose)和堿基(base)組成。戊糖包括核糖和脫氧核糖。戊糖分子和堿基連接形成核苷(nucleoside)。核苷由磷酸基團連接形成核苷酸。核苷酸通過磷酸二酯鍵連接形成寡核苷酸。組成核苷的堿基包括嘧啶和嘌呤。嘧啶包括胸腺嘧啶(thymine，縮寫為T或t)和胞嘧啶(cytosine，縮寫為C或c)。嘌呤包括腺嘌呤(adenine，縮寫為A或a)和鳥嘌呤(guanine，縮寫為G或g)。寡核苷酸中的堿基可以是稀有堿基。稀有堿基包括但不限于5-羥甲基胞嘧啶、7-甲基鳥嘌呤和5-羥甲基胞嘧啶。寡核苷酸可以是單鏈、雙鏈、環(huán)形或具有環(huán)形結(jié)構(gòu)的分子。在本發(fā)明中，寡核苷酸(Oligonucleotide，ODN)可以用它的英文縮寫ODN來代替。寡核苷酸中的核苷酸排列序順序構(gòu)成其一級結(jié)構(gòu)，這種順序也稱核苷酸序列。核苷酸序列可用堿基順序代表，因此，核苷酸的序列也稱為堿基序列。脫氧寡核苷酸的序列可用堿基的英文縮寫表示，T或t代表胸腺嘧啶，C或c代表胞嘧啶，A或a代表腺嘌呤，G或g代表鳥嘌呤?！盎瘜W(xué)修飾”：與自然的DNA相比，本發(fā)明提供的寡核苷酸可被化學(xué)修飾(chemicalmodification)。寡核苷酸的化學(xué)修飾是通過引入或除去任何化學(xué)基因而使其共價結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的現(xiàn)象或方法。寡核苷酸的化學(xué)修飾部位可發(fā)生在磷酸二酯鍵、核糖和堿基。寡核苷酸的化學(xué)修飾可發(fā)生在5’端或3’端，可在合成時或合成后進行。本發(fā)明涉及的化學(xué)修飾包括但不限于對寡核苷酸骨架的修飾，如硫代修飾(核苷酸間磷酸二酯鍵中磷酸的非橋性氧原子被硫原子取代)和取代修飾(包括烷基、芳香基或其它任何化學(xué)基團的取代)。寡核苷酸的化學(xué)修飾還包括堿基替代和堿基修飾，替代的堿基可以是稀有堿基或各種堿基的衍生物。寡核苷酸的化學(xué)修飾還包括在其5’端和/或3’端連接一或多個核苷酸和/或其它任何化學(xué)基團?！癠TR”：是指mRNA分子的非翻譯區(qū)(untranslatedregion，UTR)，位于mRNA分子多肽編碼區(qū)的兩端，位于5’端的被稱為5’端UTR，位于3’端的被稱為3’端UTR?！懊庖邞?yīng)答”：免疫應(yīng)答(immuneresponse)和免疫反應(yīng)具有相似的意義。免疫應(yīng)答是個體的免疫細胞包括B淋巴細胞、T淋巴細胞、NK細胞、γδT細胞、NKT細胞、樹突細胞、巨噬細胞和粒細胞等對抗原或其它刺激[如病原體相關(guān)的模式分子(pathogenassociatedmolecularpattern，PAMP)和損傷相關(guān)的模式分子(damageassociatedmolecularpattern，DAMP)做出的反應(yīng)。免疫應(yīng)答的結(jié)果是選擇性破壞或清除入侵的病原微生物或內(nèi)生的腫瘤細胞。免疫應(yīng)答包括固有免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答。適應(yīng)性免疫應(yīng)答括細胞免疫應(yīng)答和體液免疫應(yīng)答。由采用微生物抗原制成的疫苗所激發(fā)的免疫應(yīng)答可以使被免疫的個體獲得抵抗微生物感染的能力。由采用腫瘤抗原制成的疫苗所激發(fā)的免疫應(yīng)答可在被免疫的個體發(fā)生腫瘤治療作用。促進對個體對微生物的免疫應(yīng)答可發(fā)生抗感染作用。促進個體對腫瘤細胞的免疫應(yīng)答可發(fā)生抗腫瘤作用?！傲馨图毎保毫瞻图毎?lymphocyte)指在血液、淋巴液和淋巴組織中存在的沒有吞噬能力的單個核白細胞，包括B淋巴細胞(也稱B細胞)和T淋巴細胞(也稱T細胞)。T細胞可被分為表面表達CD4分子的T細胞(CD4+T細胞)和為表面表達CD8分子的T細胞(CD8+T細胞)?！癈TLA4”：CTLA-4(Tlymphocyte-associatedantigen4)[RuddC.E.，etal.ImmunolRev.2009May；229(1)：12-26]，也稱為CD152或CTLA-4抗原(CTLA-4antigen)，是一種可誘導(dǎo)的膜蛋白，表達在激活的CD4+T細胞和CD8+T細胞的表面。CTLA-4結(jié)合在抗原提呈細胞表面的B7分子。B7分子即是CTLA-4的配體，也是T細胞表面CD28的配體。同CD28相比，CTLA-4對B7的親和力更高，它可和CD28競爭結(jié)合B7，因而減弱CD28依賴性共刺激信號(T細胞激活的第一信號)。CTLA-4也介導(dǎo)對MHC-TCR通路信號(T細胞激活的第二信號)的直接抑制[NirschlCJ.，etal.ClinCancerRes.2013Sep15；19(18)：4917-24]?；罨疶細胞可上調(diào)表達CTLA-4，CTLA-4與B7結(jié)合后可傳導(dǎo)抑制信號抑制T細胞激活。在腫瘤微環(huán)境中，CTLA-4介導(dǎo)的T細胞激活抑制可削弱個體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。阻斷CTLA-4的功能可增強個體的抗腫瘤活性，產(chǎn)生腫瘤治療作用[LeachDR.，etal.Science.1996Mar22；271(5256)：1734-6]。阻斷CTLA-4的功能可增強個體對抗原或疫苗的免疫應(yīng)答[vanElsasA.，etal.JExpMed.1999Aug2；190(3)：355-66]?！癟細胞受體”：T細胞受體(Tcellreceptor，TCR)是表達在T細胞表面的抗原受體，為異二聚體跨膜蛋白。TCR由可變(V)區(qū)和恒定(C)區(qū)組成。V區(qū)是TCR識別抗原表位的結(jié)構(gòu)域。TCR不能直接識別抗原表位，只能識別抗原遞呈細胞或靶細胞表面的抗原肽-MHC(主要組織相容復(fù)合體)分子復(fù)合物。“MHC分子”：MHC分子是主要組織相容復(fù)合體(majorhistocompatibiltiycomplex，MHC)基因編碼的蛋白類分子。MHC分子包括MHCI類分子和MHCII類分子?！癈D28”：CD28是表達在T細胞表面的蛋白，可識別抗原呈遞細胞表面的B7分子。在識別B7分子后，CD28向T細胞提供共刺激信號(co-stimulatorysignals)?！癇7分子”：B7分子是主要表達在抗原提呈細胞特別是樹突細胞表面的蛋白分子，包括B7.1(CD80)和B7.2(CD86)兩種，除淋巴瘤細胞外，腫瘤細胞多不表達B7分子[Sharma，J.P.Allison.Science348，56，2015]?！肮泊碳し肿印保汗泊碳し肿?co-stimulaorymolecules)是表達在抗原提呈細胞(antigenpresentingcells，APC)或腫瘤細胞表面的蛋白類分子，在免疫應(yīng)答的過程中提供激活CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞的第二激活信號?！癟淋巴細胞的激活”：T淋巴細胞的激活需要來兩個信號。第一信號通過其TCR識別APC或靶細胞(可被CD8+T細胞殺傷的細胞)表面的抗原肽-MHC分子復(fù)合物獲得；第二信號，也稱共刺激信號，通過其CD28分子識別APC或靶細胞表面的B7分子獲得。在雙信號的作用下，T細胞啟動激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進而增殖、分化行使功能。僅有第一信號而無第二激活信號可使T細胞進入不應(yīng)答狀態(tài)。T淋巴細胞激活后發(fā)生T淋巴細胞反應(yīng)?！癟淋巴細胞反應(yīng)”：T淋巴細胞反應(yīng)(Tlymphocyteresponse)和“T淋巴細胞活性”(Tlymphocyteactivity)或“T淋巴細胞行使的功能”在本發(fā)明中是可以互換的術(shù)語。T淋巴細胞反應(yīng)包括T淋巴細胞增生和/或分化成輔助性T淋巴細胞(Th)、細胞毒性T淋巴細胞(Tc)或調(diào)節(jié)性T淋巴細胞(Treg)，也包括由Th向B淋巴細胞提供信號輔助其產(chǎn)生抗體、由Tc殺傷靶細胞和釋放可溶性因子如細胞因子來調(diào)節(jié)其它免疫細胞的功能。Th是CD4+T細胞，Tc是CD8+T細胞。在激活后，CD4+T細胞輔助B細胞產(chǎn)生抗體，輔助CD8+T細胞殺傷靶細胞如病毒感染細胞和腫瘤細胞。在激活后，CD8+T細胞可殺傷病毒感染細胞和腫瘤細胞。促進、維持T細胞激活會增強個體對微生物抗原的免疫應(yīng)答而產(chǎn)生抗感染作用，也會促進個體免疫細胞對腫瘤細胞的免疫應(yīng)答產(chǎn)生腫瘤治療作用?！皞€體”：在本發(fā)明中的個體(subject或individual)指人和非人類的脊椎動物?！鞍屑毎保喊屑毎?Targetcell)指個體可被免疫細胞攻擊、殺傷或作用的細胞，可以是腫瘤細胞、病毒感染細胞，也可以指被本發(fā)明提供的寡核苷酸作用的細胞?！癈TLA-4抗體”：是能特異結(jié)合CTLA4的抗體，可以封閉CTLA-4轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制信號，使T淋巴細胞被腫瘤抗原充分激活，能延長腫瘤患者的生存期。Ipilimumab是一種完全人源化的IgG1CTLA-4單克隆抗體[LipsonEJ.，etal.ClinCancerRes.2011Nov15；17(22)：6958-62]，在2011被美國FDA批準為治療晚期黑色素瘤的藥物[SharmaP.etal.Science.2015Apr3；348(6230)：56-61]。Tremelimumab是另一種人源化的IgG2CTLA-4單克隆抗體[RibasA.，etal.Oncologist.2007Jul；12(7)：873-83]。在臨床試驗中，Tremelimumab被用于治療肝細胞癌[SangroB.，etal.JHepatol.2013Jul；59(1)：81-8]、胃癌和食管癌[RalphC.etal.ClinCancerRes.2010Mar1；16(5)：1662-72]。CTLA-4的抗體屬免疫卡點分子抑制物?！懊庖呖c分子”：免疫卡點分子(immunecheckpointmolecules)是表達在免疫細胞上的蛋白分子，在識別其配體后啟動抑制性信號通路因而抑制免疫細胞的激活。免疫卡點分子包括但不限于CTLA-4分子、PD-1分子、PD-L1/2分子、淋巴細胞激活基因3(lymphocyte-activationgene3，LAG-3)、TIM-3(Tcellimmunoglobulinandmucindomain-containing3)、TIGIT(TcellimmunoreceptorwithimmunoglobulinandITIMdomains)和BTLA(BandTlymphocyteattenuator)。封閉免疫卡點(immunecheckpointblockade)是指抑制免疫卡點分子在免疫細胞轉(zhuǎn)遞抑制信號的功能而促進、維持T細胞激活的方法。封閉免疫卡點增強個體對微生物抗原的免疫應(yīng)答表現(xiàn)抗感染作用，也可促進個體免疫細胞的抗腫瘤活性表現(xiàn)腫瘤治療作用[MeleroI，etal.NatRevCancer.2015Aug；15(8)：457-72]?！澳[瘤”：本發(fā)明中的“腫瘤”即現(xiàn)代醫(yī)學(xué)定義的腫瘤，可以分為良性腫瘤和惡性腫瘤。腫瘤(tumor)和癌癥(cancer)可以互換使用，具有相同的含義。腫瘤包括實體瘤、軟組織肉瘤和髓樣或淋巴樣系統(tǒng)腫瘤。本發(fā)明提供的寡核苷酸可增強個體對腫瘤抗原的免疫應(yīng)答產(chǎn)生抗腫瘤作用，涉及的腫瘤包括但不限于：食道癌、膽囊癌、膀胱癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、結(jié)直腸癌、腎上腺皮質(zhì)腫瘤、腎癌、肝癌、肺癌、卵巢癌、子宮頸癌、子宮癌、陰道癌、胰腺癌、直腸癌、前列腺癌、胃癌、皮膚癌、黑色素瘤、腦腫瘤、膠質(zhì)瘤、骨腫瘤、肉瘤、陰莖癌、視網(wǎng)膜母細胞瘤、白血病、淋巴瘤和骨髓瘤?！爸委煛保喊☉?yīng)用本發(fā)明提供的寡核苷酸來阻止或延緩疾病(如腫瘤)的癥狀和并發(fā)癥的出現(xiàn)。治療也可以是預(yù)防性。對腫瘤的治療也指在個體控制腫瘤的進展，延長腫瘤患者的生存期，改善生活質(zhì)量，減輕癥狀，使腫瘤縮小甚至消除，使腫瘤轉(zhuǎn)移受到遏制。在本發(fā)明中“腫瘤治療”和“抗腫瘤作用”或“治療腫瘤”有相同的含義?？鼓[瘤作用包括對腫瘤的治療，也包括對腫瘤發(fā)生、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的預(yù)防?！翱乖保菏悄鼙籅細胞受體或T細胞受體識別而激發(fā)個體適應(yīng)性免疫應(yīng)答(adaptiveimmuneresponse)的物質(zhì)或分子?？乖梢詠碜詡€體的外部，如微生物抗原；也可來自個體的內(nèi)部，如腫瘤抗原。微生物抗原是微生物上可被B細胞受體或T細胞受體識別而激發(fā)個體適應(yīng)性免疫應(yīng)答(adaptiveimmuneresponse)的物質(zhì)或分子。采用微生物抗原制備成的疫苗在給個體應(yīng)用后能使其獲得對該病原體的免疫力，使其在再次接觸到同樣或相似病原體時受到保護。采用腫瘤抗原制成的疫苗在給個體應(yīng)用后能激發(fā)其對腫瘤細胞的適應(yīng)性免疫應(yīng)答進而產(chǎn)生腫瘤治療作用?？乖梢詮奈⑸锘蚰[瘤細胞提取、也可以采用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)或其它方法合成?！耙呙纭保阂呙?vaccine)是用減毒或殺死的病原生物或其組份為抗原制成的用于人工主動免疫的生物制品?？乖妥魟┦且呙绲闹饕煞?。接種疫苗的目的是使個體獲得對病原體的免疫力進而使其再接觸到相應(yīng)的病原體時受到保護。本發(fā)明提供的寡核苷酸可以和人用疫苗聯(lián)合應(yīng)用增強其免疫效力，這些疫苗包括但不限于可預(yù)防下述傳染性疾病的疫苗[StanleyA.Plotkin，WalterA.Orenstein，PaulA.Offit，Vaccines，SixthEdition，AnimprintofElsevierInc.2013，ISBN-13：9781455700905]：白喉、破傷風(fēng)、黃熱病、百日咳、流感嗜血桿菌b感染、脊髓灰質(zhì)炎、麻疹、腮腺炎、風(fēng)疹、斑疹傷寒、狂犬病、輪狀病毒感染、甲型肝炎、乙型肝炎、戊型肝炎、流感、結(jié)核、瘧疾、霍亂、水痘、流行性乙型腦炎、森林腦炎、霍亂、萊姆病、肺炎球菌感染、腦膜炎球菌感染、傷寒、天花、炭疽、埃博拉病毒感染、綠猴病毒(Marburgviruses，MARV)感染和委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(Venezuelanequineencephalitisvirus，VEEV)感染。本發(fā)明涉及的疫苗也包括腫瘤疫苗。腫瘤抗原和佐劑是腫瘤疫苗的主要成分。腫瘤疫苗可治療或預(yù)防腫瘤。腫瘤疫苗中的抗原可以是腫瘤抗原、提呈腫瘤抗原的細胞、表達腫瘤抗原的細胞或腫瘤細胞裂解物。本發(fā)明提供的寡核苷酸可以和腫瘤疫苗聯(lián)合應(yīng)用增強其預(yù)防和/或治療腫瘤的效力，這類疫苗包括但不限于：子宮頸癌預(yù)防的人乳頭瘤病毒疫苗、用于治療前列腺癌的Provenge疫苗、用各種腫瘤抗原制成的疫苗、用各種腫瘤細胞制成的疫苗和用腫瘤細胞裂解物制成的疫苗。本發(fā)明提供的寡核苷酸可以和動物用疫苗聯(lián)合應(yīng)用增強其免疫效力，這些疫苗包括但不限于可預(yù)防下述傳染性疾病的疫苗：豬口蹄疫、豬藍耳病(豬繁殖與呼吸綜合征)、豬瘟、豬偽狂犬病、豬圓環(huán)病毒感染、豬細小病毒感染、豬鏈球菌、豬傳染性胃腸炎、豬氣喘病、副豬嗜血桿菌感染、豬丹毒、豬肺疫、豬萎縮性鼻炎、豬傳染性胃腸炎、豬乙腦、豬流感、豬布魯氏病、仔豬腹瀉、豬副流感病毒感染、豬流感、豬肺炎支原體感染、仔豬水腫病、豬霍亂沙門氏菌、豬流行性腹瀉、豬肺疫；牛氣腫疽、牛炭疽、牛流行熱、牛巴氏桿菌病、牛布魯菌感染、牛破傷風(fēng)、牛魏氏梭菌感染、牛肉毒梭菌感染、牛口蹄疫、牛副傷寒、牛痘、牛腹瀉；羊快疫、羊猝疽、羊腸毒血癥、羔羊痢疾、羊黑疫(傳染性壞死性肝炎)、山羊痘病、羊破傷風(fēng)、羊炭疽病、羔羊大腸桿菌病、羊流產(chǎn)衣原體感染、羊口瘡、羊傳染性胸膜肺炎、羊布氏桿菌病、羊肉毒梭菌中毒癥、羊痘、羊鏈球苗病、羊狂犬病、羊口蹄疫、羊口瘡病、羊藍舌病；馬傳染性貧血、馬流感；豬馬牛羊犬腦炎；雞新城疫、雞傳染性法氏囊炎、雞馬立克病、禽流感、禽霍亂病、雞痘、雞染性支氣管炎、雞病毒性肝炎、雞減蛋綜合征；鴨流感、鴨疫里默氏桿菌苗、鴨瘟、鴨傳染性漿膜炎、鴨大腸桿菌??；小鵝瘟、鵝副黏病毒病、鵝流感；狂犬病、犬溫?zé)?、犬細小病毒病、犬鉤端螺旋體病、犬傳染性肝炎、犬傳染性支氣管炎、犬副流感病、犬腦炎和犬窩咳疫苗?！澳[瘤抗原”：本發(fā)明提供的寡核苷酸可以和腫瘤抗原聯(lián)合應(yīng)用促進個體對腫瘤抗原的免疫應(yīng)答。在本發(fā)明中，腫瘤抗原(Tumorantigen)，腫瘤細胞抗原(tumorcellantigen)和腫瘤相關(guān)抗原(tumorassociatedantigen，TAA)可以交換應(yīng)用，有相同的含義。腫瘤抗原能激發(fā)抗腫瘤免疫應(yīng)答，針對腫瘤抗原的免疫應(yīng)答產(chǎn)生腫瘤治療作用。瘤抗原包括但不限于：BAGE(Bmelanomaantigen)、GAGE(Gantigen12B/C/D/E)、MAGE(melanomaantigen-encodinggene)、NY-ESO-1；CEA(carcinoembryonicantigen)、gp100(glycoprotein100)、Melan-A(melanomaantigenrecognizedbyTcells1)、PSA(prostate-specificantigen)、酪氨酸酶、HER2(humanepidermalgrowthfactorreceptor2，hTERT(telomerasetranscriptase)、p53、survivin、β-catenin-m、HSP70-2/m(heatshock-related70kDaprotein2mutated)、KRAS、GM2(gangliosideGM2)、MUC1(mucin-1)、乙型肝炎病毒基因編碼抗原、丙型肝炎病毒基因編碼的抗原、人乳頭瘤病毒基因編碼抗原(如L1蛋白、E6蛋白和E7蛋白)和EB病毒基因編碼的抗原(EpsteinBarrViruspeptides)[ZielinskiC，etal.NatRevClinOncol.2014Sep；11(9)：509-24；AdamsJL，etal.NatRevDrugDiscov.2015Sep；14(9)：603-22]。腫瘤抗原還包括經(jīng)滅活處理全腫瘤細胞和腫瘤細胞裂解物。腫瘤抗原可以是因基因突變而表達的新抗原(neo-antigen)，也可以是B細胞腫瘤的獨特型抗原和自腫瘤細胞提取的熱休克蛋白腫瘤細胞肽復(fù)合物[Suot，R&Srivastava，P(1995)Science269：1585-1588；Tamura，Y.etal.(1997)Science278：117-120]?！澳[瘤疫苗”本發(fā)明提供的寡核苷酸可以和腫瘤疫苗聯(lián)合應(yīng)用增強其腫瘤治療的效力。腫瘤疫苗是指能誘生個體產(chǎn)生抗腫瘤適應(yīng)性免疫應(yīng)答的生物制品。本發(fā)明涉及的腫瘤疫苗包括采用腫瘤抗原、腫瘤細胞裂解物、腫瘤細胞和提呈腫瘤抗原的細胞以一定的劑型制成的疫苗。這類疫苗包括但不限于下述[[ZielinskiC，etal.NatRevClinOncol.2014Sep；11(9)：509-24]：治療前列腺癌的腫瘤疫苗，采用的腫瘤抗原包括前列腺酸性磷酸酶(用于sipuleucel-T)、和PSA；治療乳腺癌的的腫瘤疫苗，采用的腫瘤抗原包括HER2來源的多肽、MUC1和WT1(Wilmstumourprotein)抗原；治療肺癌的腫瘤疫苗，采用的腫瘤抗原包括MUC1、melanoma-associatedantigen-3(MAGE-A3)多肽、telomerasereversetranscriptase和EGF；治療黑色素瘤的疫苗，采用的抗原包括β-catenin、gp100、MAGE-A3、MART1(melanomaantigenrecognizedbyTcells1)、NY-ESO-1和survivin；治療胰腺癌疫苗的腫瘤疫苗，采用的腫瘤抗原包括端粒酶肽、同種異體腫瘤細胞和突變RAS合成肽；治療結(jié)直腸癌的的腫瘤疫苗，采用的腫瘤抗原包括癌胚抗原(carcinoembryonicantigen，CEA)、MUC1和全腫瘤細胞；治療腎細胞癌的腫瘤疫苗，采用的腫瘤抗原包括腫瘤細胞RNA；血液腫瘤治療用疫苗，采用的腫瘤抗原包括WT1、MAGE、MUC1、PRAME(preferentiallyexpressedantigenofmelanoma)和獨特型抗原。“腫瘤細胞裂解物”腫瘤細胞裂解物可通過破碎腫瘤細胞獲得，含各種腫瘤抗原。破碎腫瘤細胞的方法包括但不限于反復(fù)凍融、超聲處理和機械破碎。本發(fā)明提供的寡核苷酸可以和腫瘤細胞裂解物聯(lián)合應(yīng)用促進個體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。原發(fā)腫瘤、繼發(fā)或轉(zhuǎn)移腫瘤細胞都可被用來制備腫瘤細胞裂解物。將原發(fā)腫瘤和繼發(fā)或轉(zhuǎn)移腫瘤細胞在體外培養(yǎng)，可獲得腫瘤細胞系(tumorcellline)細胞，這些腫瘤細胞系細胞也可以被用來制備腫瘤細胞裂解物。用于制備腫瘤細胞裂解物的腫瘤細胞可以是自體、同種異體的或異種的?！白魟北景l(fā)明提供的寡核苷酸可以和一種或多種佐劑聯(lián)合使用來增強微生物抗原和腫瘤抗原的免疫效力。佐劑(adjuvant)是在疫苗中和抗原一起應(yīng)用的物質(zhì)，具有下述活性(1)減少疫苗的接種次數(shù)；(2)延長疫苗的免疫持續(xù)期；(3)通過激動固有免疫應(yīng)答促進體液免疫應(yīng)答和細胞免疫應(yīng)答；(4)擴展抗原誘導(dǎo)的交叉保護免疫應(yīng)答；(5)增強弱免疫應(yīng)答個體如老齡個體或免疫缺陷個體對抗原的免疫應(yīng)答；(6)減少抗原的用量。可以和本發(fā)明提供的寡核苷酸聯(lián)合應(yīng)用的佐劑[StanleyA.Plotkin，WalterA.Orenstein，PaulA.Offit，Vaccines，SixthEdition，AnimprintofElsevierInc.2013，ISBN-13：9781455700905]包括但不限于：鋁鹽佐劑(由氫氧化鋁或磷酸鋁為主要成分的疫苗佐劑)、AS04佐劑(吸附MPL的磷酸鋁佐劑(MPL是經(jīng)化學(xué)減毒的革蘭氏陰性菌脂多糖)、MF59佐劑(一種油包水型乳化劑，其中的油相是角鯊烯)、AS03佐劑(一種采用角鯊烯為油相的水包油佐劑)、AF03佐劑(一種采用角鯊烯為油相的水包油型乳化劑)、MontanideISA51佐劑(以礦物油為油相的油包水乳化劑)、弗氏佐劑、弗氏不完全佐劑、病毒小體佐劑(virosomeadjuvant)、N-氧化聚乙烯對二氮己環(huán)衍生物(polyoxidonium)佐劑、Toll樣受體激動劑、病原體相關(guān)模式分子及其模擬物、損傷相關(guān)模式分子及其模擬物、環(huán)二核苷酸及其模擬物、GM-CSF(granulocyte-macrophagecolony-stimulatingfactor)、IL-12、油性乳化劑(AS02，AS03，AF03，MF59和MontanideTMISA-51)、白油佐劑、MontanideTMISA-206佐劑、QS21、polylactideco-glycolide、病毒(Adenovirus，vaccinia，fowlpox)載體佐劑、卡介苗(BCG，bacillusCalmette-Guérin)、包括poly(I：C)在內(nèi)的雙鏈RNA及其類似物、包括MPL在內(nèi)的類脂A類似物、鞭毛蛋白、包括Imiquimod和R848在內(nèi)的Imidazoquinolines、CpGODN、包括QS21在內(nèi)的皂素、包括TDB在內(nèi)的C-typelectinligands、包括α-galactosylceramide在內(nèi)的CD1d配體、AS01(MPL，QS21，liposomes)、AS02(MPL，QS21，乳化劑)、AS15(MPL，QS21，CpGODN，脂質(zhì)體)、GLA-SE(GLA，emulsion)、IC31(CpGODN，陽離子多肽)、CAF01(TDB，陽離子脂質(zhì)體)和ISCOMs(皂素，磷脂)[ReedSG，etal.NatMed.2013Dec；19(12)：1597-608；MeleroI，etal.NatRevClinOncol.2014Sep；11(9)：509-24]?！安≡w相關(guān)的模式分子”：本本發(fā)明提供的寡核苷酸可以和病原體相關(guān)的模式分子(pathogen-associatedmolecularpatterns，PAMPs)及其類似物聯(lián)合應(yīng)用來增強微生物抗原和腫瘤抗原的免疫效果來發(fā)揮抗感染或抗腫瘤作用。PAMPs是微生物的各種保守成分，如細菌和真菌細胞壁成分和病毒核酸。固有免疫細胞通過模式識別受體(pattern-recognitionreceptors，PRRs)識別PAMPs而被激活。PRR包括Toll-likereceptors(TLRs)、nucleotide-bindingoligomerizationdomain(Nod)-，leucine-richrepeat-containingreceptors(NLRs)、RIG-I-likereceptors(RLRs)、C-typelectinreceptors(CLRs)和AIM-2likereceptors；也包括細胞內(nèi)識別核酸的細胞內(nèi)核酸感受器(intracellularsensorsofnucleicacids)、OAS蛋白和cGAS[IwasakiAetal.NatImmunol.2015Apr；16(4)：343-53]?！癟oll樣受體激動劑”：本發(fā)明提供的寡核苷酸可以和一種或多種Toll樣受體(Toll-likereceptors，TLRs)激動劑聯(lián)合應(yīng)用來增強微生物抗原和腫瘤抗原的免疫效果，表現(xiàn)抗感染或抗腫瘤活性。能和本發(fā)明提供的寡核苷酸聯(lián)合應(yīng)用的TLR激動劑包括但不限于：包括Imiquimod和imidazoquinolines在內(nèi)的TLR7和TLR8激動劑；包括852A在內(nèi)的TLR7激動劑；包括VTX-2337在內(nèi)的TLR8激動劑；包括IMO-2055、CPG7909、MGN1703和其它CpGODN(含CpG脫氧寡核苷酸)在內(nèi)的TLR9激動劑；包括卡介苗(BCG)在內(nèi)的TLR2/TLR4激動劑；包括OM-174、monophosphoryllipidA、aminoalkylglucosaminephosphates和其它類脂A(lipidA)類似物在內(nèi)的TLR4激動劑；包括病毒核酸、細菌核酸在內(nèi)的TLR9激動劑；包括細菌鞭毛蛋白在內(nèi)的TLR5激動劑、包括酵母多糖在內(nèi)的TLR2/TLR6激動劑；包括聚肌苷酸胞嘧啶核苷酸(polyIC)、病毒雙鏈RNA或其模擬物在內(nèi)的TLR3激動劑和包括病毒單鏈RNA或其模擬物的TLR7/TLR8激動劑[AdamsJLetalNatRevDrugDiscov.2015Sep；14(9)：603-22]?！皳p傷相關(guān)的模式分子”：本發(fā)明提供的寡核苷酸可以和損傷相關(guān)的模式分子(damage-associatedmolecularpatterns，DAMPs)來增強微生物抗原和腫瘤抗原的免疫效果。DAMPs是由損傷細胞釋放的、能激發(fā)固有免疫應(yīng)答自身細胞成分。DAMPs能通過PRR激發(fā)機體的固有免疫應(yīng)答。這些DAMP包括但不限于：熱休克蛋白、HMGB1(high-mobilitygroupbox1)、hyaluronan片段、glycans、glycoconjugates、ATP，(Adenosine5’-triphosphate)、腺苷酸、尿酸、S100蛋白、heparinsulfate、Galectins、細胞核DNA、N-formylatedpeptides、Antimicrobialpeptides、線粒體DNA和calreticulin[KryskoDVetal.NatRevCancer.2012Dec；12(12)：860-75；PouwelsSDetal.MucosalImmunol.2014Mar；7(2)：215-26]?！碍h(huán)二核苷酸”本本發(fā)明提供的寡核苷酸可以和環(huán)二核苷酸及其模擬物聯(lián)合應(yīng)用來增強微生物抗原和腫瘤抗原的免疫效果。環(huán)二核苷酸(Cyclicdinucleotides，CDNs)[Cell，2013154(5)，962-970]可來源于細菌，也可在哺乳動物細胞內(nèi)合成。細菌CDNs包括但不限于環(huán)二鳥苷酸(cyclicdi-GMP，cdG)、環(huán)二腺苷酸(cyclicdi-AMP，cdA)和環(huán)腺苷酸-鳥苷酸(cyclicAMP-GMP，cAMP-GMP)。細菌CDN是一類PAMP，可激動固有免疫應(yīng)答。在哺乳動物細胞中也可出現(xiàn)CDN，如環(huán)鳥苷酸-腺苷酸(cyclicguanosinemonophosphate-adenosinemonophosphate，cGAMP)[WuJetal.Science.2013Feb15；339(6121)：826-3]?！翱鼓[瘤制劑”：抗腫瘤制劑(anti-tumoragent)是應(yīng)用于個體后可治療腫瘤的制劑，這些制劑包括但不限于腫瘤疫苗、免疫卡點抑制物、共刺激受體激活劑、化療藥物、放療制劑、激素抑制物或激素、細胞因子、腫瘤治療用抗體、小分子激酶抑制劑、PARP抑制物、血管生成抑制劑和溶瘤病毒等?！懊庖呖c抑制物”：免疫卡點抑制物(immunecheckpointinhibitor)是能抑制免疫卡點分子功能的物質(zhì)[MeleroIetal.NatRevCancer.2015Aug；15(8)：457-72]。抑制免疫卡點分子的功能使免疫細胞激活的信號得以突顯，因而使免疫細胞處于持續(xù)的激活狀態(tài)。處于持續(xù)激活狀態(tài)的CD4+T細胞會輔助B細胞產(chǎn)生抗體，也輔助CD8+T細胞殺傷靶細胞如病毒感染細胞和腫瘤細胞。處于持續(xù)激活狀態(tài)的CD8+T細胞能殺傷病毒感染細胞和腫瘤細胞。因此，維持T細胞激活狀態(tài)的制劑如免疫加點抑制物會提高抗原或疫苗在個體的免疫效力，也會在癌癥患者(個體)發(fā)生腫瘤治療作用。本發(fā)明提供的寡核苷酸可以和免疫卡點抑制劑聯(lián)合應(yīng)用治療腫瘤和提高抗原或疫苗的免疫效力。免疫卡點抑制劑抑制的免疫卡點分子包括但不限于CTLA4、PD1、LAG3(Lymphocyteactivationgene3)、2B4(CD244)、BTLA(BandTlymphocyteattenuator)、TIM3(Tcellmembraneprotein3)和A2aR(adenosineA2areceptor)[PardollDM.NatRevCancer.2012Mar22；12(4)：252-64]。能抑制免疫卡點功能的抗體屬免疫卡點抑制物，包括但不限于CTLA-4抗體、CD-1抗體和CD-L抗體?！癙D-1”：PD-1(Programmedcelldeathprotein-1)，也稱CD279，是表達在激活的T細胞、激活的B細胞、NK細胞和單核細胞上的膜蛋白[ChenL.NatRevImmunol.2004May；4(5)：336-47]。PD-1可誘導(dǎo)效應(yīng)性T細胞耗竭和無能。PD-1結(jié)合APC上的B7家族配體PD-L1(programmeddeathligand-1，B7-H1)和PD-L2(programmeddeathligand-2，B7-DC)[ItoA.BiomedResInt.2015；2015：605478]啟動免疫細胞激活抑制信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)?！癙D1抗體”：PD-1的抗體(Anti-PD-1Antibodies)是PD1分子的單克隆抗體，具有抑制PD-1介導(dǎo)的免疫細胞負調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能，為免疫卡點抑制物。2014年，兩種PD-1抗體(pembrolizumab和nivolumab)被美國FDA批準用于腫瘤治療。Nivolumab是全人源化IgG4單克隆抗體，可結(jié)合并抑制PD-1的功能[TopalianSLetal.CurrOpinImmunol.2012Apr；24(2)：207-12]，被用于治療黑色素瘤、非小細胞性肺癌、卵巢癌和腎癌[ItoAetal.BiomedResInt.2015；2015：605478]。Pidilizumab(CT-011)是人源化IgG-1κ單克隆抗體，可結(jié)合并抑制PD-1的功能，被用于治療彌散性大B細胞淋巴瘤和濾泡淋巴瘤。此外，PD-1的抗體還包括Pembrolizumab(MK-3475)，它是可結(jié)合并抑制PD-1功能的IgG-4κ單克隆抗體[ItoAetal.BiomedResInt.2015；2015：605478]?！癙D-L1”：PD-L是PD1分子的配體，包括PD-L1(programmeddeathligand-1，B7-H1)和PD-L2(programmeddeathligand-2)。PD-L1也稱B7-H1。PD-L2也稱B7-DC。PD-L1和PD-L2在結(jié)合PD-1分子后可激動免疫細胞激活抑制信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。PD-L1和PD-L2可表達在多種腫瘤細胞的表面，其表達水平的升高可提示腫瘤患者的不良預(yù)后[ItoAetal.BiomedResInt.2015；2015：605478]。“抗-PD-L抗體”：是識別、結(jié)合PD-L1或PD-L2的抗體。在結(jié)合PD-L后可阻斷其結(jié)合免疫細胞表面的PD-1，因而阻斷免疫細胞激活抑制信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，維持免疫細胞的激活狀態(tài)，進而增強個體對抗原或腫瘤細胞的免疫應(yīng)答。多種抗-PD-L1抗體(Anti-PD-L1Antibodies)表現(xiàn)了腫瘤治療作用，這些抗體包括但不限于BMS-936559、MPDL3280A、MEDI4736和MSB0010718[ItoA，etal.BiomedResInt.2015；2015：605478]。BMS-936559是全人源化IgG4抗PD-L1單克隆抗體，被用于治療黑色素瘤、非小細胞肺癌、卵巢癌和腎癌。MPDL3280A是人源化IgG-1κ抗PD-L1單克隆抗體，被用于治療黑色素瘤和膀胱癌。MEDI4736是人源化IgG-1κ單克隆抗體，可延長荷瘤個體的生存期。MSB0010718是人源化IgG1PD-L1單克隆抗體[ItoA，etal.BiomedResInt.2015；2015：605478]。“PD-1-PD-L1/2途徑”：是指腫瘤細胞通過其表達的PD-L1/2作用于免疫細胞表達的PD-1誘導(dǎo)免疫細胞激活抑制信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，因而抑制免疫細胞激活的途徑。腫瘤細胞可利用PD-1-PD-L1/2途徑逃逸免疫細胞的攻擊[ZouW.，ChenL.NatureReviewsImmunology.2008；8(6)：467-477]。阻斷該途徑可增強個體免疫細胞的抗腫瘤活性[TopalianS.L.，etal.CurrentOpinioninImmunology.2012；24(2)：207-212]?！肮泊碳な荏w激活劑”：本發(fā)明提供的寡核苷酸可以和共受體激活劑聯(lián)合應(yīng)用增強個體對疫苗或抗原的免疫應(yīng)答，增強個體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。共刺激受體是表達在免疫細胞表面的受體，在受到激活劑激活后介導(dǎo)免疫細胞激活信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，因而促進個體對抗原或疫苗的免疫反應(yīng)、增強個體的抗腫瘤免疫活性。共刺激受體激活劑是通過結(jié)合共刺激受體后激活免疫細胞的制劑。共刺激受體激活性單克隆抗體(Co-stimulatoryreceptoractivatingmonoclonalantibody)是共刺激受體激活劑，可增強抗原或疫苗的效力、增強個體的抗腫瘤免疫應(yīng)答。這類激活性單克隆抗體靶向的共刺激受體(Co-stimulatoryreceptor)包括但不限于CD137(41BB)、OX40、CD40、GITR、ICOS和CD27(Glucocorticoid-inducedtumournecrosisfactorreceptorfamily-relatedprotein)[MeleroIetal.NatRevCancer.2015Aug；15(8)：457-72；SanmamedMFetal.SeminOncol.2015Aug；42(4)：640-55]?！盎熕幬铩北景l(fā)明提供的寡核苷酸可以和化療藥物聯(lián)合應(yīng)用治療腫瘤?；熕幬锸强梢酝ㄟ^抑制、殺傷腫瘤細胞而治療腫瘤的化學(xué)藥物。本發(fā)明所指的化學(xué)藥物包括但不限于烷化劑類、抗代謝類、抗微管制劑類、拓撲異構(gòu)酶抑制劑類和細胞毒性抗生素類藥物。烷化劑類藥物包括氮芥類、亞硝基脲類、四嗪類、氮雜環(huán)丙烷類、順鉑及其衍生物類和非經(jīng)典烷化劑類。氮芥(nitrogenmustards)類藥物包括mechlorethamine、環(huán)磷酰胺、chlorambucil、ifosfamide和busulfan。亞硝基脲類包括N-Nitroso-N-methylurea、carmustine、lomustine、semustine、fotemustine和streptozotocin。四嗪(tetrazines)類藥物包括氮烯唑胺(dacarbazine)、mitozolomide和temozolomide。氮雜環(huán)丙烷(aziridines)類藥物包括thiotepa、mytomycin和diaziquone。順鉑及其衍生物類包括順鉑(cisplatin)、卡鉑(carboplatin)和奧沙利鉑(oxaliplatin)。非經(jīng)典烷化劑類包括甲基芐肼(procarbazine)和hexamethylmelamine?？勾x類包括抗葉酸類、氟尿嘧啶類、脫氧核苷類似物和巰嘌呤類藥物。抗葉酸類包括甲氨喋呤(methotrexate)和pemetrexed。氟尿嘧啶類藥物包括5-氟脲嘧啶(5-fluorouracil)。脫氧核苷類似物藥物包括cytarabine、吉西他濱(gemcitabine)、decitabine、vidaza、fludarabine、nelarabine、cladribine、clofarabine和pentostatin。巰嘌呤類(thiopurines)藥物包括thioguanine和mercaptopurine?？刮⒐苤苿┧幬锇ㄩL春花生物堿類、紫杉烷類和足葉草毒素類。長春花生物堿(vincaalkaloids)類包括長春新堿(vincristine)、長春堿(vinblastine)、長春瑞賓(vinorelbine)、vindesine和vinflunine。紫杉烷類(Taxanes)包括紫杉醇(paclitaxel)和多烯紫杉醇(Docetaxel)。足葉草毒素(Podophyllotoxin)類包括依托泊苷(etoposide)和teniposide。拓撲異構(gòu)酶抑制劑(topoisomeraseinhibitors)包括topoisomeraseI抑制劑和topoisomeraseII抑制劑。拓撲異構(gòu)酶I抑制劑包括irinotecan和topotecan。拓撲異構(gòu)酶II抑制劑包括topoisomeraseIIpoisons和催化抑制物。topoisomeraseIIpoisons包括etoposide、doxorubicin、mitoxantrone和teniposide。催化抑制物包括novobiocin、merbarone和aclarubicin。細胞毒性抗生素包括阿霉素、daunorubicin、表柔比星(epirubicin)、idarubicin、pirarubicin、aclarubicin、mitoxantrone、gactinomycin、博來霉素(bleomycin)、plicamycin和mitomycin?！胺暖熤苿保悍暖熤苿┦强梢援a(chǎn)生射線的物質(zhì)。采用放療制劑治療腫瘤的方法被稱為化療。本發(fā)明提供的寡核苷酸可以和放療聯(lián)合應(yīng)用治療腫瘤。用于放療的物質(zhì)是產(chǎn)生α、β、γ射線的放射性同位素。用于放療的射線也可由機器產(chǎn)生，這類機器包括x射線治療機或加速器?！凹に匾种莆锘蚣に亍保罕景l(fā)明提供的寡核苷酸可以和用于腫瘤治療的激素抑制物或激素聯(lián)合應(yīng)用治療腫瘤，這類抑制物包括但不限于激素合成抑制劑、激素受體拮抗劑和補充用激素。激素合成抑制劑包括芳香化酶抑制劑和促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasinghormone，GnRH)類似物。芳香化酶抑制劑包括Letrozole，anastrozole和Aminoglutethimide。GnRH類似物包括Leuprolide和gosereli。激素受體拮抗劑包括選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑和雄激素受體拮抗劑。選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑包括Tamoxifen、Raloxifene、Toremifene和fulvestrant。雄激素受體拮抗劑包括Flutamide和bicalutamide。補充用激素是采用補充激素(Hormonesupplementation)治療腫瘤的方法，采用的激素包括孕激素、雄激素、雌激素、孕酮樣藥物、睪丸酮樣藥物、雌激素激動劑和生長激素抑制素類似物。孕酮樣藥物包括megestrolacetate和medroxyprogesteroneacetate。睪丸酮樣藥物包括Fluoxymesterone。雌激素拮抗劑包括diethylstilbestrol，Estrace和Polyestradiolphosphate。生長激素抑制素類似物包括Octreotide?！凹毎蜃印保罕景l(fā)明提供的寡核苷酸可和細胞因子聯(lián)合應(yīng)用治療腫瘤、增強疫苗的免疫效果。這些細胞因子包括但不限于：白細胞介素(IL)-2、血小板生成素(IL-11)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞-單核細胞集落刺激因子(GM-CSF)和干擾素α。“腫瘤治療用抗體”本發(fā)明提供的寡核苷酸可和腫瘤治療用抗體(tumortherapeuticantibodies)聯(lián)合應(yīng)用治療腫瘤。腫瘤治療用抗體是在給患腫瘤個體應(yīng)用后能延長其生存期的抗體，這些抗體靶向的分子包括但不限于CD20、ErbB2、表皮細胞生長因子受體、包括CTLA-4和PD-1在內(nèi)的免疫卡點分子、血管內(nèi)皮細胞生長因子受體、CD30、CD52和CD33。所涉及到的腫瘤治療抗體這些抗體包括但不限于靶向CD20的Tositumomab(Bexxar)、Rituximab(Rituxan)和Ofatumumab(Arzerra；Genmab)；靶向ErbB2的Trastuzumab(Herceptin)；靶向表皮細胞生長因子受體的Panitumumab(Vectibix)和Cetuximab(Erbitux)；靶向PD-1的人源化抗體；靶向CTLA-4的人源化抗體；靶向血管內(nèi)皮細胞生長因子受體的Bevacizumab(Avastin)；靶向CD30的Brentuximab(vedotin)；靶向CD52的Alemtuzumab(Campath)和靶向CD33的Gemtuzumabozogamicin(Mylotarg；Wyeth)[ScottAMetal.NatRevCancer.2012Mar22；12(4)：278-87]?！靶》肿蛹っ敢种莆铩保罕景l(fā)明提供的寡核苷酸可和小分子激酶抑制物(small-moleculekinaseinhibitors)聯(lián)合應(yīng)用治療腫瘤。小分子激酶抑制物為一類能通過抑制蛋白激酶活性發(fā)揮腫瘤治療作用的小分子化合物，包括但不限于下述：靶向Bcr-Abl的Imatinib；靶向EGFR/ErbB2的Afatinib；靶向VEGFR1/VEGFR2/VEGFR3/PDGFRB/c-KIT的Axitinib；靶向BcrAbl/SRC的Bosutinib；靶向ALK/Met的Crizotinib；靶向ErbB1的Erlotinib；靶向Syk的Fostamatinib；靶向EGFR的Gefitinib；靶向BTK的Ibrutinib；靶向ErbB1/ErbB2的Lapatinib；靶向VEGFR2/VEGFR2的Lenvatinib；靶向Bcr-Abl的Nilotinib；靶向VEGFR2/PDGFR/c-kit的Pazopanib；靶向JAK的Ruxolitinib；靶向突變BRAF的vemurafenib(Zelboraf)和dabrafenib(Tafinlar)和靶向MEK的trametinib(Mekinist)。小分子蛋白激酶抑制物還包括所有的通過抑制下述蛋白激酶來治療腫瘤的小分子化合物：Bcr-Ab、EGFR/ErbB2、VEGFR1/VEGFR2/VEGFR3/PDGFRB/c-KIT、BcrAb1/SRC、ALK/Met、ErbB1、Syk、EGFR、BTK、ErbB1/ErbB2、VEGFR2/VEGFR2、Bcr-Abl、VEGFR2/PDGFR/c-kit、JAK、BRAF和MEK[AdamsJLetalNatRevDrugDiscov.2015Sep；14(9)：603-22]。“多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制物”：本發(fā)明提供的寡核苷酸可和多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制物(polyADPribosepolymerase，PARP)聯(lián)合應(yīng)用治療腫瘤。多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶抑制物，簡稱PARP抑制物，是可通過抑制PARP活性治療腫瘤的制劑。PARP抑制物包括但不限于：治療乳腺癌和肺鱗狀細胞癌的Iniparib；治療乳腺癌的Talazoparib(BMN-673)；治療乳腺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌和晚期前列腺癌的Olaparib；治療乳腺和卵巢癌的Rucaparib；治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤和乳腺癌的Veliparib和治療非小細胞肺癌的CEP9722[NatureReviewsClinicalOncology12，27-41，2015]?！把苌梢种苿保罕景l(fā)明提供的寡核苷酸可和血管生成抑制劑聯(lián)合應(yīng)用治療腫瘤。血管生成抑制劑是可以通過抑制血管生成治療腫瘤的制劑[AlbiniAetal.NatRevClinOncol.2012Sep；9(9)：498-509]，包括但不限于：包括阿瓦斯丁(Avastin或bevacizumab)在內(nèi)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的人源化單克隆抗體；包括恩度(ENDOSTAR)在內(nèi)的血管內(nèi)皮抑制素和包括pegaptinib在內(nèi)的抗血管內(nèi)皮細胞生長因子的核酸適體(aptamer)?！叭芰霾《尽保罕景l(fā)明提供的寡核苷酸可和溶瘤病毒聯(lián)合應(yīng)用治療腫瘤。溶瘤病毒是可以通過裂解腫瘤細胞治療腫瘤的病毒，包括但不限于新城疫病毒、單純皰疹病毒、腺病毒、痘病毒、克薩病毒、呼吸道腸道病毒、麻疹病毒，脊髓灰質(zhì)炎病毒、濾泡性口炎病毒、塞尼卡谷病毒、細小病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒[KaufmanHLetal.NatRevDrugDiscov.2015Sep1；14(9)：642-62]?！澳[瘤治療用細胞”：本發(fā)明提供的寡核苷酸可以和腫瘤治療用細胞聯(lián)合應(yīng)用治療腫瘤。腫瘤治療用細胞是應(yīng)用于個體后能行使抗腫瘤效應(yīng)的細胞，這些細胞包括但不限于腫瘤細胞、樹突細胞、T淋巴細胞和NK細胞?！澳[瘤細胞”：本發(fā)明提供的寡核苷酸可以和腫瘤細胞聯(lián)合應(yīng)用治療腫瘤。腫瘤細胞在個體能激發(fā)抗腫瘤免疫應(yīng)答，可被用作腫瘤疫苗。這類腫瘤細胞包括但不限于自體腫瘤細胞、同種異體腫瘤細胞和腫瘤細胞系細胞，也包括轉(zhuǎn)染細胞因子(如GM-CSF和IL-2)編碼基因和/或共刺激分子(如B7)編碼基因的腫瘤細胞(Hurwitz，A.etal.(1998)Proc.Natl.Acad.SciU.S.A.1998；95：10067-10071)?！皹渫患毎保罕景l(fā)明提供的寡核苷酸可以和自體樹突細胞(Dendriticcells，DC)聯(lián)合應(yīng)用來治療腫瘤?？商岢誓[瘤抗原的樹突細胞被應(yīng)用于個體后可激發(fā)抗腫瘤免疫應(yīng)答，這種細胞也可被用作樹突細胞疫苗。腫瘤治療用樹突細胞包括但不限于裝載單一的腫瘤抗原(蛋白抗原或抗原肽，如前列腺酸性磷酸酶)的樹突細胞、裝載腫瘤細胞裂解物的樹突細胞、裝載腫瘤細胞RNA的樹突細胞和裝載自體腫瘤細胞洗脫肽的樹突細胞[Nestle，F(xiàn).etal.(1998)NatureMedicine4：328-332；PaluckaKetal.NatRevCancer.2012Mar22；12(4)：265-77]。腫瘤治療用樹突細胞也包括基因轉(zhuǎn)染樹突細胞。用于轉(zhuǎn)染樹突細胞的基因包括但不限于腫瘤抗原編碼基因、細胞因子(如IL-2，GM-CSF)編碼基因和共刺激分子編碼基因。腫瘤治療用樹突細胞也包括樹突細胞和腫瘤細胞融合細胞(Kugler，A.etal.(2000)NatureMedicine6：332-336)。“腫瘤治療用T細胞”：本發(fā)明提供的寡核苷酸可以和腫瘤治療用T細胞聯(lián)合應(yīng)用治療腫瘤。腫瘤治療用T細胞是被用于腫瘤治療的自體T細胞，包括腫瘤浸潤T細胞和經(jīng)遺傳改造的T細胞(GeneticallyengineeredTcells)。經(jīng)遺傳改造的T細胞組裝有可識別腫瘤抗原的嵌合抗原受體(chimericantigenreceptor，CAR)，表達該類受體的T細胞被稱為CAR-T。腫瘤浸潤的T細胞和經(jīng)遺傳改造的T細胞可在體外用IL-2擴增后被回輸?shù)侥[瘤患者體內(nèi)[KershawMHetal.NatRevCancer.2013Aug；13(8)：525-41]?！澳[瘤治療用天然殺傷細胞”：本發(fā)明提供的寡核苷酸可以和腫瘤治療用天然殺傷細胞[Naturalkiller(NK)cells]聯(lián)合應(yīng)用治療腫瘤。腫瘤治療用天然殺傷細胞也稱腫瘤治療用NK細胞。這種NK細胞可以從個體的外周血或臍帶血分離，也可從造血細胞前體細胞、胚胎干細胞或多能干細胞誘導(dǎo)生成。分離或誘導(dǎo)生成的NK細胞可在體外用IL-2和IL-15擴增后回輸給個體[ChildsRW，etal.NatRevDrugDiscov.2015Jul；14(7)：487-98]?！翱垢腥尽保罕景l(fā)明提供的寡核苷酸單獨應(yīng)用或作為疫苗佐劑應(yīng)用可發(fā)揮抗感染作用。抗感染和對微生物感染產(chǎn)生治療或預(yù)防作用是可以互換的術(shù)語。單獨應(yīng)用本發(fā)明提供的寡核苷酸產(chǎn)生的抗感染作用尤其適合于尚無有效疫苗的微生物引起的感染，如HIV和HCV；也適合抗原性易發(fā)生變化的病原體如HIV、HCV流感病毒和瘧原蟲。因為具有增強T細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的功效，本發(fā)明提供的寡核苷酸可被用于致病性病毒、致病性細菌、致病性真菌和致病性寄生蟲感染的治療，也可被用作致病性病毒、致病性細菌、致病性真菌和致病性寄生蟲疫苗的佐劑?！爸虏⌒圆《尽保罕景l(fā)明提供的寡核苷酸單獨應(yīng)用或作為疫苗佐劑應(yīng)用發(fā)揮抗致病性病毒(pathogenicviruses)感染的作用。這些致病性病毒包括hepatitis(A，B，orC)，herpesvirus(e.g.，VZV，HSV-1，HAV-6，HSV-II，andCMV，EpsteinBarrvirus)，adenovirus，influenzavirus，flaviviruses，echovirus，rhinovirus，coxsackievirus，cornovirus，respiratorysyncytialvirus，mumpsvirus，rotavirus，measlesvirus，rubellavirus，parvovirus，vacciniavirus，HTLVvirus，denguevirus，papillomavirus，molluscumvirus，poliovirus，rabiesvirus，JCvirus和arboviralencephalitisvirus?！爸虏⌒约毦保罕景l(fā)明提供的寡核苷酸單獨應(yīng)用或作為疫苗佐劑應(yīng)用發(fā)揮抗致病性細菌(pathogenicbacteria)感染的作用。這些致病性細菌包括chlamydia，rickettsialbacteria，mycobacteria，staphylococci，streptococci，pneumonococci，meningococciandconococci，klebsiella，proteus，serratia，pseudomonas，legionella，diphtheria，salmonella，bacilli，cholera，tetanus，botulism，anthrax，plague，leptospirosis和Lymesdiseasebacteria。“致病性真菌”：本發(fā)明提供的寡核苷酸單獨應(yīng)用或作為疫苗佐劑應(yīng)用發(fā)揮抗致病性真菌(pathogenicfungi)感染的作用。這些致病性真菌包括Candida，Cryptococcusneoformans，Aspergillus，GenusMucorales，Sporothrixschenkii，Blastomycesdermatitidis，Paracoccidioidesbrasiliensis，Coccidioidesimmitis和Histoplasmacapsulatum?！爸虏〖纳x”：本發(fā)明提供的寡核苷酸單獨應(yīng)用或作為疫苗佐劑應(yīng)用發(fā)揮抗致病寄生蟲(pathogenicparasites)的作用。這些致病性寄生蟲(pathogenicparasires)包括Entamoebahistolytica，Balantidiumcoli，Naegleriafowleri，Acanthamoebasp.，Giardialambia，Cryptosporidiumsp.，Pneumocystiscarinii，Plasmodiumvivax，Babesiamicroti，Trypanosomabrucei，Trypanosomacruzi，Leishmaniadonovani，Toxoplasmagondi和Nippostrongylusbrasiliensis?！八幬锝M合物”：本發(fā)明提供的寡核苷酸藥物可與藥物學(xué)上可接受的載體(pharmaceuticallyacceptablecarrier)組成藥物組合物(pharmaceuticalcompositions)，該藥物組合物可以包含本發(fā)明所提供的寡核苷酸。該組合物中的寡核苷酸的使用劑量為有效劑量(EffectiveDosages)。該組合物可和抗原、疫苗、佐劑和具有腫瘤治療作用的制劑或細胞聯(lián)合應(yīng)。該藥物組合物可被制成一定的劑型，這些劑型包括但不限于溶液、乳化液、脂質(zhì)體和凍干粉等。“藥物學(xué)可接受的載體”：本發(fā)明提供的寡核苷酸藥物可與藥物學(xué)上可接受的載體(pharmaceuticallyacceptablecarrier)組成藥物組合物(pharmaceuticalcompositions)。藥物學(xué)可接受的載體(pharmaceuticallyacceptablecarrier)是指一種或多種固體或液體的填充劑、稀釋劑或包封物質(zhì)。這類載體適合將本發(fā)明提供的寡核苷酸應(yīng)用于個體。該載體可以是有機的、無機的，天然的或合成的。藥物學(xué)可接受的載體可以是藥學(xué)可接受的溶劑(水溶液和非水溶液)、分散劑、懸濁劑、乳化劑、粉劑、稀釋劑、脂質(zhì)體、抗菌劑、抗真菌劑、等滲制劑、延緩吸收制劑、凍干保護劑和其他的適合本發(fā)明中的核苷酸增強疫苗或抗原的免疫效力，產(chǎn)生治療腫瘤作用的制劑。水溶液包括單不限于水、生理鹽水、PBS緩沖液、平衡鹽溶液和葡萄糖溶液。溶劑或分散劑可包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等，也包括由這些溶劑或分散劑組成的混合物。為了維持藥物組合物的流動性可應(yīng)用包括卵磷脂在內(nèi)的脂類。為了使藥物組合物處于理想的顆粒狀態(tài)可以應(yīng)用表面活性劑。為了有合適的滲透壓，可在藥物組合物中添加糖、包括甘露醇和山梨醇在內(nèi)的多元醇和氯化鈉等。為了延長作用時間，可在藥物組合物中加入緩釋劑如硬脂酸鹽和明膠。乳化劑可包括水包油乳化劑、油包水乳化劑或水包油包水乳化劑。藥物學(xué)可接受的載體也包括藥學(xué)可接受的抗氧化劑(pharmaceutically-acceptableantioxidants)，這些抗氧化劑包括：水溶性抗氧化劑，如ascorbicacid，cysteinehydrochloride，sodiumbisulfate，sodiummetabisulfite和sodiumsulfite等；油溶性抗氧化劑，如ascorbylpalmitate，butylatedhydroxyanisole(BHA)，butylatedhydroxytoluene(BHT)，lecithin，propylgallate和alpha-tocopherol等；金屬螯合劑，如枸櫞酸、ethylenediaminetetraaceticacid(EDTA)、sorbitol、tartaricacid和phosphoricacid。“有效劑量”：本發(fā)明所提供的寡核苷酸的有效劑量(EffectiveDosages)包括“增強抗原免疫效力有效劑量”和“腫瘤治療有效劑量”。增強抗原免疫效力有效劑量是給個體應(yīng)用后能顯著增強抗原或疫苗免疫效力的寡核苷酸劑量，也指在給予個體后可產(chǎn)生理想的預(yù)防或治療傳染性疾病或腫瘤的寡核苷酸劑量。腫瘤治療有效劑量是給個體應(yīng)用后能產(chǎn)生腫瘤治療作用的寡核苷酸的劑量。劑量的多少決定于本領(lǐng)域技術(shù)熟練人員應(yīng)知的標(biāo)準，還要參考其他因素，這些因素包括并不限于個體的大小和健康情況和疾病的嚴重程度。本發(fā)明提供的寡核苷酸可單次或多次應(yīng)用于個體，每次的劑量范圍可在1μg到1000mg的范圍。為了達到理想的效果，本領(lǐng)域技術(shù)熟練人員可以對此寡核苷酸的劑量作調(diào)整，其劑量范圍可以是前述范圍的10倍到1000倍。在給個體應(yīng)用時，本發(fā)明提供的寡核苷酸可采用劑量單位。每一單位包含定量的可產(chǎn)生預(yù)防或治療作用寡核苷酸和所需的藥學(xué)可接受的組合物。劑量單位界定的依據(jù)是寡核苷酸產(chǎn)生治療作用的特有活性特征和個體在接受該寡合甘酸治療時對該寡核苷酸的敏感性。如果需要，以劑量單位應(yīng)用的寡核苷酸每天可以按一定的時間間隔應(yīng)用2次、3次、4次、5次或多次。本發(fā)明提供的寡核苷酸可以按個體單位體重(hostbodyweight)應(yīng)用，劑量范圍是0.0001到100mg/kg，應(yīng)用的間隔可以是每兩周一次或每月一次或每3到6個月一次或其它適合產(chǎn)生預(yù)防、治療作用的時間間隔。在和抗原或疫苗聯(lián)合應(yīng)用時，該寡核苷酸的劑量可以是1-1000μg/ml。有效劑量包括治療有效劑量(therapeuticallyeffectivedose)和預(yù)防有效劑量(prophylactically-effectivedose)?！敖o藥途徑”：本發(fā)明提供的寡核苷酸在單獨應(yīng)用或和其它制劑如抗原、佐劑和抗腫瘤制劑聯(lián)合應(yīng)用時可采用腸外、外用或吸入的給藥途徑。腸外給藥途徑包括經(jīng)靜脈、腹膜、鞘內(nèi)、肌肉、皮下、皮內(nèi)、局部、瘤旁淋巴結(jié)、腫瘤組織直接注射和淋巴結(jié)內(nèi)注射。外用給藥途徑包括經(jīng)皮膚、口、眼、耳和鼻。吸入可經(jīng)鼻粘膜和肺。“治療裝置”含本發(fā)明提供的寡核苷酸的藥物組合物可用本領(lǐng)域技術(shù)熟練人員應(yīng)知的治療裝置應(yīng)用于個體。治療裝置包括但不限于無針注射裝置、植入裝置、倉室裝置(modules)、植入性微輸液泵(implantablemicro-infusionpump)、輸液泵和滲透藥物遞送系統(tǒng)(osmoticdrugdeliverysystem)。“遞送載體”：本發(fā)明中的寡核苷酸可經(jīng)遞送載體應(yīng)用。遞送載體包括但不限于：類固醇(如膽固醇)、絡(luò)和物、乳化物、免疫刺激復(fù)合物(ISCOMs)、脂質(zhì)(如陽離子脂質(zhì)和陰離子脂質(zhì))、脂質(zhì)體、細菌載體(如沙門氏菌、大腸桿菌、分枝桿菌志賀(氏)桿菌、乳酸桿菌)、病毒載體(如牛痘苗、腺病毒、單純皰疹病毒)、病毒小體、病毒樣顆粒、微球、核酸疫苗、高分子材料(如羧甲基纖維素、脫乙酰殼多糖)和環(huán)狀多聚物。遞送載體也可以是特異性受體的配體或細胞的靶向分子。附圖說明：圖1：采用Bac-to-Bac系統(tǒng)表達的PCV2b衣殼蛋白的檢定圖2：寡核苷酸(A1，A2)對重組蛋白抗原再刺激誘導(dǎo)的CD4+T細胞激活的影響圖3寡核苷酸(A1，A2)對抗原再刺激誘導(dǎo)的小鼠脾細胞CTLA-4mRNA表達的影響圖4：寡核苷酸(A1，A2)對抗原再刺激誘導(dǎo)的CD4+T細胞CTLA-4表達的影響圖5：采用大腸桿菌表達的PCV2b衣殼蛋白的檢定圖6寡核苷酸(A1和A2)對重組蛋白抗原再激活小鼠抗原提呈細胞CD80的影響圖7寡核苷酸(A1和A2)對重組蛋白抗原再激活小鼠抗原提呈細胞CD86的影響圖8寡核苷酸(A1和A2)對圓環(huán)病毒疫苗免疫效力的增強作用圖9寡核苷酸(A1和A2)對乙型肝炎疫苗免疫效力的增強作用圖10寡核苷酸(A1和A2)對狂犬疫苗免疫效力的增強作用圖11寡核苷酸(A1和A2)對流感病毒疫苗免疫效力的增強作用圖12GL261細胞膠質(zhì)瘤腫瘤細胞裂解物的檢定圖13寡核苷酸(A1，A2)對黑色素瘤的治療作用具體實施方法：實施例1寡核苷酸(A1，A2)的設(shè)計及合成：根據(jù)人和小鼠CTLA-4mRNA3’UTR的序列，設(shè)計了兩種單鏈脫氧寡核苷酸，這兩種寡核苷酸分別被命名為A1和A2，具有如序列表<400>1和<400>2所示的序列。A1的序列是5’ttctttgggctgtgccattccctaa3’(序列表<400>1)。A2的序列是5’tttcatggaaaatattgagttaaaa3’(序列表<400>2)。A1和A2的序列和CTLA-4mRNA3’UTR的序列互補。A1和A2由寶生物工程(大連)有限公司(TakaraBio)合成，其骨架為全硫代修飾。在應(yīng)用時，A1和A2用無菌PBS或其它溶媒溶解，并經(jīng)無熱源處理，-20℃凍存。含A1和A2溶液中的內(nèi)毒素應(yīng)用鱟變形細胞溶解法檢測。溶液中的A1和A2的含量采用分光光度計(260nm波長)確定，也可采用瓊脂糖凝膠(3％)電泳估算(根據(jù)已知含量單鏈脫氧寡核苷酸標(biāo)準品估算)。實施例2寡核苷酸(A1，A2)對重組蛋白抗原再刺激導(dǎo)的CD4+T細胞激活的影響：采用重組蛋白抗原疫苗免疫小鼠，在免疫后取小鼠脾細胞做抗原回憶反應(yīng)(recall)實驗，在細胞培養(yǎng)體系中加入抗原和寡核苷酸(A1)或寡核苷酸(A2)。培養(yǎng)24小時后，用流式細胞儀檢測CD4+T細胞表面CD69分子的表達來判定A1或A2對CTLA-4功能的抑制作用。CD69是一種細胞膜糖蛋白分子，參與T細胞增生的誘導(dǎo)。在靜息的CD4+T細胞表面，CD69表達的水平很低。在受到抗原激活(TCRstimulation)后，表達在CD4+T細胞表面的CD69迅速上調(diào)，其表達在16-24達到高峰，然后下降。CD69分子是CD4+T細胞早期激活的標(biāo)志物(earlymarkers)。在CD4+T細胞激活的早期激活，CTLA-4抑制CD4+T細胞表面CD69的表達[ChambersCA.etal.AnnuRevImmunol.2001；19：565-94]。2.1免疫小鼠2.1.1材料2.1.1.1小鼠ICR小鼠(吉林大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物室)，雌性，體重為17-18克。2.1.1.2抗原采用Bac-to-Bac系統(tǒng)表達的PCV2b衣殼蛋白(簡稱P蛋白)，此蛋白能組裝成類病毒顆粒(viruslikeparticls，VLP)。經(jīng)SDS-PAGE檢測，P蛋白呈現(xiàn)為分子量為28KD的區(qū)帶。在電鏡下(4萬倍放大)，P蛋白已組裝成大小約為17nM的類病毒顆粒(viruslikeparticles，VLPs，見圖-1。2.1.1.3佐劑ISA35乳化劑(Seppic)2.1.2疫苗的配制將P蛋白用PBS稀釋為60μg/ml，將此P蛋白溶液和ISA35乳化劑按1∶1(體積∶體積)混合制成疫苗，此疫苗被命名為P-ISA35。100μlP-ISA35中含3μgP蛋白。2.1.3.小鼠免疫于第0天對ICR小鼠進行初次免疫，方法是注射100μlP-ISA35，注射部位是右后肢肌肉，單點注射。于第14天對ICR小鼠進行加強免疫，方法是注射100μlP-ISA35，注射部位是右后肢肌肉，單點注射。2.2.寡核苷酸(A1，A2)對P蛋白再激活誘導(dǎo)的P-ISA35免疫小鼠CD4+T細胞激活的影響2.2.1試劑RPIM1640培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購自Gibco公司。FITC標(biāo)記的抗鼠CD4抗體和PE標(biāo)記的抗鼠CD69抗體購自BD公司。P蛋白(簡稱P，見2.1.1.2)。寡核苷酸(A1)[5’ttctttgggctgtgccattccctaa3’(序列表<400>1)]和寡核苷酸(A2)[5’tttcatggaaaatattgagttaaaa3’(序列表<400>2]，如實施例1所述。2.2.2.器材和儀器24培養(yǎng)板孔板、平皿、毛玻璃片、300目濾網(wǎng)、小鑷子、細胞計數(shù)板、滴管、加樣器。CO2細胞培養(yǎng)孵箱(日本SANYO公司)、細胞培養(yǎng)倒置顯微鏡(日本Olympus公司)、離心機(德國BiofugeFresco)、ACEANovoCyte流式細胞儀(美國艾森公司)。2.2.3.實驗在用P-ISA35加強免疫后第48天處死P-ISA35免疫小鼠，于75％乙醇內(nèi)浸泡2min，無菌取脾，將脾放入含有5mL冰浴10％FBS1640培養(yǎng)基的平皿中。用毛玻璃片將脾研磨成單個細胞。用300目尼龍網(wǎng)過濾，收取脾細胞單細胞懸液。用紅細胞裂解液ACK(0.155mol/LNH4Cl，0.01mol/LKHCO3，0.1mol/LEDTA，pH7.4)去除其中的紅細胞。用10％FBS1640(8mL)，離心洗滌(1,200rpm5min)，棄上清。用10％FBS1640懸起去紅細胞的脾細胞懸液。計數(shù)細胞，用10％FBS1640調(diào)細胞濃度為5×106個/ml。將細胞加入24孔培養(yǎng)板，每孔1ml，則每孔細胞個數(shù)為5×106個。加入P蛋白(終濃度10μg/ml)，或加入P蛋白(終濃度10μg/ml)和A1(終濃度5μg/ml)，或加入P蛋白(終濃度10μg/ml)和A2(終濃度5μg/ml)。培養(yǎng)24小時后，收取細胞。用加樣器輕吹細胞，置于1.5mlEP管中，2000rpm，離心5min。棄上清，將細胞彈勻，加入1mlPBS清洗細胞，2000rpm，離心2min。用40μlPBS重懸細胞，分別置于2個1.5EP管中，20μl/管。加FITC標(biāo)記的抗鼠CD4熒光抗體，PE標(biāo)記的抗鼠CD69熒光抗體。冰上，避光孵育30min。加入1mlPBS清洗細胞，2000rpm，離心2min。用200μlPBS重懸，用300目濾網(wǎng)過濾后，用流式細胞儀檢測。2.2.4.結(jié)果A1或A2處理可使CD4+T淋巴細胞的CD69分子表達明顯提高(圖-2)，提示A1或A2可通過抑制CTLA的功能維持促進CD4+T淋巴細胞的激活，具有這一活性的A1或A2可被用于個體來增強其對微生物抗原(疫苗)、腫瘤抗原(疫苗)的免疫應(yīng)答，也可被用于個體來增強其抗腫瘤反應(yīng)。實施例3寡核苷酸(A1，A2)對抗原再刺激誘導(dǎo)的小鼠脾細胞CTLA-4mRNA表達的抑制作用：采用如實施例2所述P蛋白按實施例2所述免疫ICR小鼠，在免疫后取小鼠脾細胞用P蛋白做回憶反應(yīng)(recall)實驗，在細胞培養(yǎng)體系中加入寡核苷酸A1或寡核苷酸A2。培養(yǎng)24小時后，收取細胞，提取mRNA，做逆轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)，檢測CTLA-4mRNA的表達。靜息的T細胞幾乎不表達CTLA-4mRNA，在受到激活后T細胞表達的CTLA-4mRNA水平迅速升高[BrunetJF，etal.Nature.1987Jul16-22；328(6127)：267-70]，導(dǎo)致T細胞表面出現(xiàn)更多的CTLA。3.1材料P蛋白(簡稱P，見2.1.1.2)。寡核苷酸(A1)[5’ttctttgggctgtgccattccctaa3’(序列表<400>1)]和寡核苷酸(A2)[5’tttcatggaaaatattgagttaaaa3’(序列表<400>2]，如實施例1所述。RPIM1640培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購自Gibco公司。TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司。EasyScriptFirst-StrandcDNASynthesisSuperMix、TopGreenqPCRSuperMix(TransStartTM)試劑盒購自全式金(Transgen)公司；GAPDH特異性引物(用于擴增GAPDH特異性cDNA，GAPDH為管家基因)，上游引物的序列是：5’-ATCACCATCTTCCAGGAGCGA-3’，下游引物的序列是5’-TCTCGTGGTTCACACCCATCA-3’。CTLA4特異性引物(用于擴增CTLA4特異性cDNA)，上游引物的序列為：5’-CCCAGTCTTCTCTGAAGCCATA-3’，下游引物的序列為：5’-TCTCTGTGAATGTCGTGGCA-3’。GAPDH特異性引物和CTLA4特異性引物均由寶生物工程(大連)有限公司(TakaraBio)合成。3.2小鼠為P-ISA35免疫ICR小鼠(見2.1.3)。3.3.主要實驗器材和儀器24孔培養(yǎng)板、平皿、毛玻璃片、300目濾網(wǎng)、小鑷子、細胞計數(shù)板、滴管、加樣器。CO2細胞培養(yǎng)孵箱(日本SANYO公司)、細胞培養(yǎng)倒置顯微鏡(日本Olympus公司)、離心機(德國BiofugeFresco)、熒光定量PCR儀(美國AppliedBiosystems，型號：ABIPrism7300)。3.4實驗犧牲P-ISA35加強免疫ICR小鼠，于75％乙醇內(nèi)浸泡2min，無菌取脾，將脾放入含有5mL冰浴10％FBS1640培養(yǎng)基的平皿中。用毛玻璃片將脾研磨成單個細胞。用300目尼龍網(wǎng)過濾，收取脾細胞單細胞懸液。用紅細胞裂解液ACK(0.155mol/LNH4Cl，0.01mol/LKHCO3，0.1mol/LEDTA，pH7.4)去除其中的紅細胞。用10％FBS1640(8mL)，離心洗滌(1,200rpm5min)，棄上清。用10％FBS1640懸起去紅細胞的脾細胞懸液。計數(shù)細胞，用10％FBS1640調(diào)細胞濃度為5×106個/ml。將細胞加入24孔培養(yǎng)板，每孔1ml，則每孔細胞個數(shù)為5×106個。加入P蛋白(終濃度10μg/ml)，或加入P蛋白(終濃度10μg/ml)和A1(終濃度10μg/ml)，或加入P蛋白(終濃度10μg/ml)和A2(終濃度10μg/ml)。培養(yǎng)24小時后，收取細胞。用Trizol法提取總RNA。采用EasyScriptFirst-StrandcDNASynthesisSuperMix、TopGreenqPCRSuperMix(TransStartTM)試劑盒，以GAPDH特異性引物和CTLA4特異性引物做qPCR分別擴增GAPDH特異性cDNA和CTLA4特異性cDNA。上熒光定量PCR儀(ABIPrism7300)做熒光定量PCR分析。3.5.結(jié)果：A1和A2抑制P蛋白再刺激誘導(dǎo)的小鼠免疫細胞CTLA-4mRNA的表達(圖-3)和行使其功能。這說明，A1和A2可抑制CTLA-4mRNA的表達和抑制其行使其功能，因而促進、維持T細胞的激活。該結(jié)果說明，具抑制P蛋白再刺激誘導(dǎo)的小鼠免疫細胞CTLA-4mRNA的表達和行使其功能的A1或A2可被用于個體來增強其對微生物抗原(疫苗)、腫瘤抗原(疫苗)的免疫應(yīng)答，也可被用于個體來增強其抗腫瘤反應(yīng)。實施例4寡核苷酸(A1，A2)對抗原再刺激誘導(dǎo)的CD4+T細胞CTLA-4表達的抑制作用：采用如實施例2所述P蛋白按實施例2所述免疫ICR小鼠，在免疫后取小鼠脾細胞用P蛋白做回憶反應(yīng)(recall)實驗，在細胞培養(yǎng)體系中加入寡核苷酸A1或寡核苷酸A2。培養(yǎng)48小時后，收取細胞，用熒光標(biāo)記CTLA-4抗體染細胞做流式分析。CTLA-4是對T細胞有負調(diào)節(jié)作用的膜信號分子。在TCR激活(Tcellreceptoractivation)(識別抗原肽的激活)后，T細胞迅速表達CTLA-4[SakaguchiS，etal.Science.2011Apr29；332(6029)：542-3]。CD4+和CD8+T細胞表達CTLA-4。和CD8+T細胞相比，CD4+T細胞可表達更高水平的CTLA-4。抑制CTLA-4表達可促進、維持T細胞激活增生。在這種情況下，CD4+T細胞比CD8+T細胞激活增生的更明顯[ChanDV，etal.GenesImmun.2014Jan；15(1)：25-32]。4.1材料P蛋白(簡稱P，見2.1.1.2)。寡核苷酸(A1)[5’ttctttgggctgtgccattccctaa3’(序列表<400>1)]和寡核苷酸(A2)[5’tttcatggaaaatattgagttaaaa3’(序列表<400>2]，如實施例1所述。RPIM1640培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購自Gibco公司。FITC標(biāo)記的抗鼠CD4抗體和PE標(biāo)記的抗鼠CTLA4抗體購自BD公司。4.2小鼠為P-ISA35免疫ICR小鼠(見2.1.3)。4.3.主要實驗器材24孔培養(yǎng)板、平皿、毛玻璃片、300目濾網(wǎng)、小鑷子、細胞計數(shù)板、滴管、加樣器。CO2細胞培養(yǎng)孵箱(日本SANYO公司)、細胞培養(yǎng)倒置顯微鏡(日本Olympus公司)、離心機(德國BiofugeFresco)、ACEANovoCyte流式細胞儀(美國艾森公司)。4.4實驗犧牲P-ISA35加強免疫ICR小鼠，按3.4所述的方法獲得小鼠脾細胞懸液。計數(shù)細胞，用10％FBS1640培養(yǎng)基調(diào)細胞濃度為5×106個/ml。將細胞加入24孔培養(yǎng)板，每孔1ml。加入P蛋白(終濃度10μg/ml)，或加入P蛋白(終濃度10μg/ml)和A1(終濃度10μg/ml)，或加入P蛋白(終濃度10μg/ml)和A2(終濃度10μg/ml)。培養(yǎng)48小時后，收取細胞。用加樣器輕吹細胞，置于1.5mlEP管中，2000rpm，離心5min。棄上清，將細胞彈勻，加入1mlPBS清洗細胞，2000rpm，離心2min。用40μlPBS重懸細胞，分別置于2個1.5EP管中，20μl/管。加FITC標(biāo)記的抗鼠CD4熒光抗體，加PE標(biāo)記的抗鼠CTLA4熒光抗體，冰上，避光孵育30min。加入1mlPBS清洗細胞，2000rpm，離心2min。用200μlPBS重懸，用300目濾網(wǎng)過濾后，用流式細胞儀檢測。4.5結(jié)果A1能抑制P蛋白再刺激誘導(dǎo)的小鼠CD4+T細胞表達CTLA4(圖-4)。這說明，A1可抑制CTLA-4的表達，因而促進、維持T細胞的激活；具有這一活性的A1可被用于個體來增強其對微生物抗原(疫苗)、腫瘤抗原(疫苗)的免疫應(yīng)答，也可被用于個體來增強其抗腫瘤反應(yīng)。實施例5寡核苷酸(A1和A2)對重組蛋白抗原再刺激小鼠抗原提呈細胞CD80和CD86的影響：抗原激活的T細胞表達CTLA-4，這種CTLA-4分子能結(jié)合抗原提呈細胞表面的CD80或CD86分子并將其內(nèi)化，使抗原提呈細胞缺少這兩種共刺激分子。缺少共刺激分子的抗原提呈細胞不能通過結(jié)合CD28向T細胞提供第二激活信號，因此限制T細胞的激活[SakaguchiSetal.Science.2011Apr29；332(6029)：542-3]。調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)表達的CTLA-4也能和抗原提呈細胞表面的CD80或CD86分子結(jié)合并將其內(nèi)化，因而使T細胞處于免疫耐受狀態(tài)[SansomDM.Science.2015Jul24；349(6246)：377-8]。因此，A1和A2使抗原提呈細胞表面的CD80或CD86減少是CTLA-4表達受到抑制的一種反應(yīng)。5.1免疫小鼠5.1.1材料5.1.1.1小鼠ICR小鼠(吉林大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物室)，雌性，體重為17-18克。5.1.1.2抗原采用大腸桿菌表達的PCV2b衣殼蛋白(簡稱D蛋白)，此蛋白能組裝成類病毒顆粒(viruslikeparticls，VLP)。在SDS-PAGE檢測，D蛋白(D)被顯示為分子量為28KD的區(qū)帶，在電鏡下觀察(4萬倍放大)，D蛋白形成典型的大小約為17nM的VLP，見圖-5。5.1.1.3佐劑ISA35乳化劑(Seppic)5.1.2疫苗的配制將D蛋白用PBS稀釋為100μg/ml，將此D蛋白溶液和ISA35乳化劑按1∶1(體積∶體積)混合制成疫苗，此疫苗被命名為D-ISA35。100μlD-ISA35中含5μgD蛋白。5.1.3小鼠免疫于第0天對ICR小鼠進行初次免疫，方法是注射100μlD-ISA35，注射部位是右后肢肌肉，單點注射。于第14天按初次免疫的抗原和方法對ICR小鼠進行加強免疫。5.2寡核苷酸(A1，A2)對D蛋白再激活抗原提呈細胞表達的CD80和CD86的影響5.2.1試劑RPIM1640培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購自Gibco公司。FITC標(biāo)記的抗鼠CD4抗體，PE標(biāo)記的抗鼠CD80抗體和PE標(biāo)記的抗鼠86抗體均購自BD公司。D蛋白(見5.1.1.2)，也用D表示。寡核苷酸(A1)[5’ttctttgggctgtgccattccctaa3’(序列表<400>1)]和寡核苷酸(A2)[5’tttcatggaaaatattgagttaaaa3’(序列表<400>2]，如實施例1所述。5.2.2.器材和儀器24孔培養(yǎng)板、平皿、毛玻璃片、300目濾網(wǎng)、小鑷子、細胞計數(shù)板、滴管、加樣器。CO2細胞培養(yǎng)孵箱(日本SANYO公司)、細胞培養(yǎng)倒置顯微鏡(日本Olympus公司)、離心機(德國BiofugeFresco)、ACEANovoCyte流式細胞儀(美國艾森公司)。5.2.3.實驗在加強免疫后第48天犧牲D-ISA35免疫小鼠，按3.4所述的方法獲得小鼠脾細胞懸液。計數(shù)細胞，用10％FBS1640調(diào)細胞濃度為5×106個/ml。將細胞加入24孔培養(yǎng)板，每孔1ml。加入D蛋白(終濃度10μg/ml)，或加入D蛋白(終濃度10μg/ml)和A1(終濃度5μg/ml)，或加入D蛋白(終濃度5μg/ml)和A2(終濃度5μg/ml)。培養(yǎng)24小時后，收取細胞。用加樣器輕吹細胞，置于1.5mlEP管中，2000rpm，離心5min。棄上清，將細胞彈勻，加入1mlPBS清洗細胞，2000rpm，離心2min。用40μlPBS重懸細胞，分別置于2個1.5EP管中，20μl/管。加FITC標(biāo)記的抗鼠CD11c抗體，PE標(biāo)記的抗鼠CD80抗體或PE標(biāo)記的抗鼠CD86抗體。冰上，避光孵育30min。加入1mlPBS清洗細胞，2000rpm，離心2min。用200μlPBS重懸，用300目濾網(wǎng)過濾后，用流式細胞儀檢測。5.2.4.結(jié)果A1或A2處理可使CD11c細胞CD80(圖-6)和CD86(圖-7)增多。這說明，應(yīng)用A1或A2可通過抑制CTLA使抗原提呈細胞表面的共刺激分子增多，因而通過提供第二激活信號促進微生物抗原和腫瘤抗原激活T淋巴細胞。具有這一活性的A1或A2可被用于個體來增強其對微生物抗原(疫苗)、腫瘤抗原(疫苗)的免疫應(yīng)答，也可被用于個體來增強其抗腫瘤反應(yīng)。實施例6寡核苷酸(A1和A2)對重組蛋白疫苗(圓環(huán)病毒疫苗)免疫效力的增強作用：6.1免疫小鼠及采集血清6.1.1材料6.1.1.1小鼠ICR小鼠(吉林大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物室)，雌性，體重為17-18克。6.1.1.2抗原D蛋白(D)，如實施例5中5.1.2所述。6.1.1.3佐劑ISA35乳化劑(Seppic)6.1.1.4寡核苷酸寡核苷酸(A1)[5’ttctttgggctgtgccattccctaa3’(序列表<400>1)]和寡核苷酸(A2)[5’tttcatggaaaatattgagttaaaa3’(序列表<400>2]，如實施例1所述。6.1.2疫苗的配制將D蛋白的濃度用D蛋白組裝液調(diào)節(jié)為600μg/ml，將此D蛋白溶液和ISA35乳化劑按1∶1(體積∶體積)混合制成疫苗，此疫苗被命名為D-ISA35。100μlD-ISA35中含30μgD蛋白。分別配制含A1和A2的D-ISA35，分別被稱為D-ISA35A1和D-ISA35A2。每100μlD-ISA35A1或D-ISA35A2中的D蛋白為30μg，A1和A2均為5μg。6.1.3免疫前采血在初次免疫前一天采集待免疫小鼠血清。小鼠尾靜脈采血，采血量≥100μl。將采集的全血(1.5mlEP管中)室溫放置30分鐘。11000rpm離心15分鐘，收集血清，分裝，-20℃保存。6.1.4小鼠免疫于第0天對ICR小鼠進行初次免疫，方法是注射100μlD-ISA35或D-ISA35A1或D-ISA35A2，注射部位是右后肢肌肉，單點注射。于第14天對ICR小鼠進行加強免疫，方法同初次免疫。6.1.5.免疫后采血在二次免疫后7天和14天，采集免疫小鼠血清。方法如免疫前采血(6.1.3)。6.2.小鼠血清特異性抗體檢測采用ELISA方法檢測小鼠血清中的圓環(huán)病毒(PCV2b)特異性抗體。6.2.1材料6.2.1.1滅活圓環(huán)病毒(PCV2b)(天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司，TCID50/ml＝7.0)。6.2.1.2試驗器材酶標(biāo)條(組合式酶標(biāo)板)，0.5mlEP管，1.5mlEP管，加樣器頭，移液器，多道移液器，平皿(直徑9cm)，刻度玻璃瓶。6.2.1.3試劑碳酸鈉(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，NaCl(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，KCl(北京化工廠)，Na2HPO4·12H2O(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，KH2PO4(天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心)，吐溫20(天津市光復(fù)精細化工研究所)，脫脂奶粉(Biotopped)，檸檬酸(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，OPD(上海三浦化工有限公司)，30％H2O2(北京化工廠)，濃硫酸(北京化工廠)和戊二醛(天津市福晨化學(xué)試劑廠)。6.2.1.4液體包被液(25％戊二醛PBS)，PBS(7.3mol/LNaCl，3mmol/LKCl，10mmol/LNa2HPO4·12H2O和17.6mmol/LKH2PO4水溶液)，洗滌液(0.05％吐溫20的PBS)，封閉液(5％脫脂奶粉的洗滌液)，0.1Mol/L檸檬酸水溶液，0.2Mol/LNa2HPO4.12H2O水溶液，10×甲乙液[0.1Mol/L檸檬酸水溶液(體積)：0.2Mol/LNa2HPO4.12H2O水溶液(體積)＝94.5∶100]，底物緩沖液[含OPD(1μg/ml)和0.045％H2O2的甲乙液]和終止液(20％濃硫酸)。6.2.2實驗用滅活PCV2b在包被液中包被酶標(biāo)條，100μl/孔，4℃過夜。甩干液體，用封閉液于37℃封閉2小時，200μl/孔。加待測血清，37℃，1小時。甩干液體，加洗滌液(300μl/孔)，室溫3min，甩干液體，重復(fù)洗滌兩次。加HRP標(biāo)記二抗(羊抗小鼠)IgG(用洗滌液做1∶5000稀釋)。100μl/孔，37℃1小時。甩干液體，用洗滌液洗滌，300μl/孔，室溫3min，甩干液體，重復(fù)洗滌兩次。加入底物液，100μl/孔，室溫避光(包錫紙)顯色15min。加終止液(稀硫酸2mmol/L，50μl/孔。用酶標(biāo)儀(波長549nm)檢測。6.2.3結(jié)果A1或A2可增強重組蛋白疫苗(圓環(huán)病毒疫苗)的免疫效力(圖-8)。這說明A1或A2可被用于個體來增強其對微生物抗原(疫苗)的免疫應(yīng)答而成為一種新型微生物抗原或微生物疫苗的佐劑。實施例7寡核苷酸(A1和A2)對乙型肝炎疫苗免疫效力的增強作用：7.1免疫小鼠及采集血清7.1.1材料7.1.1.1小鼠Balb/c小鼠，雌性，體重為17-18g，購自北京維通利華實驗動物有限公司。7.1.1.2疫苗采用鋁佐劑配制的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)疫苗(沃森生物技術(shù)有限公司)，簡稱HBsAg疫苗或HBsAg。7.1.1.3寡核苷酸寡核苷酸(A1)[5’ttctttgggctgtgccattccctaa3’(序列表<400>1)]和寡核苷酸(A2)[5’tttcatggaaaatattgagttaaaa3’(序列表<400>2]，如實施例1所述。7.1.1.4含寡核苷酸疫苗的配制在HBsAg疫苗中加入A1或A2配成含寡核苷酸HBsAg疫苗，分別被命名為HBsAg-A1和HBsAg-A2。每100μlHBsAg-A1和HBsAg-A2中的HBsAg為1μg，A1和A2均為5μg。7.2.免疫前采血在初次免疫前一天采集待免疫小鼠血清。方法如實施例6的6.1.3所述。7.3.小鼠免疫于第0天對Balb/c小鼠進行初次免疫，方法是注射100μlHBsAg疫苗或HBsAg-A1或HBsAg-A2。注射部位是右后肢肌肉，單點注射。于第14天對Balb/c小鼠進行加強免疫，方法同初次免疫。7.4.免疫后采血在二次免疫后7天和14天，采集免疫小鼠血清。方法如實施例6的6.1.3所述。7.5.免疫小鼠血清特異性抗體檢測采用ELISA方法檢測小鼠血清中的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)特異性抗體。7.5.1材料7.5.1.1重組乙型肝炎表面抗原(HBsAg)(沃森生物技術(shù)有限公司)，簡稱HBsAg。7.5.1.2試驗器材同實施例6。7.5.1.3試劑同實施例6。7.5.1.4液體同實施例6。7.5.2試驗方法用HBsAg在包被液中包被酶標(biāo)條，100μl/孔(每孔HBsAg為0.1μg)，4℃過夜。余下操作步驟同實施例6。7.5.3結(jié)果A1或A2可增強重組蛋白疫苗(乙型肝炎病毒疫苗)的免疫效力(圖-9)。這說明，A1或A2可被用于個體來增強其對微生物抗原(疫苗)的免疫應(yīng)答而成為一種新型微生物抗原或微生物疫苗的佐劑。實施例8寡核苷酸(A1和A2)對狂犬疫苗免疫效力的增強作用：8.1免疫小鼠及采集血清8.1.1材料8.1.1.1小鼠ICR/c小鼠，體重18-22克，來自吉林大學(xué)醫(yī)學(xué)部動物室。8.1.1.2疫苗狂犬疫苗(長春生物制品研究所)。8.1.1.3寡核苷酸寡核苷酸(A1)[5’ttctttgggctgtgccattccctaa3’(序列表<400>1)]和寡核苷酸(A2)[5’tttcatggaaaatattgagttaaaa3’(序列表<400>2]，如實施例1所述。8.1.1.4含寡核苷酸狂犬疫苗的配制在狂犬疫苗中加入A1或A2配成含寡核苷酸狂犬疫苗，分別被命名為狂犬疫苗-A1和狂犬疫苗-A2。每500μl含寡核苷酸疫苗含A1和A210μg。8.1.2免疫前采血在初次免疫前兩天采集待免疫小鼠血清，方法如實施例6的6.1.3所述。8.1.3.免疫小鼠于第0天、3天、7天、14天、28天經(jīng)小鼠腹腔注射0.5ml疫苗(狂犬疫苗或狂犬疫苗-A1或狂犬疫苗-A2)，每組8只小鼠，雌雄各半。8.1.5免疫前采血于第35天采集免疫小鼠血清，方法如實施例6的6.1.3所述。8.2血清狂犬病毒中和抗體檢測采用快速狂犬疫苗熒光灶抑制實驗(RFFIT)方法檢小鼠血清中狂犬疫病毒中和抗體。8.3.結(jié)果A1或A2可增強滅活病毒疫苗(狂犬疫苗)的免疫效力(圖-10)。這說明，應(yīng)A1或A2可被用于個體來增強其對微生物抗原(疫苗)的免疫應(yīng)答而成為一種新型微生物抗原或微生物疫苗的佐劑。實施例9寡核苷酸(A1和A2)對流感病毒疫苗免疫效力的增強作用：9.1免疫小鼠及采集血清9.1.1材料9.1.1.1小鼠Balb/c小鼠(吉林大學(xué)實驗動物中心)。雌性，體重為18克左右。9.1.1.2疫苗禽流感病毒H5亞型二價滅活疫苗(H5N1，Re-1株+Re-4株)(哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司)，此疫苗被簡稱為H5疫苗。9.1.1.3寡核苷酸寡核苷酸(A1)[5’ttctttgggctgtgccattccctaa3’(序列表<400>1)]和寡核苷酸(A2)[5’tttcatggaaaatattgagttaaaa3’(序列表<400>2]，如實施例1所述。9.1.1.4含寡核苷酸疫苗在H5疫苗中加入A1或A2配成含寡核苷酸H5疫苗，分別被命名為H5疫苗-A1和H5疫苗-A2。每100μlH5疫苗-A1和H5疫苗-A2中的A1和A2均為10μg。9.2.免疫及采血免疫兩次，初次免疫后22天加強免疫一次。采用后腿肌肉注射，注射疫苗的體積為100μl。在初次免疫的-2和29天經(jīng)尾靜脈采血，50μl/只。采集的血液在37℃環(huán)境放置30分鐘，4℃放置3小時后使其血清充分析出，4000r/m離心10分鐘，吸出血清，1∶400倍稀釋后用于ELISA檢測。9.3.免疫小鼠血清特異性抗體檢測采用ELISA方法檢測小鼠血清中的流感病毒特異性抗體。用提取自禽流感病毒H5亞型二價滅活疫苗的抗原作為包被抗原(見下述)用包被液(Na2CO31.59g，NaHCO32.93g，pH9.6，定容至1L)1∶2稀釋，用100μl/孔包被酶標(biāo)板，密封，4℃過夜；用洗滌液(含0.05％Tween-20的PBS)洗滌酶標(biāo)板，300μl/孔，洗3次；加入封閉液(含5％FBS的PBS)，200μl/孔，37℃2小時；用PBS稀釋小鼠血清(1∶400稀釋)，將稀釋血清加入酶標(biāo)板，100μl/孔加入，37℃放置1小時；用洗滌液洗滌3次，然后加辣根過氧化酶標(biāo)記羊抗小鼠二抗(用封閉液1∶1000稀釋)，100μl/孔，37℃放置1小時；用洗滌液洗滌3次，加入即配即用底物液(10mL中檸檬酸0.01M，Na2HPO40.02M，超純水9mL，30％H2O215μl，OPD4mg)，100μL/孔，室溫避光顯色20分鐘；加入終止液(20％硫酸)，50μl/孔；于A492測各孔的OD值。注：從禽流感病毒H5亞型二價滅活疫苗提取包被抗原。此疫苗采用的是油包水型佐劑，冷凍以及高速離心都可以使其破乳、分層。將此疫苗于-70℃/室溫凍融2次，11000r/m離心20分鐘，分離下層水相，室溫融化后11000r/m離心，可見清晰分層，上層為白色乳糜狀(油相)，下層清澈透明(水相)。用Bradford方法檢測，上層不含蛋白，下層含有蛋白。下層水相即為含H5流感病毒抗原的包被液。9.4.結(jié)果A1或A2可增強病毒疫苗(流感病毒疫苗)的免疫效力(圖-11)。這說明，A1或A2可被用于個體來增強其對微生物抗原(疫苗)的免疫應(yīng)答而成為一種新型微生物抗原或微生物疫苗的佐劑。實施例10、寡核苷酸(A1，A2)對膠質(zhì)瘤細胞裂解物疫苗的增效作用：10.1材料10.1.1小鼠C57BL/6小鼠，購自北京維通利華實驗動物有限公司。10.1.2GL261細胞GL261細胞是C57BL/6小鼠來源的膠質(zhì)瘤細胞，來自北京軍事研究院野戰(zhàn)血研所10.1.3佐劑ISA35乳化劑(Seppic，Cedex，Paris，F(xiàn)rance)10.1.4寡核苷酸寡核苷酸(A1)[5’ttctttgggctgtgccattccctaa3’(序列表<400>1)]和寡核苷酸(A2)[5’tttcatggaaaatattgagttaaaa3’(序列表<400>2]，如實施例1所述。10.2.GL261細胞膠質(zhì)瘤腫瘤細胞裂解物的制備采用含10％(v/v)胎牛血清，100IU青霉素/ml和100IU的鏈霉素/ml的RPIM1640培養(yǎng)基(Gibco)，在37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)培養(yǎng)GL261細胞。將1ml生長狀態(tài)良好的GL261細胞(1×107/ml)接種于健康C57BL/6小鼠的腹腔。待小鼠腹部膨隆后，處死小鼠，置于75％乙醇浸泡2-3min消毒。在超凈臺中打開小鼠腹腔，可見形成的GL261細胞實體瘤(圖-12)。按無菌操作取出GL261細胞實體瘤組織。將其在取無菌平皿中用手術(shù)剪成組織小塊，用生理鹽水反復(fù)沖洗去除腫瘤組織和殘留的血液。將洗凈的組織塊在組織研磨器中反復(fù)研磨，收集研磨液。將研磨液置于液氮和室溫反復(fù)凍融5次。2000rmp離心10min后收集上清。此上清為GL261細胞膠質(zhì)瘤腫瘤細胞裂解物(GTL)。用Bradford法對GTL進行蛋白含量測定。用SDS-PAGE對GTL做進一步的分析(圖-12)。將CTL置-80℃冰箱保存。10.3GTL疫苗及含寡核苷酸GTL疫苗的制備用PBS將GTL的蛋白濃度調(diào)節(jié)為4mg/ml。將此GTL和ISA35乳化劑按1∶1(體積∶體積)混合制成疫苗，此疫苗被命名為GTL疫苗。在GTL疫苗中加入A1或A2配制的含A1或A2的GTL疫苗，這兩種疫苗分別被稱為GTL-A1疫苗和GTL-21-A2疫苗，其中A1和A2的濃度均為10μg/100μl。10.4小鼠免疫于第0天和第14天在小鼠小鼠前肢左右腋窩下分別注射100μlGTL疫苗或GTL-A1疫苗或GTL-21-A2疫苗。10.5接種膠質(zhì)瘤細胞在第21天，注射1×104GL261細胞到小鼠顱內(nèi)，注射體積為2μl，使小鼠發(fā)生膠質(zhì)瘤，方法如文獻(PrinsRM，etal.CancerRes.2003Dec1；63(23)：8487-91)所述。自接種腫瘤后開始觀察并記錄小鼠的生存期，在小鼠死亡后做尸解確認小鼠顱內(nèi)發(fā)生了膠質(zhì)瘤。10.6結(jié)果(見表-1)表-1、寡核苷酸(A1，A2)對膠質(zhì)瘤腫瘤細胞裂解物疫苗的增效作用結(jié)果表明，A1或A2可增強膠質(zhì)瘤腫瘤細胞裂解物(腫瘤抗原疫苗)的免疫效力(表-1)，是荷瘤小鼠的生存期延長(p＜0.05)。這說明，A1或A2可被用于個體來增強其對腫瘤抗原(疫苗)的免疫應(yīng)答而成為一種新型腫瘤疫苗的佐劑。實施例11、寡核苷酸(A1，A2)對肺癌細胞裂解物疫苗的增效作用：11.1材料11.1.1小鼠C57BL/6雄性小鼠(北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司)，6周齡。11.1.2Lewis肺癌細胞Lewis肺癌(Lewislungcarcinoma，LLC)細胞(源自美國ATCC)。在37℃，5％CO2的條件下培養(yǎng)。使用的培養(yǎng)基為含10％(v/v)滅活的胎牛血清，100IU青霉素/ml和100IU的鏈霉素/ml的IMDM培養(yǎng)基。11.1.3佐劑ISA35乳化劑(Seppic，Cedex，Paris，F(xiàn)rance)。11.1.4寡核苷酸寡核苷酸(A1)[5’ttctttgggctgtgccattccctaa3’(序列表<400>1)]和寡核苷酸(A2)[5’tttcatggaaaatattgagttaaaa3’(序列表<400>2]，如實施例1所述。11.2.Lewis肺癌細胞(LLC)細胞裂解物的制備將體外傳代培養(yǎng)的LLC細胞(1×106/0.1ml)接種于C57BL/6J雄性小鼠背部皮下長成實體腫瘤。犧牲小鼠，取出腫瘤，按實施例10所述的方法制備、鑒定和保存LLC細胞裂解物(LTL)。每100μlLTL由2×106LLC細胞制成。11.3LTL疫苗及含寡核苷酸LTL疫苗的制備將制備的GTL和ISA35乳化劑按1∶1(體積∶體積)混合制成疫苗，此疫苗被命名為LTL疫苗。在LTL疫苗中加入A1或A2配制的含A1或A2的LTL疫苗，這兩種疫苗分別被稱為LTL-A1疫苗和LTL-A2疫苗，其中A1和A2的濃度均為10μg/100μl。11.4小鼠免疫于第0天和第14天在6周齡C57BL/6J雄性小鼠，右側(cè)背部皮下注射100μlLTL疫苗或LTL-A1疫苗或LTL-A2疫苗。每組8只小鼠。11.5接種Lewis肺癌(LLC)細胞于第21天，小鼠左側(cè)背部皮下注射100μlLLC細胞懸液。LLC細胞懸液的制備方法是：將體外傳代培養(yǎng)的LLC細胞(1×107/100μl)接種于C57BL/6J雄性小鼠背部皮下長成實體腫瘤。犧牲小鼠，按無菌操作方法取出腫瘤組織，將其用0.25％胰蛋白酶-0.04％EDTA消化30min，制成單細胞懸液。在PBS中調(diào)細胞濃度為每1×106/100μl。在接種腫瘤后的第18天犧牲小鼠，剖出瘤塊，稱其重量。11.6結(jié)果(見表-2)表-2、寡核苷酸(A1，A2)對Lewis肺癌細胞裂解物疫苗的增效作用結(jié)果表明，A1或A2可增強肺癌腫瘤細胞裂解物(腫瘤抗原疫苗)的免疫效力(表-2)，使腫瘤縮小(p＜0.05)。這說明，A1或A2可被用于個體來增強其對腫瘤抗原(疫苗)的免疫應(yīng)答而成為一種新型腫瘤疫苗的佐劑。實施例12寡核苷酸(A1，A2)對黑色素瘤的治療作用：12.1材料12.1.1小鼠C57BL/6雌性小鼠(北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司)，18-22g。12.1.2B16細胞B16細胞是C57BL/6小鼠來源的黑色素瘤細胞(源自美國ATCC)。在37℃，5％CO2的條件下培養(yǎng)。使用的培養(yǎng)基為含10％胎牛血清，100IU青霉素/ml和100IU的鏈霉素/ml的RPMI1640培養(yǎng)基(GIBCO)。12.1.3寡核苷酸寡核苷酸(A1)[5’ttctttgggctgtgccattccctaa3’(序列表<400>1)]和寡核苷酸(A2)[5’tttcatggaaaatattgagttaaaa3’(序列表<400>2]，如實施例1所述。12.2主要實驗器材和儀器100ml細胞培養(yǎng)瓶、1ml注射器、細胞計數(shù)板。CO2細胞培養(yǎng)孵箱(日本SANYO公司)、細胞培養(yǎng)倒置顯微鏡(日本Olympus公司)、離心機(德國BiofugeFresco)。12.3實驗將體外培養(yǎng)的B16細胞于第0天接種于小鼠左后肢背側(cè)皮下，注射體積為200μl，其中含1X106B16細胞。于接種B16細胞后的第10天開始給小鼠注射A1，然后每個兩天再注射一次，共注射6次(圖-13)。注射部位為左后肢接種腫瘤淋巴結(jié)引流區(qū)皮下。每次的注射體積為100μl，其中含25μgA1。對照組小鼠按同樣的程序注射PBS。觀察并記錄小鼠的生存時間。12.4結(jié)果單獨應(yīng)用A1可在小鼠發(fā)揮抗黑色素瘤的作用(圖-13)，使荷瘤小鼠生存期延長。這說明，A1或A2可被用于個體來治療包括黑色素瘤在內(nèi)的腫瘤而成為一種新型的抗腫瘤制劑。當(dāng)前第1頁1 2 3 當(dāng)前第1頁1 2 3