專利名稱：腫瘤治療的配方，方法和靶目標(biāo)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的腫瘤和化療等領(lǐng)域。具體來(lái)說(shuō)，該發(fā)明 提供了新醫(yī)學(xué)應(yīng)用，藥物成分和藥物研發(fā)的靶目標(biāo)，已達(dá)到更有效，無(wú)毒的癌癥治療。發(fā)明的
背景技術(shù)：
到目前為止，化療和放射治療仍然是治療癌癥的主要方法。這些治療是著眼于殺 滅增殖的細(xì)胞，而不是癌細(xì)胞。所以這些治療方法對(duì)增殖的骨髓細(xì)胞和粘膜細(xì)胞又嚴(yán)重的 可以致命的副作用，，其副作用通常是致命的。盡管有關(guān)尋找協(xié)同作用以增加藥物的療效， 降低藥物劑量和替代療法以減少副作用的研究在積極進(jìn)行，目前仍然需要改進(jìn)腫瘤的治療 方法以提高癌癥的治療效果，同時(shí)限制對(duì)正常細(xì)胞毒副作用。本發(fā)明提出聯(lián)合應(yīng)用非細(xì)胞 毒性藥物以得到協(xié)同和選擇性導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡的治療方法。癌癥的靶向治療是新的一代的腫瘤治療方法，其特點(diǎn)是針對(duì)特定癌癥的分子信號(hào) 通路的變化設(shè)計(jì)和選用藥物，促使癌細(xì)胞死亡，但不影響正常細(xì)胞的存活。已經(jīng)和正在花費(fèi) 大量的努力以尋找可作為癌攻擊目標(biāo)的的靶目標(biāo)，和可攻擊細(xì)胞內(nèi)這些目標(biāo)的治療方法。 然而，到目前為止，這個(gè)新一代的成功率是有限的。一個(gè)主要的挑戰(zhàn)來(lái)自于細(xì)胞內(nèi)的調(diào)節(jié)機(jī) 制和途徑的重疊的復(fù)雜性。綜合治療是克服這些重疊的調(diào)控機(jī)制和途徑的關(guān)鍵。Nuclear factor-kappa B (NF_ κ B)是一個(gè) Rel 家族的轉(zhuǎn)錄因子。NF-κ B 的活性 功能涉及應(yīng)激反應(yīng)和多種細(xì)胞致病過(guò)程，如感染和炎癥，氧化應(yīng)激，受傷和程序性細(xì)胞死 亡。異常的NF-κ B的功能活性與多種腫瘤及癌細(xì)胞相關(guān)，并涉及細(xì)胞增殖，細(xì)胞凋亡，血 管生成，腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移等多種腫瘤細(xì)胞的生物過(guò)程之中。NF-K B的功能活性還與抗腫瘤 細(xì)胞對(duì)化療和放射療法治療的耐受性有關(guān)。(Kim HJ, Hawke N, and Baldwin AS, NF-κ B andIKK as therapeutic targets in cancer,Cell Death ad Differentiation, (2006)13 738-47 ；Karin Μ, Nuclear factor-κ B incancer development and progression, (2006) Natur441 :431_6)。人們?cè)囍ㄟ^(guò)抑制NF- κ B活性以增加癌細(xì)胞對(duì)化療藥物和放射治療 的敏感性以促進(jìn)癌細(xì)胞死亡。(Kim HJ，Hawke N, and Baldwin AS, NF-κ B and IKK as therapeutictargets in cancer, Cell Death and Differentiation, (2006)13:738-47; Karin M,Nuclear factor-kB in cancer developmentand progression,(2006)Natur441 431-6 ；Chikashi Nakanishi and Masakazu Toi, Nuclear Factor-κ B Inhibitors AsSensitizers To Anticancer Drugs, NATURE REVIEWS CANCER(2005) 5 :297_309)。然而， 這些努力的結(jié)果非常有限。通常在正常細(xì)胞中，NF-K B停留在細(xì)胞質(zhì)中以非活性形式結(jié)合與Inhibitor κ B (I κ B)。外部刺激可通過(guò)信號(hào)過(guò)程由I κ B磷酸激酶(IKK)磷酸化I κ B,使之 脫離NF- κ B從而活化NF- κ B,轉(zhuǎn)移入核，調(diào)節(jié)細(xì)胞NF- κ B調(diào)節(jié)的基因的轉(zhuǎn)錄，已知有兩個(gè) 類似的但不同的ΙΚΚ，分別作用于不同的信息傳導(dǎo)途徑，并活化不同的NF-κ B家族的成員。 此外，還有其他的激活NF- κ B的替代途徑，如蛋白激酶CK2 (CK2)。在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中，NF-κΒ處于持續(xù)激活。除了 IKK經(jīng)典途徑，還有異常的可激活NF-κ B的替代途徑。(Ming Yu, Jason Yeh, andCarter Van Waes Protein Kinase CK2 Mediates Inhibitor-Kappa B Kinase and Aberrant Nuclear Factor-κ B Activation bySerum Factor(s)in Head and Neck Squamous Carcinoma Cells Cancer Research,2006 July 1 ；66 (13) :6722_6731· andother for NFKB activation)。目前市場(chǎng)上已有幾十個(gè)IKK抑制劑，有的正在用于抗 炎疾病的臨床實(shí)驗(yàn)過(guò)程之中。然而這些抑制劑對(duì)腫瘤的治療并不那么有效。這些替代的 NF-k B活化途徑至少是這些IKK抑制劑對(duì)腫瘤細(xì)胞無(wú)效的原因。(Chikashi Nakanishi and Masakazu Toi,Nuclear Factor-κ B Inhibitors As Sensitizers To Anticancer Drugs, NATURE REVIEWS CANCER (2005) 5 抑制 297-309)。已知NF-κ B能夠抑制細(xì)胞程序性死亡，包括凋亡和壞死，通過(guò)誘導(dǎo)抗調(diào)亡基因的 轉(zhuǎn)錄，干擾caspase的活性和抑制延長(zhǎng)的c-Jun氨基末端激酶(JNK)的活性。(Chikashi Nakanishi and Masakazu Toi, NuclearFactor-κ B Inhibitors As Sensitizers To Anticancer Drugs, NATURE REVIEWS CANCER(2005) 5 :297—309)。抑制 NF-κ B 禾口 IKK 導(dǎo) 致腫瘤細(xì)胞死亡，生長(zhǎng)抑制和/或增加癌細(xì)胞對(duì)化療治療的敏感性，(Kim HJ, Hawke N， andBaldwin AS, NF- κ B and IKK as therapeutic targets in cancer, Cell Death and Differentiation, (2006) 13 738-47 ；Chikashi Nakanishi and Masakazu Toi, Nuclear Factor-κ B Inhibitors As Sensitizers To Anticancer Drugs,NATUREREVIEffS CANCER(2005) 5 :297_309)。Protesome 抑制劑 Bortezomib/Velcade (PS341)已被 FDA 批準(zhǔn) 用于治療多發(fā)性骨髓瘤等疾病。已有幾十個(gè)IKK抑制劑用于抑制NF-κ B的活性。(Michael Karin, Yumi Yamamoto and Q. May Wang, The IKK NF—KAPPAB System :A Treasure Stove for Drug Development, Nature RcviewslDrug Discovery3 :17-26, January, 2004)。他 們多數(shù)是針對(duì)炎癥性疾病的治療。有幾個(gè)IKK抑制劑在血液惡性病顯示效果。另一方面， 目前可用于臨床治療實(shí)體瘤的IKK抑制劑缺失。有一些可抑制NF-K B的抑制劑可在體外 有部分抑制細(xì)胞存活和增生的功能，及少量的報(bào)告可在體內(nèi)抑制腫瘤生長(zhǎng)。(Hu MC, and Hung MC,Role of IkappaB kinase intumorigenesis,(2005)Future Oncol. 1 :67_78 ；Luo JL, Kamata H, and Karin M, IKK/NF-kappaB signahng :balancinglife and death-a new approach to cancer therapy, (2005) J. Clin Invest 115 :2625_32)。然而，這些成功是非 常有限的。多數(shù)應(yīng)用IKK抑制劑作為腫瘤治療的的藥物都不太成功，且遠(yuǎn)離實(shí)際。這可能 是由于細(xì)胞調(diào)節(jié)機(jī)制的復(fù)雜性和從這些抑制劑的其他作用有關(guān)。確認(rèn)關(guān)鍵的可誘導(dǎo)腫瘤細(xì) 胞死亡的調(diào)節(jié)通路和聯(lián)合抑制多個(gè)不同的調(diào)節(jié)部位是成功的關(guān)鍵。腫瘤壞死因子TNFa可誘導(dǎo)活化NF-κ B。然而，在一定條件下，TNF α可誘導(dǎo)細(xì)胞 死亡。最近的研究指出，NF-kB和JNK之間的活性的平衡決定細(xì)胞生死的理論。根據(jù)這一 理論，NF- κ B與JNK通過(guò)活性氧(ROS)相互調(diào)解。TNF α誘導(dǎo)活化NF- κ B和JNK?；罨?NF- κ B和JNK均導(dǎo)致細(xì)胞增殖。然而，活性氧誘導(dǎo)JNK長(zhǎng)期持續(xù)的活化則會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞程序 性死亡。相反，活化的NF- κ B抑制活性氧，由此抑制JNK長(zhǎng)期持續(xù)的活化，導(dǎo)致細(xì)胞增殖。 因此，已知NF- κ B的活性，同時(shí)誘導(dǎo)活性氧的生成以活化JNK可將平衡程序性印象細(xì)胞死 亡-迄今為止，尚沒(méi)有這樣的治療方法的報(bào)告。最重要的是，雖然這種關(guān)系的具體理論已經(jīng) 提出，尚無(wú)成功運(yùn)用這一理論的示例。在此說(shuō)明與之相關(guān)的發(fā)明的詳情。應(yīng)用無(wú)磷酸酶活性的ΚΑ-ΙΚΚ1+ΚΑ-ΙΚΚ2聯(lián)合抑制IKKl和ΙΚΚ2的活性導(dǎo)致協(xié)同抑制NF-κΒ的活性。但是，這種組合對(duì)提高化療藥物的療效影響不大。進(jìn)一步的研究表明，當(dāng)使用WST-I試劑與IKK2抑制劑結(jié)合IKKl DNA載體轉(zhuǎn)染的綜合效應(yīng)可導(dǎo)致大量的細(xì)胞死 亡。而同一實(shí)驗(yàn)中未用DNA轉(zhuǎn)染沒(méi)有造成任何細(xì)胞死亡(

圖1，2)。在此，有三個(gè)治療所需 的重要成份轉(zhuǎn)染KA-IKKl，IKK抑制劑和WST-I聯(lián)合應(yīng)用。這一過(guò)程包括誘導(dǎo)活性氧和活 化JNK (圖5)，證實(shí)了上述的理論。進(jìn)一步的鑒定表明，這種效果與轉(zhuǎn)染的顯性負(fù)KA-IKKl的DNA沒(méi)有關(guān)系的。相反， 是轉(zhuǎn)染PUC19質(zhì)粒DNA序列隊(duì)此三項(xiàng)聯(lián)合治療起到了關(guān)鍵的作用(圖3)。這種組合中轉(zhuǎn) 染PUC19質(zhì)?？刹糠钟蓱?yīng)用干擾素替代(INF)，作為初始治療(圖4)使用。pUC19質(zhì)粒的 DNA序列在這三種藥物聯(lián)合治療方面發(fā)揮重要作用。根據(jù)相對(duì)人類基因組的BLAST，pUC19 的DNA序列分析表明pUC19的DNA序列可以短片段匹配于一些人的mRNA序列和許多人的基 因的側(cè)翼地區(qū)。由此設(shè)計(jì)的siRNAs和針對(duì)其中一些相關(guān)的基因設(shè)計(jì)的siRNA可代替pUC19 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染也可以用于這三種藥物聯(lián)合治療導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。細(xì)胞的增殖WST-I試劑是一種科研試劑用于測(cè)量細(xì)胞的代謝作為活細(xì)胞的指征， 用于測(cè)定村活的細(xì)胞數(shù)量的指標(biāo)使用。細(xì)胞的增殖WST-I是由WST-1，四唑鹽和1-mPMS，一 個(gè)電子耦合試劑(IEA)組成。WST-I是一種不能透過(guò)細(xì)胞質(zhì)膜的水溶性四唑鹽可以減少形 成水溶性的formazan。WST-I被跨膜電子轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的載體，1-methoxyPMS(mPMS)還原，在這 種情況下，NADH是細(xì)胞的還原劑(Berridge，Herst，andTan，Biotechnology Annual Review Vol. 2 127-52)。這一過(guò)程涉及 NADH-Oxidase(NOX)并產(chǎn)生活性氧(ROS)?；钚匝跏菨撛谟泻Φ模＜?xì)胞代謝產(chǎn)物，直接影響細(xì)胞功能?；钚匝跎纱嬖?于所有需氧生物，它是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路必不可少的一部分對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和氧化-還原狀態(tài) 中起重要作用。然而，過(guò)剩的高活性氧代謝的產(chǎn)生可以引起致命的連鎖反應(yīng)，涉及氧化和 破壞，是影響細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性和生存的關(guān)鍵。事實(shí)上，許多抗腫瘤藥物，如長(zhǎng)春，順鉬， 絲裂毒素 C，P可毒素，喜豐對(duì)喊，inostamycin, neocarzinostatin (vinblastine, cisplatin, mitomycin C，doxorubicin, camptothecin，inostamycin, neocarzinostatin)禾口其他許多 出抗腫瘤活性都依賴通過(guò)ROS至細(xì)胞凋亡的作用，這表明活性氧可作為潛在的抗腫瘤應(yīng)用 的一項(xiàng)基本的原則，用“氧化療法”作為個(gè)獨(dú)特的抗癌方法，通過(guò)誘導(dǎo)產(chǎn)生的活性氧直接作 為癌癥治療實(shí)體腫瘤細(xì)胞已被提出，但是沒(méi)有成功由于為缺乏對(duì)腫瘤選擇性的活性氧，從 而造成了嚴(yán)重的副作用(Fang, Nakamura, and Iyer, J Drug Target Voll5 :475_86)。大多數(shù)癌細(xì)胞的線粒體是有缺陷的，因此依賴于細(xì)胞質(zhì)中的酵解(glycolysis) 為其能源來(lái)源，這使得NADH積累在細(xì)胞質(zhì)中，使這些癌細(xì)胞更多的依賴跨質(zhì)膜電子運(yùn)輸 ((Herst et al.Biochim Biophys Acta 1656 79~87 ；Tan and Berridge Redox Rep 9: 302-06)。這種癌癥細(xì)胞的特殊功能可使之成為選擇性治療腫瘤細(xì)胞的治療方法。在WST-I和mPMS，各為一類化和物，可以用于這一治療方法。在WST-I和mPMS的濃 度以及兩者之間的比例，可以調(diào)整和優(yōu)化，以維持其協(xié)同誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，同時(shí)避免引發(fā)活性 氧的直接毒性，這一發(fā)現(xiàn)結(jié)合治療方法提供了一個(gè)可誘導(dǎo)低水平的活性氧生成的方法，一 個(gè)誘導(dǎo)ROS作為信號(hào)傳輸途徑和細(xì)胞信使的方法。誘導(dǎo)細(xì)胞死亡是聯(lián)合作用的結(jié)果。WST-I 作為一個(gè)試劑并無(wú)此作用。此發(fā)明找到了一種可誘導(dǎo)產(chǎn)生作為信息傳導(dǎo)的ROS同時(shí)避免產(chǎn) 生大量的具有細(xì)胞毒作用的活性氧。芹菜素(Apigenin)是天然植物黃酮(4‘，5，7，-trihydroxyf lavone)，常見(jiàn)于水果和蔬菜，其中包括蘋果，芹菜，香菜，洋蔥，柑桔，茶葉，甘菊，小麥苗和一些調(diào)味料。芹菜素已被證明具有顯著的抗炎，抗氧化，抗致癌特性，目前正在積極研究。芹菜素在細(xì)胞和分 子水平的研究發(fā)現(xiàn)，芹菜素干擾細(xì)胞內(nèi)廣泛的關(guān)鍵性的分子，信息和細(xì)胞調(diào)節(jié)途徑，包括消 耗的 HER2 蛋白質(zhì)和制止 Her2/Her3-phosphatidylinositide 3 激酶(PI3/AKT)的信息調(diào) 節(jié)途徑(Way and Lin Future Oncol 1 :841_49)，抑制 HIF，PKC, CDK, VEGF, NF-κ B, CK2, ΑΚΤ，ΜΑΡΚ, AR和ER的信息傳導(dǎo)和調(diào)節(jié)途徑，活化野生型的Ρ53蛋白，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期失控的 的檢查點(diǎn)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡((Induction of caspase-dependent, p53_mediated apoptosis by apigenin in human neuroblastoma__Torkin et al. 4 (1) 1__·· ；Apigenin Inhibits Expression of Vascular Endothelial Growth Factor and Angiogenesis in Human Lung CancerCells implication of. . ；Apigenin inhibits VEGF and HIF-I expression via PI3K/AKT/p70S6Kl and HDM2/p53pathways—Fang et al. The FASEB 19(3) 342__. . ；Ba1asubramanian and Eckert Toxicol Appl Pharmacol 224214~19 ；Birt et al. Carcinogenesis 7 959-63 ；Patel, Shukla, and Gupta Int J Oncol 30 233-45 ；Sato et al. Biochem BiophysRes Commun 204:578-84)。此外，芹菜素還可產(chǎn)生活性氧，破壞線 粒體膜的。目前的研究試驗(yàn)表明，它可以減少DNA氧化損傷，抑制白血病細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)這 些細(xì)胞分化，抑制腫瘤細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；作為抗炎行為，而且作為一個(gè)反痙攣 或解痙。已經(jīng)提交超過(guò)100項(xiàng)有關(guān)的芹菜素的專利申請(qǐng)。在這些專利中包括應(yīng)用芹菜素作 為治療炎癥和自身免疫性疾病的藥物。此外，還包括應(yīng)用芹菜素作為癌癥化學(xué)預(yù)防藥物的 使用和與細(xì)胞毒性化療藥物聯(lián)合應(yīng)用的協(xié)同其作用(美國(guó)專利20060189680)。多組研究人 員目前正在進(jìn)行關(guān)于芹菜素作為預(yù)防藥物和協(xié)同化療藥物腫瘤治療效果的研究，以此作為 增強(qiáng)化療的治療。不過(guò)，此協(xié)同作用非常有限。我的數(shù)據(jù)顯示，在體外應(yīng)用三個(gè)人腫瘤細(xì)胞 株(HT1080, Cal27和UM-SCC6)測(cè)定三種化療藥(紫杉醇，順鉬，阿霉素)聯(lián)合應(yīng)用30 μ M 芹菜素未見(jiàn)無(wú)明顯的協(xié)同效應(yīng)。也從我的數(shù)據(jù)，芹菜素單獨(dú)應(yīng)用100 μ M未見(jiàn)細(xì)胞毒性，只 有與其他藥物聯(lián)合應(yīng)用方可有協(xié)同作用。10-30 μ M芹菜素可代替PUC19質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和IKK抑制劑，與WST-Ir達(dá)到癌癥協(xié)同誘 導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡。這種作用是芹菜素和WST-Ir劑量和時(shí)間相關(guān)的，并可在多種人腫瘤細(xì)胞重復(fù)。芹菜素抑制CK2，它也通過(guò)抑制CK2進(jìn)而抑制IKK和NF-κ B。WST-1可誘導(dǎo)產(chǎn)活 性氧。這種組合治療的確顯示了活性氧的產(chǎn)生和JNK活化，ROS-JNK-NF- κ B相互關(guān)系的理 論，和JNK-NF-k B的平衡決定細(xì)胞生死。另一方面，測(cè)試兩個(gè)CK2抑制劑并沒(méi)有顯示這種 抑制作用。真對(duì)CK2的siRNA只呈弱的抑制作用。除了對(duì)人黑色素瘤細(xì)胞株的影響IKK抑 制劑并沒(méi)有顯示這種作用。如上所述，芹菜素可能影響更為關(guān)鍵的分子和信號(hào)通路。在這 個(gè)組合中芹菜素治療作用是獨(dú)一無(wú)二的。真正的機(jī)制可能比我們現(xiàn)在認(rèn)識(shí)到的更為復(fù)雜。通常情況下，電子轉(zhuǎn)移發(fā)生在線粒體膜。WST-I誘導(dǎo)劑，通過(guò)電子細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)移 產(chǎn)生的活性氧并將在細(xì)胞質(zhì)的NADH轉(zhuǎn)化為NAD+。由于大多數(shù)的癌細(xì)胞中線粒體能量代謝 有缺陷，更依賴于細(xì)胞質(zhì)中糖酵解，這將產(chǎn)生在細(xì)胞質(zhì)中NADH的，這種結(jié)合的治療方法提 供了一種潛在的特異發(fā)針對(duì)癌細(xì)胞的新的治療方法。WST-I試劑由WST-I和mPMS組成，也代表了各種四唑鹽類和電子耦合試劑分別不 同的組合。這種試劑能夠進(jìn)行跨質(zhì)膜電子轉(zhuǎn)移的過(guò)程，并可在此過(guò)程中產(chǎn)生活性氧。對(duì)這種治療的重要特征之一是可以通過(guò)優(yōu)化WST-I和mPMS的濃度和兩個(gè)組成部分的比例控制 活性氧產(chǎn)生的水平。它提供了有控制的從細(xì)胞內(nèi)生成ROS作為信息傳導(dǎo)分子，促使生成特 定的信號(hào)，導(dǎo)致程序性細(xì)胞死亡，而不是直接破壞細(xì)胞的方式。高水平的ROS損傷細(xì)胞中的各種大的調(diào)控分子，對(duì)于正常細(xì)胞可能是災(zāi)難性的。 此前應(yīng)用活性氧誘導(dǎo)劑作為癌癥治療的努力的失敗是因?yàn)檫@種高毒性。另一方面，低水平 活性氧可能是功能的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑的一個(gè)信使。另一方面，ROS可以為信號(hào)參與細(xì)胞內(nèi) 的信息調(diào)節(jié)系統(tǒng)。這一項(xiàng)發(fā)明可選擇性的誘導(dǎo)活性氧的生成，同時(shí)避免了大量的活性氧的 產(chǎn)生所致的細(xì)胞毒性。在WST-Ir試劑，WST-Ic和mPMS的濃度以及兩者之間的濃度比例， 已調(diào)整和優(yōu)化，以維持的協(xié)同誘導(dǎo)癌癥細(xì)胞死亡，同時(shí)避免了活性氧的直接毒性。誘導(dǎo)細(xì)胞 死亡是聯(lián)合治療的作用，而不是由WST-Ir試劑單獨(dú)所為。此外，這種治療方法包括采用脈沖式治療，這可進(jìn)一步限制任何長(zhǎng)期治療的潛在毒性。這項(xiàng)發(fā)明的意義包括 這一治療方法攻擊的是癌細(xì)胞的一種特有的和所依賴的主要代謝途徑和方式； 這種治療方法指明了一種在腫瘤細(xì)胞內(nèi)選擇性的和有控制的誘導(dǎo)產(chǎn)生活性氧作 為信息傳導(dǎo)的方式作為腫瘤治療的方法；·這一治療方法可持續(xù)誘導(dǎo)JNK的磷酸化和激活從而誘導(dǎo)細(xì)胞壞死。 此說(shuō)明中所用的每一個(gè)抑制劑或試劑化學(xué)物質(zhì)，如WST，均代表了 一類化合物。這 次相關(guān)的化合物類別中的其他一些成員用于這種聯(lián)合治療的治療潛力也也作了研究。整個(gè) 的治療方法是新的，其所示高癌細(xì)胞死亡的結(jié)果，并有選擇地針對(duì)癌細(xì)胞的潛能，此治療的 每一個(gè)步奏和每一個(gè)成分均可成為新的“癌癥”治療的方法，攻擊目標(biāo)與途徑。例如，WST-I 是以前一種試劑。現(xiàn)在，它被認(rèn)為是治療癌癥的藥。在此之前，WST-I從未被用作癌癥治療；·本發(fā)明為抗癌藥物開(kāi)發(fā)提供了新的渠道。此說(shuō)明敘述了同時(shí)抑制兩個(gè)IKKl和IKK2導(dǎo)致協(xié)同抑制腫瘤細(xì)胞中持續(xù)地NF- κ B 在固有活性的證據(jù)，和在抑制NF-κ B火星后加用四唑鹽WST-I后協(xié)同促進(jìn)癌細(xì)胞死亡的證 據(jù)。這兩個(gè)發(fā)現(xiàn)的結(jié)合和WST-I的應(yīng)用提供了一種新的，有效的癌癥治療藥物開(kāi)發(fā)的新途 徑并將對(duì)此有深遠(yuǎn)的影響。除NF-κ B外，，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(Signal transducer and activator of transcription, Stat)是另一個(gè)信息調(diào)節(jié)的家族，將細(xì)胞外信號(hào)的刺激移位到細(xì)胞核內(nèi)，起 著中介細(xì)胞因子和生長(zhǎng)激素對(duì)基因轉(zhuǎn)爐的調(diào)節(jié)。這些蛋白質(zhì)調(diào)解細(xì)胞對(duì)各種刺激的反應(yīng)導(dǎo) 致一系列不同的基因表達(dá)，從而存在于許多細(xì)胞調(diào)解過(guò)程中，如細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡，起到至 關(guān)重要的關(guān)鍵作用。STAT，如STAT3在腫瘤細(xì)胞的存活和增殖能力中發(fā)揮重要作用。然而， 單獨(dú)應(yīng)用STAT抑制劑或IKK抑制劑對(duì)癌癥細(xì)胞的存活無(wú)明顯抑制作用。有證據(jù)表明，這兩 個(gè)轉(zhuǎn)錄因子可相互影響和相互功能合作。其轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子結(jié)合位點(diǎn)連接在一起，形成模塊。此外，聯(lián)合應(yīng)用Stattic，一個(gè)STAT3抑制劑和IKK抑制劑或芹菜素可以得到協(xié)同誘導(dǎo)腫瘤細(xì) 胞死亡的結(jié)果。這種聯(lián)合抑制提供了一種治療癌癥的方法。發(fā)現(xiàn)一些DNA和SiRNA序列及其相應(yīng)的基因作為癌癥治療的潛在靶目標(biāo)。如上所述，轉(zhuǎn)染pUC19質(zhì)粒對(duì)于三線聯(lián)合治療的必要性。轉(zhuǎn)染PUC19質(zhì)粒與化療 藥物聯(lián)合應(yīng)用可有效性的減少所有四個(gè)測(cè)試過(guò)的化療藥物(paclictaxel，Doxourubicin,順鉬和5氟尿嘧啶)的IC50，使之降低3-30倍。根據(jù)pUC19質(zhì)粒DNA序列設(shè)計(jì)的siRNA和 針對(duì)其中一些相應(yīng)的基因序列的siRNA可替換pUC19質(zhì)粒與化療藥物合用。由此發(fā)現(xiàn)的這 些基因是尚很少研究的基因。其中一些仍然是假設(shè)基因，這意味著他們還沒(méi)有被研究。這 些基因的發(fā)現(xiàn)可能提供抗癌藥物開(kāi)發(fā)潛在攻擊目標(biāo)的。本發(fā)明的原始的基本發(fā)現(xiàn)包括WST-I作為抗癌藥用于抗腫瘤的聯(lián)合治療，和從 PUC19質(zhì)粒DNA序列所包含的生物功能，并由此引伸而出的發(fā)現(xiàn)可作為治療癌癥特異識(shí)別 并增加聯(lián)合治療和化療的療效的的靶目標(biāo)基因?；谶@些發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明描述了聯(lián)合應(yīng)用這 些化合物和生物分子，以及化療藥物的一些癌癥的治療方法。上述所致的化合物包括水溶 性四唑鹽，電子中間受體以及兩者的結(jié)合，作為治療癌癥的藥物組合，使用及治療方法以及 其他用于癌癥治療的化學(xué)成分，提取物，抑制劑和生物分子的藥物組合。為便于理解其相互 關(guān)系，可參考示意圖。
發(fā)明概要本發(fā)明提供了藥物成分和組合構(gòu)成和組合治療癌癥的方法和可用于治療癌癥的 癌細(xì) 胞的靶目標(biāo)，以用于治療在哺乳動(dòng)物的癌癥達(dá)到協(xié)同的治療效果以及較少或沒(méi)有毒性 副作用。本發(fā)明的一個(gè)體現(xiàn)，本發(fā)明提供了 WST-Ir的藥用成分和可用于聯(lián)合的治療的可 進(jìn)行跨細(xì)胞質(zhì)膜電子轉(zhuǎn)移和誘導(dǎo)活性氧生成WST-Ir的任何有效的替代品，。在WST-Ir和 WST-Ir任何有效的替代品是一種四唑鹽和電子耦合試劑(IEA)的混合物，或者至少一個(gè)四 唑鹽或至少一個(gè)IEA。該化合物于藥學(xué)上可接受的藥用載體。本發(fā)明中的一項(xiàng)提供了基因，分子，和核苷酸序列和多肽序列，作為設(shè)計(jì)癌癥患者 的治療需要的抗藥物的靶目標(biāo)。這些目標(biāo)包括根據(jù)PUC19DNA序列中可映射到人類基因組 的DNA序列的短小片斷相應(yīng)的多核苷酸序列，蛋白/多肽分子和/或基因組。這些相應(yīng)的 編碼分子可能成為提高癌癥的治療效果的靶目標(biāo)。其他序列也可作為攻擊這些靶目標(biāo)的 藥物用于癌癥的治療。潛在的藥物包括但不限于siRNA，小分子抑制劑，多肽抑制劑，反義 RNA，反義寡核苷酸，抗體，抗體片段，蛋白質(zhì)，DNA的載體顯性負(fù)和干擾素(干擾素)。具體 講，這些目標(biāo)包括，但不僅限于，核苷酸序列TRPC6 (SEQ ID NO :2)，MAGI-3 (SEQ ID NO 4), TMEM182 (SEQ IDNO 5)，SH3PXD2B (SEQ ID NO 3), or c60rfl08(SEQ ID N0:14)，，和多肽 序列 TRPC6 (SEQ ID NO 6)，MAGI-3 (SEQ ID NO 8)，TMEM182 (SEQ ID NO 9)，SH3PXD2B (SEQ ID NO :7),or c60rfl08(SEQ ID NO 15). 0可用于攻擊這些人類基因組目標(biāo)基因的序列包 括，但不僅限于，pUC19 質(zhì)粒 DNA 載體 vector (SEQ ID NO 1), siRNA2(SEQ ID NO :10，SEQ ID NO 11, SEQ ID N0:12).。針對(duì)這些目標(biāo)基因合成的 siRNA(SEQID NO 2 to 5 andSEQ ID NO 14)是為了證明這些基因可作為癌癥綜合治療的目標(biāo)基因。本發(fā)明還提供了一種治療癌癥病人方法，包括同時(shí)或相繼應(yīng)用，(1)至少轉(zhuǎn)染 PUC19質(zhì)粒或應(yīng)用至少一個(gè)pUC19DNA轉(zhuǎn)染的有效替代品；(2)至少有一個(gè)IKK抑制劑；及 (3)第三個(gè)藥物，WST-Ir或至少一個(gè)WST-Ir的有效替代品，于藥學(xué)上可接受的載體媒介。 此聯(lián)合增強(qiáng)了誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡的作用，而這些藥物大度應(yīng)用則無(wú)任何單獨(dú)的治療效應(yīng)而且 不具有毒性。pUC19質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染的有效替代品選自(I)I型干擾素，(2)合成siRNA的核苷酸序歹丨J 序列號(hào)NO 10-12 (SEQ ID NO :10_12)，其DNA序列映射到pUC19質(zhì)粒DNA序列和 人類轉(zhuǎn)錄和基因組DNA序列；(3)生物的化合物，生物和非生物的有機(jī)，或無(wú)機(jī)化合物。上 述化合物的篩選方法中的生物分子進(jìn)一步選自可與下述基因的多核苷酸序TRPC6(SEQ ID NO 2)，MAGI-3 (SEQ ID NO 4)，TMEM182 (SEQ ID NO 5)，SH3PX D2B (SEQ ID NO 3)，or c60rfl08(SEQ ID NO 14)，和其相應(yīng)的氨基酸序列TRPC6 (SEQ ID NO :6)，MAGI-3 (SEQ ID NO 8), ΤΜΕΜ182(SEQ ID NO :9)，SH3PXD2B(SEQ ID NO :7)，or c60rfl08(SEQ ID NO 15) 相互作用以干擾其功能的多肽，蛋白質(zhì)，多肽，抗體，抗體片段，針對(duì)這些目標(biāo)基因合成的 siRNA, (SEQ IDNO 2 to 5 and SEQ ID NO 14)是為說(shuō)明這些基因可作為癌癥聯(lián)合治療的 攻擊目標(biāo)。本發(fā)明提供了誘導(dǎo)惡性的癌細(xì)胞程序性細(xì)胞死亡的方法和一個(gè)聯(lián)合治療癌癥病 人的方法。本發(fā)明的聯(lián)合治療方法包括應(yīng)用有效劑量WST-Ir或任何有效的替代品，即能進(jìn) 行跨細(xì)胞質(zhì)膜電子轉(zhuǎn)移并誘導(dǎo)活性氧生成的替代品，芹菜素，一個(gè)可抑制NF-κ B活性和其 他分子和/或信號(hào)途徑多功能抑制劑，或者至少一個(gè)IKK抑制劑。上述綜合治療可提高芹 菜素抗腫瘤作用，協(xié)同加強(qiáng)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡。本說(shuō)明的另一部分提供了一個(gè)為腫瘤病人治療腫瘤的方法。此方法同時(shí)或相繼應(yīng) 用至少一個(gè)治療有效量的GSK3 β抑制劑，一個(gè)蛋白激酶CK2抑制劑和第三個(gè)試劑，WST-lr。 更具體化，至少一個(gè)治療有效量的GSK3 β抑制劑式LIC1，至少一個(gè)蛋白激酶CK2抑制劑 是芹菜素(Apigenin)。該化合物可溶于藥學(xué)上可接受的載體或介質(zhì)。這種結(jié)合增強(qiáng)了其誘 導(dǎo)癌細(xì)胞死亡的作用，否則，單獨(dú)應(yīng)用則不具有毒 性。本發(fā)明的另一部分提供了一個(gè)為需要的病人治療腫瘤的方法包括同時(shí)或相繼聯(lián) 合應(yīng)用，轉(zhuǎn)染PUC19質(zhì)粒，或者至少一個(gè)pUC19質(zhì)粒的有效的替代品，和至少一個(gè)常規(guī)的的 化療藥物。在此所述的轉(zhuǎn)染PUC19質(zhì)?；蜃钌僖粋€(gè)PUC19質(zhì)粒的有效替代品可大幅度提高 化療藥物的作用，并大大減少化療藥物毒副作用。本發(fā)明的另一部分，提供了一個(gè)協(xié)同抑制NF-K B在腫瘤細(xì)胞或病人中的活性方 法。此方法包括同時(shí)或相繼轉(zhuǎn)染至少一個(gè)顯性負(fù)激酶死亡IKKl DNA載體(IKKl-KA)和至少 一個(gè)顯性負(fù)激酶死亡ΙΚΚ2 DNA載體(ΙΚΚ2-ΚΑ)。上述至少一個(gè)顯性負(fù)激酶死亡IKKl DNA 載體(IKKl-KA)和至少一個(gè)顯性負(fù)激酶死亡IKK2DNA載體(ΙΚΚ2-ΚΑ)?？捎蠭KK抑制劑取 代。IKK抑制劑。該化合物可于藥學(xué)上可接受的載體或介質(zhì)中。加用WST-Ir或WST-Ir的 有效替代物可進(jìn)一步提高增加這種組合的抑制作用，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了一種誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡，治療腫瘤病人的方法，包括 聯(lián)合應(yīng)用有效劑量的至少一種能夠抑制NF- κ B抑制劑，和有效劑量的能夠抑制STAT3的抑 制劑于藥學(xué)上可接受的載體或介質(zhì)。具體來(lái)講，能夠抑制NF- κ B抑制劑包括IKK抑制劑或 CK2的抑制劑。和有效劑量的能夠抑制STAT3的抑制劑包括stattic。該化合物可于藥學(xué) 上可接受的載體或介質(zhì)。上述聯(lián)合應(yīng)用IKK抑制劑或芹菜和STAT3的抑制劑，stattic治療癌癥，其最實(shí)用 的腫瘤包括頭頸部鱗狀細(xì)胞癌亞型。簡(jiǎn)要圖解圖1。內(nèi)源性NF- κ B的下游基因的表達(dá)水平。UM_SCC_6細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染圖中所示 pCDNA(陰性對(duì)照)禾口 IKK1-KA，IKK ·-KA and IKKl-KA and IKK ·-KA IKKl 質(zhì)粒。I ·Β ·，PlOO(A) and CK2 ·⑶的mRNA水平為其值與18sRNA的比值的校正值。數(shù)據(jù)表明，單純抑制IKK對(duì)NF- κ B的活性有很少或沒(méi)有影響。同時(shí)抑制兩個(gè)IKKs可以抑制協(xié)同抑制因子-κ B 的活性。圖2。IKK-KA轉(zhuǎn)染和應(yīng)用WST-Ir對(duì)腫瘤細(xì)胞存活的影響。細(xì)胞按圖1描述治療后 用WST-Ir治療4個(gè)小時(shí)。24小時(shí)后用CCK8試劑盒測(cè)定細(xì)胞存活。A 由CCK8試劑和定量 測(cè)定的細(xì)胞存活；B 質(zhì)粒，細(xì)胞圖像顯示細(xì)胞ΙΚΚ1-ΚΑ+ΙΚΚ2-ΚΑ IKKl共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞死亡。圖3。IKK抑制劑IKKl-KA轉(zhuǎn)染和WST-Ir聯(lián)合治療對(duì)細(xì)胞存活的影響。A :ΙΚΚ Inhibitor III，B :IKK InhibitorII, C :SC_514 ；D 細(xì)胞圖像，E :CCK8 試劑測(cè)定的 IKK inhibitor III對(duì)細(xì)胞存活的影響F :CCK8試劑測(cè)定的IKKinhibitor VII對(duì)細(xì)胞存活的影 響圖 4HT1080 細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染 pUC19， pCDNA3, IKK1-KA， IKK-1KA+PUC19，或 pCDNA3+pUC19 DNA質(zhì)粒，繼之用3，10，or 30 · MIKK抑制劑III治療，然后再經(jīng)WST-lr治 療。治療后24，48和96小時(shí)分別測(cè)定細(xì)胞成活。上圖應(yīng)用線性的IKK抑制劑III濃度，下 圖為 IKK 抑制劑 III 的對(duì)數(shù)濃度。標(biāo)記:P3 :pCDNA3，p9 :pUC19，IKKl-KA :IKK1_K44A 無(wú)磷 酸激酶活性的IKKl在pCDNA3載體，GS =WST-Ir, 1-3 =IKK抑制劑III。在治療后96小時(shí)， 經(jīng)任何一個(gè)上述的DNA至里轉(zhuǎn)染的，并應(yīng)用30IKK抑制劑III和WST-Ir治療的細(xì)胞的永久 死亡。經(jīng)WST-Ir治療但未經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞在治療后96小時(shí)完全恢復(fù)生長(zhǎng)。經(jīng)DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染， 但沒(méi)有應(yīng)用WST-Ir的細(xì)胞型治療96小時(shí)后部分恢復(fù)生長(zhǎng)。圖5WST-lr誘導(dǎo)活性氧產(chǎn)生。HT1080細(xì)胞分別經(jīng)途中標(biāo)記的方法治療A 細(xì)胞首 先用CM-H2-DCFDA標(biāo)記，然后用WST-Ir治療30分鐘；B 細(xì)胞首先用WST-Ir治療4小時(shí)， 然后用CM-H2-DCFDA標(biāo)記。所有A和B中竟WST-Ir治療過(guò)的細(xì)胞均表現(xiàn)出較強(qiáng)的熒光，表 明WST-Ir誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS染色標(biāo)記。令人驚訝的是，轉(zhuǎn)染DNA質(zhì)粒和應(yīng)用IKK抑制劑III也 誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS。A中IKK抑制劑III單獨(dú)應(yīng)用表現(xiàn)出產(chǎn)生其劑量依賴性增加的活性氧，但在 B無(wú)此作用。由此說(shuō)明是說(shuō)活性氧產(chǎn)生的時(shí)間過(guò)程中不同。DNA轉(zhuǎn)染增加IKK抑制劑III 誘發(fā)活性氧(A)的生成。只有這三項(xiàng)治療結(jié)合方促進(jìn)細(xì)胞死亡。每一個(gè)試劑和不同的組 合都可能涉及不同的調(diào)控機(jī)制，但只有三個(gè)試劑結(jié)合可導(dǎo)致細(xì)胞死亡。(標(biāo)記I-3 = IKK inhibitor III，P9 = pUC19 DNAtransfection, GS = WST-lr)圖6UM-SCC-6應(yīng)用LiCl和芹菜素聯(lián)合治療并加用(左圖)或未用(右圖)WST-Ir 的治療。數(shù)據(jù)表明，氯化鋰的he芹菜素聯(lián)合應(yīng)用有協(xié)同作用。圖7DNA轉(zhuǎn)染增強(qiáng)化療藥物療效的影響。.UM-SCC-6細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染pUC19， pCDNA3,pCDNA3+pUC19，pIKKl_KA+pUC19，pIKK2_KA+pUC19DNA，pIKKl_KA+pIKK2_KA+pUC19， pIKKl-KA，pIKK2-KA，pIKKl-KA+pIKK2-KA質(zhì)粒。同時(shí)，無(wú)DNA的載體為陰性對(duì)照，二甲基亞 砜(DMSO)為溶劑對(duì)照。細(xì)胞存活率CCK8試劑測(cè)定。吸收峰450nm，背景糾正690nm。A: UM-SCC-6細(xì)胞應(yīng)用5氟尿嘧啶治療，B :UM-SCC-6細(xì)胞應(yīng)用順鉬治療。DNA轉(zhuǎn)染協(xié)同加強(qiáng)化療藥物的療效作用，促進(jìn)癌細(xì)胞死亡。HT1080細(xì) 胞如圖中標(biāo)記，分別轉(zhuǎn)染 pUC19，pCDNA3, pCDNA3+pUC19，pIKKl_KA+pUC19， pIKK2-KA+pUC19DNA, ρIKK1-KA+pIKK2-KA+pUC19, pIKKl_KA+pCDNA3， pIKK2_KA+pCDNA3， pIKKl-KA+pIKK2-KA+pCDNA3質(zhì)粒?；熕幬镌谥委焺┝咳鐖D中所示A 順鉬Cis-Platinum 治療72小時(shí)和24小時(shí)，治療后(96小時(shí))，B 紫杉醇paclitaxel治療治療72小時(shí)和24小時(shí)，治療后(96小時(shí))，C :5-FU治療96小時(shí)后，D 阿霉素Doxorubicin治療72小時(shí)后·。 數(shù)據(jù)顯示，轉(zhuǎn)染協(xié)同化療藥物抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。未經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞化療藥物治療后細(xì)胞 恢復(fù)生長(zhǎng)，經(jīng)DNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞不能恢復(fù)，而永久的死亡(A和B)，這表明DNA的轉(zhuǎn)染促進(jìn)不可 逆轉(zhuǎn)的細(xì)胞死亡。與其他DNA質(zhì)粒相比，pUC19中顯示了最強(qiáng)的對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制效應(yīng)，和 促使細(xì)胞死亡的作用。圖 8HT1080 細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染 IKK1-KA，IKK2-KA and IKK1-KA+IKK2-KA，并結(jié)合轉(zhuǎn)染 PUC19或pcDNA3質(zhì)粒。pUC19質(zhì)粒和pcDNA3作為單獨(dú)轉(zhuǎn)染作為對(duì)照。I κ B α和IL_8mRNA 水平測(cè)定作為衡量的NF- κ B的轉(zhuǎn)錄活性指標(biāo)。數(shù)據(jù)用相應(yīng)的ISsRNA水平矯正。圖9圖示，芹菜素和WST-Ir聯(lián)合治療協(xié)同加強(qiáng)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡。FlB影響芹菜 素和WST-Ir應(yīng)用先后順序?qū)φT導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡的影響。圖10圖示示芹菜素和WST-Ir應(yīng)用先后順序?qū)?xì)胞存活的影響圖11圖示芹菜素和WST-Ir聯(lián)合治療中WST-IR的是進(jìn)過(guò)程和WST-IR和芹菜素的 劑量反應(yīng)關(guān)系圖12圖示IKK抑制劑和WST-Ir聯(lián)合應(yīng)用治療黑色素瘤細(xì)胞。
圖13圖示IKK抑制劑和WST-Ir聯(lián)合應(yīng)用治療秩序?qū)φT導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響圖14圖示芹菜素和WST-Ir聯(lián)合治療誘導(dǎo)的JNK活化圖 15WST-lr，CCK8 和芹菜素(apigenin)或 IKK inhibitor III 聯(lián)合作用產(chǎn)生活 性氧的的時(shí)間過(guò)程圖 16 圖示比較 CCK8, XTT and WST-Ir 的能力圖17圖示比較其他水溶性四唑鹽在聯(lián)合治療中誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的能力圖18圖示HT1080 :mPMS至細(xì)胞死亡的劑量反映關(guān)系圖19圖示比較不同細(xì)胞對(duì)mPMS治療的反應(yīng)圖20圖示W(wǎng)ST-3和WST_3+mPMS替代的WST-Ir與芹菜素聯(lián)合治療誘導(dǎo)細(xì)胞死亡 的作用圖21圖示根據(jù)pUC19DNA序列設(shè)計(jì)的siRNA增強(qiáng)紫杉醇療效圖 22 圖示用針對(duì) TMEM182 和 MAGI3 的 siRNA 替代 pUC19IKK Inhbitor-ffST-lr 三 項(xiàng)聯(lián)合治療的作用圖23圖示聯(lián)合應(yīng)用WST-Ir，CCK8和芹菜素apigenin或IKK抑制劑III誘導(dǎo)活性 氧生成的劑量反應(yīng)關(guān)系圖24圖示已知干擾素的效果通常在涉及轉(zhuǎn)染造成的影響，這個(gè)實(shí)驗(yàn)是要檢查DNA 轉(zhuǎn)染的作用可以由干擾素替代。HT1080細(xì)胞分別應(yīng)用圖中所示不同劑量的不同的干擾素治 療以及無(wú)治療的陰性對(duì)照和PUC19DNA轉(zhuǎn)染的陽(yáng)性對(duì)照。圖示為WST-Ir治療后24和48小 時(shí)細(xì)胞存活，分別應(yīng)用線性和對(duì)數(shù)的IKK抑制劑III濃度和干擾素(INF)治療劑量為變量 表示。共測(cè)定 14 個(gè) INF 包括IFNaA, IFNa B, IFNa C, IFNaD, IFNa F, IFNaG, IFNa H, IFNa I，IFNa J, IFN a K，IFNa 4b, IFNaffA, IFN^，IFN Y，禾口 IL—6。與 pUC19 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染陽(yáng) 性對(duì)照(圖24)比較。所有被側(cè)定的INF均顯示部分促進(jìn)作用(50-80% )。專利詳細(xì)說(shuō)明1?？偸隹拱┋熜У奶岣撸赏ㄟ^(guò)聯(lián)合應(yīng)用適當(dāng)選定的化合物，生物分子和藥物協(xié)同組合以達(dá)到誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡效果。在此介紹幾個(gè)藥物組合的成分和治療癌癥的方法和應(yīng)用。這 些治療癌癥的藥品成分及其應(yīng)用的發(fā)現(xiàn)基于以下的兩個(gè)基本發(fā)現(xiàn)(I)WST-Ir作為藥物與 apigenin, IKK抑制劑或pUC19質(zhì)粒DNA導(dǎo)入或任何有效的替代品聯(lián)合應(yīng)用可協(xié)同誘導(dǎo)細(xì) 胞死亡，(2)pUC19以及根據(jù)其DNA序列設(shè)計(jì)的siRNA具有抗癌癥的作用，以及由此發(fā)現(xiàn)的 相應(yīng)的可作為抗癌藥物靶目標(biāo)的基因。上述的第一個(gè)發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)一類新的化和物可用作為治療癌癥的組合藥 物成分。第二個(gè)發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步導(dǎo)致作為抗癌藥物開(kāi)發(fā)的一些靶目標(biāo)基因的發(fā)現(xiàn)。這些基因都 是目前尚很少研究的基因，其中有些仍是假設(shè)基因。這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步導(dǎo)致以下幾個(gè)癌癥治 療組合成分和治療方法的建立。WST-Ir作為腫瘤聯(lián)合治療的一個(gè)主要成分的說(shuō)明，對(duì)于與WST-Ir相應(yīng)的一類化合物及其替代物，以及與其形成的聯(lián)合應(yīng)用的配方 為治療癌癥的組合使用的說(shuō)明。pUC19質(zhì)粒DNA載體對(duì)哺乳動(dòng)物和人類癌細(xì)胞的生物效應(yīng)，以及其作為藥用成分 與IKK抑制劑和WST-Ir聯(lián)合用藥作為癌癥治療的方法的說(shuō)明。pUC19質(zhì)粒還可與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用提高癌癥細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。 根據(jù)pUC19質(zhì)粒DNA載體的核苷酸序列設(shè)計(jì)的siRNA (siRNA#l，siRNA#2，siRNA#3) 以及其作為藥物用于癌癥聯(lián)合治療的方法的說(shuō)明。同樣根據(jù)pUC19質(zhì)粒DNA載體的核苷酸序列以及其生物功能的分析而發(fā)現(xiàn)的 與癌癥治療有關(guān)的基因(TRPC6(序列號(hào)2)，MAGI-3(序列號(hào)4)，TMEM182(序列號(hào)5)， SH3PXD2B(序列號(hào)3)，or c60rfl08(序列號(hào)14)的核苷酸序列，和多肽序列TRPC6 (序列 號(hào)6)，MAGI-3 (序列號(hào)8)，TMEM182 (序列號(hào)9)，SH3PXD2B (序列號(hào)7)，or c60rf 108 (序 列號(hào)15)的多肽序列，作為抗癌藥物靶目標(biāo)的基因的說(shuō)明和相關(guān)siRNA的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。關(guān)于pUC19生物的和非生物的替代物及其與IKK抑制劑和WST-Ir及其替代物聯(lián) 合應(yīng)用對(duì)于治療了癌癥的作用的說(shuō)明。PUC19的替代物包括各種干擾素和上述的siRNAs。關(guān)于芹菜素(apigenin)，或IKK抑制劑和WST-Ir聯(lián)合應(yīng)用作為癌癥治療的說(shuō)明。關(guān)于芹菜素，CK2抑制劑與GSK3 β抑制劑，LiCl，聯(lián)合應(yīng)用作為癌癥治療的說(shuō)明以 及WST-Ir對(duì)此治療的增強(qiáng)作用。定義術(shù)語(yǔ)“pUC19質(zhì)粒DNA”代表的是DNA克隆載體(序列號(hào)1)在原核細(xì)胞中復(fù)制。 這個(gè)載體的DNA序列首先由J. Messing，Waksman Institute, NJ提交與NCBI基因庫(kù)on 3-MAR-1986 and revised by F. Pfeiffer on 16-DEC-1986。在此文中，pUC19 質(zhì)粒已被用 作抗癌治療藥物用于轉(zhuǎn)染人類癌癥細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，PUC19質(zhì)粒的DNA序列的在體外培養(yǎng)的人癌細(xì)胞具有生物效應(yīng)導(dǎo) 致細(xì)胞死亡，當(dāng)與其他成分聯(lián)合應(yīng)用時(shí)刻具有引導(dǎo)癌癥細(xì)胞死亡的協(xié)同效應(yīng)。DNA序列分析 表明pUC19質(zhì)粒的DNA序列可以短片段匹配于許多人類的mRNA以及人類基因組和轉(zhuǎn)錄側(cè) 翼序列位置周邊的調(diào)節(jié)序列匹配。PUC19質(zhì)粒在此代表短DNA序列，通常是15-100核苷酸 序列可匹配到人類的mRNA和/或人類基因組DNA序列的基因側(cè)翼區(qū)基地并與之結(jié)合。因 此，相應(yīng)的基因產(chǎn)物可為PUC19質(zhì)粒的靶目標(biāo)。由此產(chǎn)生的與這些基因相關(guān)的多聚核苷酸 序列，包括但不限于根據(jù)PUC19質(zhì)粒以及相應(yīng)的基因的序列設(shè)計(jì)的siRNA，miRNA, shRNA,氨基酸序列，多肽抑制劑，以及針對(duì)這些基因產(chǎn)物的抗體及小分子抑制劑等可影響干擾和抑制這些基因表達(dá)水平及其相應(yīng)基因產(chǎn)物蛋白質(zhì)的功能活性從而可取代PUC19質(zhì)粒作為 PUC19質(zhì)粒的的替代物用于癌癥的治療。匹配的DNA序列并沒(méi)有必要被完全匹配。根據(jù)一 般規(guī)律siRNA與匹配的DNA序列上可以略有不同，允許10%，20%，甚至高達(dá)30-40%的變 異。這些siRNA，miRNA，shRNA的核苷酸序列可以有部分(10%，20%，直到30-40% )變異。術(shù)語(yǔ)“pcDNA3m的DNA”是真核表達(dá)載體3. 1版的修訂[序列號(hào)13]來(lái)自 Invitrogen公司，但目前已停止生產(chǎn)和銷售這個(gè)載體。這個(gè)載體的DNA序列最初來(lái)源于 PUC19質(zhì)粒并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步的修改，。質(zhì)粒借助化學(xué)或脂質(zhì)體DNA轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染到了 人類癌細(xì)胞。PCDNA3的作用與pUC19相似，可與其他聯(lián)合治療成分和用起到誘導(dǎo)體外培養(yǎng) 的人癌細(xì)胞死亡的生物效應(yīng)，以及導(dǎo)致細(xì)胞死亡的協(xié)同作用。DNA序列分析表明pcDNA3的 DNA序列可以短片段匹配于許多人類的mRNA以及人類基因組和轉(zhuǎn)錄側(cè)翼序列位置周邊的 調(diào)節(jié)序列匹配。PCDNA3在此代表短DNA序列，通常是15-100核苷酸序列可匹配到人類的 mRNA和/或人類基因組DNA序列的基因側(cè)翼區(qū)基地并與之結(jié)合。因此，相應(yīng)的基因產(chǎn)物可 為PUC19質(zhì)粒的靶目標(biāo)。由此產(chǎn)生的與這些基因相關(guān)的多聚核苷酸序列，包括但不限于根 據(jù)PUC19質(zhì)粒以及相應(yīng)的基因的序列設(shè)計(jì)的siRNA，miRNA, shRNA，氨基酸序列，多肽抑制 齊U，以及針對(duì)這些基因產(chǎn)物的抗體及小分子抑制劑等可影響干擾和抑制這些基因表達(dá)水平 及其相應(yīng)基因產(chǎn)物蛋白質(zhì)的功能活性從而可取代PUC19質(zhì)粒作為pUC19質(zhì)粒的的替代物用于癌癥的治療。匹配的DNA序列并沒(méi)有必要被完全匹配。根據(jù)一般規(guī)律siRNA與匹配的 DNA序列上可以略有不同，允許10%，20%，甚至高達(dá)30-40%的變異。siRNA，miRNA，shRNA 的核苷酸序列可以有部分(10%，20%，直到30-40% )變異。術(shù)語(yǔ)“siRNAl”[序列號(hào)10]是一個(gè)根據(jù)pUC19質(zhì)粒DNA序列”[序列號(hào)1]衍生設(shè) 計(jì)的 siRNA。此 siRNA序列匹配至Ij人 transient receptor potential cation channel, C亞 基，成員 6(TRPC6，GeneID 7225)，mRNA (gi 119923256 | NM_004621. 3)同義名TRP6，F(xiàn)SGS2, FLJl 10980在此siRNAl作為藥用與癌癥治療。根據(jù)一般規(guī)律siRNA與匹配的DNA序列上 可以略有不同，允許10%，20%，甚至高達(dá)30-40%的變異。這些siRNA，miRNA，shRNA的核 苷酸序列可以有部分(10%，20%，直到30-40% )變異。術(shù)語(yǔ)“siRNA3” [序列號(hào)12]是一個(gè)根據(jù)pUC19質(zhì)粒DNA序列”[序列號(hào) 1] ti 生設(shè)計(jì)的 SiRNAo 此 SiRNA 序列匹配至Ij 人 membrane associated guanylate kinase, Wff and PDZ domain containing 3 (MAGI3, GeneID :260425), transcript variant 2， mRNA(gi 23097339|NM_152900.1)synonyms :MAGI-3, MGC163281 and the Homosapiens transmembrane protein 182 (TMEM182, Gene ID : 130827), mRNA(gi I 40255064 | NM_144632. 2)。在此siRNA3作為藥用與癌癥治療。根據(jù)一般規(guī)律siRNA 與匹配的DNA序列上可以略有不同，允許10 %，20 %，甚至高達(dá)30-40 %的變異。這些siRNA， miRNA, shRNA的核苷酸序列可以有部分(10%，20%，直到30-40% )變異。術(shù)語(yǔ)“siRNA2” [序列號(hào)11]是一個(gè)根據(jù)pUC19質(zhì)粒DNA序列”[序列號(hào)1]衍生設(shè)計(jì)的 siRNA。此 siRNA 序列的 2/3 匹配到人 Homo sapiens SH3 and PX domains 2B (SH3PXD2B)，mRNA. (SH3PXD2B, GeneID 285590), mRNA (NM_001017995) synonyms =HOFI ； FLJ20831 ；KIAA1295。除此以外，此siRNA2還匹配到其他45個(gè)人類基因的DNA序列的側(cè)翼 區(qū)。在此siRNA2作為藥被用于針對(duì)SH3PXD2B和所有其他的相關(guān)基因用與癌癥治療。根據(jù)一般規(guī)律siRNA與匹配的DNA序列上可以略有不同，允許10 %，20 %，甚至高達(dá)30-40 %的變異。i^"TRPC6" [ ^ ^lJ 2]代表人 transient receptor potential cation channel, subfamily C, member6 (TRPC6, GeneID 7225)，mRNA(gi 119923256 | NM_004621. 3) 同義詞TRPC6，F(xiàn)SGS2，F(xiàn)LJ11098。在此，TRPC6是作為研發(fā)抗癌藥物治療的靶目標(biāo)。TRPC6 可以作為任何針對(duì)其并可改變其表達(dá)水平及分子功能的靶目標(biāo)方式的改變?cè)谶\(yùn)作，其中包 括但不限于多聚核苷酸，siRNA, shRNA慢，反義RNA，反義DNA寡聚體，和顯性負(fù)的DNA載 體，多肽，氨基酸序列，如肽，抗體，小分子抑制劑。該TRPC6以前報(bào)告已作為癌癥治療的潛 在目標(biāo)，但沒(méi)有報(bào)告關(guān)于TRPC6作為一個(gè)與IKK抑制劑，WSTlr或化療藥物聯(lián)合易用的成分 用于癌癥的治療，從而達(dá)到癌細(xì)胞生長(zhǎng)的協(xié)同抑制促進(jìn)癌癥治療癌癥的目標(biāo)組合使用細(xì)胞 死亡。在上述SiRNAl順序是首選的序列，但是這并不限制其他siRNA序列和其他方法的 應(yīng)用。根據(jù)一般規(guī)律siRNA與匹配的DNA序列上可以略有不同，允許10%，20%，甚至高達(dá) 30-40%的變異。^ Ig-"MAG 13" [ Jf ^lJ 4] ^^ A membrane associated guanylate kinase, Wff and PDZ domain containing 3 (MAGI3, GeneID :260425), transcript variant 2, mRNA (gi I 23097339 | NM_152900. 1).同義詞MAGI-3，MGC163281. MAGI-3。MAG I-3 是本 地化的莫寧，在上皮細(xì)胞緊密連接1和cingulin，MAGI-3與Z0-1和cingulin共同位 于細(xì)胞膜緊密連接 處以為基礎(chǔ)的E-鈣粘蛋白在上皮細(xì)胞間相互連接處以及原代培養(yǎng)星 形膠質(zhì)細(xì)胞的灶狀粘聯(lián)斑處(Adamsky K, Arnold K, Sabanay H, Peles Ε, Junctional protein MAGIKK interacts with receptor tyrosine phosphatasebeta(RPTP beta)and tyrosine-phosphorylated proteins. (J Cell Sci. 2003，116 (Pt 7) :1279_89)。MAGI—3 直接與LPA (2)直接接觸并調(diào)節(jié)LPA (2)誘導(dǎo)激活ERK和RhoA的功能活性(Zhang H. Wang D， Sun H, Hall RA, Yun CC, Cell Signal. 2007 Feb ； 19 (2) 261-8. Epub 2006 Aug 9)。MAGI3 與癌癥有關(guān)的功能以前已有報(bào)告，但沒(méi)有報(bào)告關(guān)于MAGI3作為一個(gè)把目標(biāo)抑制其活性與 WST-lr，IKK抑制劑或化療藥物聯(lián)合應(yīng)用治療癌癥，從而達(dá)到協(xié)同抑制促進(jìn)癌癥細(xì)胞死亡以 治療癌癥的目標(biāo)。在此MAGI-3是開(kāi)發(fā)抗癌藥的靶目標(biāo)，可以作為任何針對(duì)其并可改變其表 達(dá)水平及分子功能的藥物開(kāi)發(fā)，其中包括但不限于多聚核苷酸，siRNA, shRNA慢，反義RNA， 反義DNA寡聚體，和顯性負(fù)的DNA載體，多肽，氨基酸序列，如肽，抗體，小分子抑制劑。在上 述siRNA3是首選的序列，但是這并不限制其他siRNA序列和其他方法的應(yīng)用。根據(jù)一般規(guī) 律siRNA與匹配的DNA序列上可以略有不同，允許10 %，20 %，甚至高達(dá)30-40 %的變異。術(shù)語(yǔ)"TMEM182，，[序列號(hào)5]代表人trans-membrane protein 182(TMEM182, GeneID 130827), mRNA (gi | 40255064 | NM_144632. 2)。在此 TMEM183 是作為研發(fā)抗癌藥物治 療的靶目標(biāo)。TMEM182可以作為任何針對(duì)其并可改變其表達(dá)水平及分子功能的靶目標(biāo)的治 療藥物與方法，其中包括但不限于多聚核苷酸，siRNA, shRNA,反義RNA，反義DNA寡聚體，和 顯性負(fù)的DNA載體，多肽，氨基酸序列，如肽，抗體，小分子抑制劑。該TMEM182目前以假設(shè)基 因定義于基因庫(kù)，此前尚無(wú)關(guān)于此基因的報(bào)告。在此TMEM182作為癌癥治療藥物的潛在目 標(biāo)，與IKK抑制劑，WSTlr或化療藥物聯(lián)合應(yīng)用的成分用于癌癥的治療，從而達(dá)到協(xié)同促進(jìn) 癌細(xì)胞死亡的癌癥治療。在上述siRNA3順序是首選的序列，但是這并不限制其他siRNA序 列和其他方法的應(yīng)用。根據(jù)一般規(guī)律siRNA與匹配的DNA序列上可以略有不同，允許10%，20 %，甚至高達(dá)30-40 %的變異。術(shù)語(yǔ)“SH3PXD2B”[序列號(hào)3]代表人 SH3 and PX domains 2B 鏈接蛋白 HOFKGeneID =285590)含有SH3和PX domain。在此SH3PXD2B是作為研發(fā)抗癌藥物治療的 靶目標(biāo)。SH3PXD2B可以作為任何針對(duì)其并可改變其表達(dá)水平及分子功能的靶目標(biāo)的治療藥 物與方法，其中包括但不限于多聚核苷酸，siRNA, shRNA慢，反義RNA，反義DNA寡聚體，和顯 性負(fù)的DNA載體，多肽，氨基酸序列，如肽，抗體，小分子抑制劑。該TMEM182目前以假設(shè)基 因定義于基因庫(kù)，此前尚無(wú)關(guān)于此基因的報(bào)告。在此SH3PXD2B作為癌癥治療藥物的潛在目 標(biāo)，與IKK抑制劑，WSTlr或化療藥物聯(lián)合應(yīng)用的成分用于癌癥的治療，從而達(dá)到協(xié)同促進(jìn) 癌細(xì)胞死亡的癌癥治療。在上述siRNA3順序是首選的序列，但是這并不限制其他siRNA序 列和其他方法的應(yīng)用。根據(jù)一般規(guī)律siRNA與匹配的DNA序列上可以略有不同，允許10%， 20 %，甚至高達(dá)30-40 %的變異。術(shù)語(yǔ)“C6orfl08”[序列號(hào)6]代表人 C6orfl08 染色體 6 open reading frame 108 [Homo sapiens]GeneID 10591.正式代號(hào)C6orfl08。此基因是基于可被c_myc激活而 發(fā)現(xiàn)的。大鼠實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明此基因與細(xì)胞分裂繁殖及c-myc介導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)化有關(guān)。術(shù)語(yǔ)“干擾素”(干擾素)代表一類是由白細(xì)胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子。在本 文所描述的包括所有I型和II型干擾素和所有亞型干擾素，包括但不限于IFN α A，IFNaB, IFNa C, IFNa D, IFNa F, IFNa G, IFNa H, IFNa I，IFNa I，IFNa K, IFNa 4b, IFNaffA, IFN β，IFN y and IL—6。 "ffST-lc"代表一類水溶性四氮唑鹽，WST-l{4-[3-(4-lodophenyl)-2-(4_nit rophenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzenedilsulfonate}由 ishiyama et al合成于 1996(Ishiyam Μ,et al Biol Pharm Bull 1996,19:1515-20).術(shù)語(yǔ)“WST-lr”代表一個(gè)試劑由WST-lc和mPMS以適當(dāng)?shù)腤ST-Ic和mPMS的濃度 及相互比例組成。WST-Ir在此作為藥物成分用于癌癥治療。術(shù)語(yǔ)"IEA” 全名 Jntermediate Electron Acc印tor 中間電子受體·術(shù)語(yǔ)‘‘mPMS”化學(xué)名1-甲氧基_5_甲基-phenazinium甲基硫酸，與四唑鹽相結(jié)合 作為“電子耦合劑化合物的行為/中間電子受體”。術(shù)語(yǔ)“Q1”輔酶Ql，2，3_ 二甲氧基-5-甲基_6-(3_甲基_2_ 丁烯基)_1，4_苯醌， 是作為一種電子耦合劑化合物的行為/中間電子受體。術(shù)語(yǔ)“WST”代表了一種水溶性四氮唑鹽，此類化合物包括但不僅限于WST-3， WST-4, WST-5, WST-8, WST-9, WST-10, WST-11, XTTjP MSN。這些化合物不能通透過(guò)細(xì)胞質(zhì)膜。術(shù)語(yǔ)“XTT”，代表了類似的WST類水溶性四氮唑鹽以及由XTT和mPMS或輔酶Ql組 成的試劑。術(shù)語(yǔ)“CCK8”代表細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒，該試劑是由WST8和mPMS組成。術(shù)語(yǔ)〃 WST-Ir的有效替代物〃表示任何化合物可以替換WSTlr，WST-Ic的功 能或電子耦合劑mPMS的功能，或任何其它的組成成分，可以單獨(dú)或以組合形式替代此說(shuō) 明中所描述的WSTlr達(dá)到其由聯(lián)合用藥所造成的協(xié)同誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡的功能。這些替 代物包括者任何類型或任何類型的行為tetrazolium鹽和國(guó)際能源機(jī)構(gòu)的任何組件的組 合，包括WSTlr為WSTlr本規(guī)范中所述的功能重現(xiàn)?！癢ST-Ir的有效替代物〃包括但不是限于所有目前可得到的水溶性四氮唑鹽包括但不限于WST-lc，WST-3、WST-4、WST-5、 WST-9、WST-10、MTS，WSTl 1, XTT ；中間電子受體包括但不限于mPMS和輔酶Ql ；中間電子 受體與水溶性四氮唑鹽的組合物包括WST-l+mPMS，WST-3+mPMS，WST-4+mPMS，WST-5+mPMS， WST-9+mPMS，WST-10+mPMS，WST-ll+mPMS、XTTmPMS、MTS+mPMS、WST-3+Q1，WST-4+Q1， WST-5+Q1，WST-9+Q1，WST-10+Q1，WST-11+Q1，XTT+qlMTS+Ql。術(shù)語(yǔ)〃 IKK抑制劑〃一詞表示可抑制IKK活性的抑制劑。IKK抑制劑可能是一個(gè) 競(jìng)爭(zhēng)、非競(jìng)爭(zhēng)性的，可你的或不可逆的IKK抑制劑。競(jìng)爭(zhēng)性的IKK抑制劑是一個(gè)化合物或活 性的肽可逆的作用于IKK酶的催化活性中心；“非競(jìng)爭(zhēng)性的IKK抑制劑"是一種化合物， 可逆抑制IKK酶的非催化部位；“IKK不可逆抑制"是一種化合物與IKK酶形成共價(jià)鍵 不可逆轉(zhuǎn)的銷毀IKK酶活性?！癐KK抑制劑"包括但不限于，，i)以確認(rèn)其對(duì)IKK抑制功 能的化合物包括但不限于SPC839 (Signal Pharmaceutical Inc.), Anilino-Pyrimidine Derivative (Signal PharmaceuticalInc)，PSl145 (Millennium Pharmaceutical Inc.)， BMS-345541*(Bristol-Myers Squibb Pharmaceutical Research Institute， IKK inhibitor III)，SC-514氺(Smithkilne Beecham Corp.)，Amino-imidazolecarboxamide derivative (Smithkilne BeechamCorp. )，Ureudo-thiophenecarboxamide derivatives (AstraZeneca), Diarylpybidine derivative (Bayer), Pyridooxaz inonederivative (Bayer)，Indolecarboxamide derivative (Aventis Pharma)， Benzoimidazole carboxamide derivative (AventisPharma)，Pyrazolo[4,3-c] quinoline derivative (Pharmacia Corporation)，Imidazolylquinoline-carbχ aldehydesemicarbazide derivative(Tulark Inc.)，Pyridyl Cyanoguanidine derivate (Leo Pharma), IkB Kinase InhibitorPeptide(CalBiochem)，IKK-2 Inhibitor IV[5-(p-Fluorophenyl)-2-ureido]thiophene-3-carboxamide (CalBiochem)， IKKInhibitor II，Wedelolactone(CalBiochem)，IKK Inhibitor VII(CalBiochem)，IKK-2 Inhibitor V N-(3，5-Bis-trifluoromethylphenyl)-5-chloro-2-hydroxybenzamide IMD-0354(CalBiochem), IKK-2 Inhibitor VI (5-Phenyl-2-ureido)thiophene-3-carbox amide (CalBiochem)，IKK-2 Inhibitor VIII ACHP 2-Amino-6-(2-(cyclopropylmethoxy )-6-hydroxyphenyl) -4(4-piperidinyl)-3-pyridinecarbonitrile(CalBiochem). ii)發(fā) 現(xiàn)具有抗腫瘤活性的IKK抑制劑已，包括但不限于PS1145 (Millennium Pharmaceutical Inc.)，BMS-345541*(Bristol-Myers Squibb Pharmaceutical Researchlnstitute).術(shù)語(yǔ)"CK2抑制劑"一詞表示所有蛋白激酶2的抑制劑。首選的CK2抑制劑是但 不限于apigenin。術(shù)語(yǔ)“Apigenin”同義名Apigenol，Spigenin和Versulin是自然存在的黃酮 類(flavonoid)化合物，一黃酮(一類黃酮類，包括紅橘，，6-羥基黃酮，黃芩，黃芩素，漢 黃芩素，地奧司明，黃酮哌酯)，廣范存在于水果和蔬菜中，如蘋果，芹菜等。CAS登錄號(hào) 520-36-5，化學(xué)文摘服務(wù)名4H-1-苯并吡喃-4-1，5，7- 二羥基-2-(4-羥基苯基)-(9CI)。 Apigenin是一個(gè)多功能的信信息傳到抑制劑及調(diào)節(jié)劑。Apigenin可降低DNA氧化損傷， 抑制白血病細(xì)胞生長(zhǎng)和誘導(dǎo)這些細(xì)胞分化，抑制腫瘤細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抗炎作 用，而且作為一個(gè)反痙攣或解痙。Apigenin抑制NFk B，IKK, CK2，MPK, HIF, VEGF等分于的 活性和其他一些分于和如細(xì)胞周期和血管生成功能的調(diào)節(jié)，誘導(dǎo)P53的活化等途徑。已知Apigenin可抵抗紫外線輻射引起的氧化和殺傷作用以及具有癌癥化學(xué)預(yù)防的功能。術(shù)語(yǔ)“氯化鋰”是一個(gè)無(wú)機(jī)鹽，Iithedium氯化物，并作為一種合成激酶 3β (GSK3 β )抑制劑.氯化鋰在此代表合成激酶3 β抑制劑。術(shù)語(yǔ)“ΙΚΚ”代表Inhibitory kappaB Kinase，是一個(gè)磷酸化激酶可磷酸化 Inhibitory κ B(I κ B)從而活化NF-κ B。目前已有兩個(gè)IKK亞型已經(jīng)確定。他們是 IKKl(IKKa)和ΙΚΚ2(ΙΚΚβ)。術(shù)語(yǔ)“NF-κ B”是一個(gè)rel蛋白家族，作為細(xì)胞核內(nèi)調(diào)節(jié)基 因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。通常NF-K B蛋白與I κ B在細(xì)胞漿內(nèi)形成無(wú)活性的NF-K B蛋白復(fù)合 物。受到刺激信號(hào)后，IKK磷酸化I κ B使之脫離NF- κ B從而使由此釋放的游離的NF- κ B 活化并從細(xì)胞漿內(nèi)進(jìn)入細(xì)胞核以激活NF-κ B調(diào)節(jié)的基因的特別的轉(zhuǎn)錄。游離的I κ B將被 protesomes分解。激活的NF-κ B的青睞細(xì)胞增殖和生存。NF-κ B的作用可促進(jìn)癌變過(guò) 程，腫瘤惡性化的發(fā)展及腫瘤細(xì)胞對(duì)化療和放射療法的抗藥性。術(shù)語(yǔ)“c-Jim氨基末端激 酶”(JNKs)，最初發(fā)現(xiàn)是作為激酶與相結(jié)合并磷酸化c-JUN位于其分子內(nèi)轉(zhuǎn)錄活化域的第 63和73的絲氨酸。此部位是可被有絲裂原活化物激活的磷酸激酶，具有對(duì)各種刺激作出反 應(yīng)的能力，例如細(xì)胞因子，紫外線照射，熱休克，和滲透壓性休克，并與T細(xì)胞分化和凋亡 有關(guān)。術(shù)語(yǔ)“活性氧”(ROS)的包括氧離子，無(wú)機(jī)和有機(jī)的自由基和過(guò)氧化物。他們通常 是小分子，具有高度的反應(yīng)由于未成對(duì)價(jià)層電子的存在。羅斯的形式作為對(duì)氧的正常代謝 的自然副產(chǎn)品，在細(xì)胞有重要作用的信號(hào)。已知活性氧對(duì)多種動(dòng)物的細(xì)胞代謝都有很重要 的影響。這些作用不僅包括誘導(dǎo)細(xì)胞死亡和細(xì)胞凋亡，還包括誘導(dǎo)細(xì)胞的防衛(wèi)基因的反應(yīng)， 和鐵的轉(zhuǎn)移運(yùn)送系統(tǒng)。由此進(jìn)一步顯示活性氧在信息傳導(dǎo)與氧化還原中的作用。術(shù)語(yǔ)“癌癥細(xì)胞”所代表的是從人類的癌癥或腫瘤細(xì)胞建立的可在體外培養(yǎng)的細(xì) 胞株，這些細(xì)胞已失去接觸抑制，具有惡性細(xì)胞特征。術(shù)語(yǔ)“癌癥”是指一種疾病狀態(tài)，這種疾病是由于致癌物導(dǎo)致的體細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化而 形成的癌癥，這些癌癥細(xì)胞可入侵其周圍的正常組織，進(jìn)入淋巴或血液系統(tǒng)是這些惡性細(xì) 胞可通過(guò)淋巴和血液系統(tǒng)擴(kuò)散到身體其他部位，即癌癥轉(zhuǎn)移。“有效劑量”本文提到的“有效劑量”是指一種藥物或藥品可引起一個(gè)細(xì)胞，組織， 系統(tǒng)，動(dòng)物或人類達(dá)到研究人員和臨床醫(yī)生所期望的生物或醫(yī)學(xué)反應(yīng)的劑量。術(shù)語(yǔ)“有效治療劑量”是指對(duì)于一個(gè)以前沒(méi)有用過(guò)此治療的個(gè)體在經(jīng)過(guò)此治療后 可達(dá)到疾病或癥狀或副作用的改善，治愈，康復(fù)，預(yù)防，或減少疾病的進(jìn)一步發(fā)展或惡化的 劑量。本術(shù)語(yǔ)還表示在一定的范圍內(nèi)有效地加強(qiáng)正常生理功能。術(shù)語(yǔ)“癌癥治療”，表示所給予細(xì)胞或哺乳動(dòng)物的藥物或試劑，治療療程，所采用的 給藥或試劑的方法和治療方法，以及用藥順序和給藥間隔。術(shù)語(yǔ)“協(xié)同效應(yīng)”是指應(yīng)用兩個(gè)或兩個(gè)以上的藥物治療并由此得到兩種藥物作用 相乘的治療效果，即優(yōu)勢(shì)相結(jié)合的結(jié)果以得到比這些藥物的累加效應(yīng)更大的療效。術(shù)語(yǔ)“化療藥物(代理)，，是指任何藥物對(duì)癌細(xì)胞細(xì)胞毒作用，且目前作為藥物用 于治療癌癥。以下所列藥物為本說(shuō)明測(cè)試過(guò)的的藥物。，我們?cè)诒疽?guī)范中提到“化療藥物”不 局限于到此列表中藥物。術(shù)語(yǔ)“氟尿嘧啶”，5-氟-2，4-(1Η，3Η)嘧啶(5-fluoro-2，4_(1H，3H) pyrimidinedione, 5-FU)，氟脲嘧啶是目前臨床應(yīng)用的藥物。
術(shù)語(yǔ)“順鉬”順鉬，cis-diamminedichloroplatinum，是目前臨床應(yīng)用的藥物。作 為注射溶液PLATINOL. RTM。術(shù)語(yǔ)“紫杉醇(Paclitaxel)，，是一種強(qiáng)力抗腫瘤的藥物，結(jié)合到N-末端區(qū)域的 β -微管蛋白和促進(jìn)高度穩(wěn)定微管的形成抵制解聚，從而阻止正常細(xì)胞分裂，并使分裂細(xì)胞 中止于細(xì)胞周期G2/M轉(zhuǎn)換期。術(shù)語(yǔ)“阿霉素(Doxorubicin)”，(8S，10S_10-[3-氨基_2，3，6-trideoxy-· alpha. -L-lyxo-hexopyranosyl)氧]-8-glycoloyl,7,8,9,10-四 M -6,8,11-徑 基-1-甲氧基 _5，12naphthacenedione 鹽((8S，10S)-10-[ (3-amino_2，3，6-trideoxy-· alpha.-L-lyxo-hexopyranosyl)oxy]-8__glycoloyl,7,8,9,10-tetrahydro-6,8, ll-trihydroxy-l-methoxy-5,12naphthacenedione hydrochloride)，是巨前 床常規(guī)應(yīng) 用的注射用化療藥。術(shù)語(yǔ)“化合物或藥物成分的有效治療量”，是指是以能夠改變細(xì)胞培養(yǎng)的癌細(xì)胞增 殖，在動(dòng)物尤其是人類的腫瘤的生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移，包括防止腫瘤形成和阻止腫瘤的生長(zhǎng)，化合物 或藥物成分的有效治療量同時(shí)也代表可以導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡或選擇性的腫瘤細(xì)胞死亡，而對(duì) 正常細(xì)胞的無(wú)副作用的藥物劑量。術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的”表示由聯(lián)邦或州政府或美國(guó)藥典或其他監(jiān)管部門批準(zhǔn)承 認(rèn)的可在動(dòng)物特別是在人類身上使用的。
術(shù)語(yǔ)“載體”是指，例如，可用于輔助給藥的稀釋劑，助劑，輔料，助劑或溶劑。這 種藥物的載體可為無(wú)菌液體，例如水和油，包括石油，動(dòng)物，植物或合成液體，如花生油， 豆油，礦物油，芝麻油等。水或生理鹽水，葡萄糖水和甘油是最常用的載體，尤其是注射液。 "Remington的制藥科學(xué)”介紹了適用的醫(yī)用載體。它也包括細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑，用于提供體外 或體內(nèi)轉(zhuǎn)染DNA和/或RNA進(jìn)入細(xì)胞的試劑。術(shù)語(yǔ)“同時(shí)”是指⑴在相同時(shí)時(shí)間，或(2)在共同的治療過(guò)程中相同的時(shí)間。術(shù)語(yǔ)“順序”是指首先用一個(gè)有活性的藥，再用另一個(gè)有活性的藥。第二個(gè)活性藥 物的應(yīng)用可在應(yīng)用第一個(gè)活性的藥之后立即給予或間隔一段是今后在給予。間隔的時(shí)間可 根據(jù)治療效果決定已得到最好的治療效果。二.癌癥治療的靶目標(biāo)與靶向治療，在此首先介紹新發(fā)現(xiàn)的可作為腫瘤治療的靶目標(biāo)的基因，與這些基因相應(yīng)的蛋白 分子，以及能與這些基因及相應(yīng)的蛋白分子相互作用已達(dá)到腫瘤治療作用的抗體，多肽和 小分子化合物。這些基因與腫瘤治療關(guān)系的發(fā)現(xiàn)起源于pUC19(SEQ ID#1)的核苷酸序列。當(dāng) pUC19(SEQ ID#1)轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞，或可同時(shí)合用IKK抑制劑，并與WST-Ir或其有效替代物合 用時(shí)可產(chǎn)生誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡的協(xié)同效應(yīng)。pUC19(SEQ ID#1)轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞還可與化療藥 物合用已達(dá)到協(xié)同治療效應(yīng)。PUC19 (SEQ ID#1)的這一治療作用此前從未有過(guò)報(bào)道，在此是 首次發(fā)現(xiàn)。pcDNA3 v3. 1 (SEQ ID 13)也發(fā)現(xiàn)有相同作用?！癗CBIBlast_pcDNA3核苷酸序 列(5448字母)〃。pUC19(SEQ ID#1)的抗腫瘤作用源于與其DNA核苷酸序列。pUC19(SEQ ID#1)的 DNA序列可匹配于一些特定的信息RNA和許多基因周邊的調(diào)節(jié)部位?？膳cpUC19 (SEQ ID#1) 匹配的人來(lái)信息 RNA 包括但不限于l)Homo sapiens transient receptor potentialcation channel, subfamily C, member 6(TRPC6, GeneID :7225, mRNA :NM_004621. 3, SEQ ID#2，#6)，(2)Homo sapiens SH3 and PX domains 2B(SH3PXD2B，GeneID :285590， mRNA :NM_001017995, SeQ ID#3, #7)，(3)Homo sapiens membrane associated guanylate kinase, Wff and PDZdomain containing 3(MAGIKK, GeneID :260425, transcript variant 2, mRNA :NM_152900, SeQ ID#4, #8), (4)theHomo sapiens trans-membrane protein 182(TMEM182, GeneID : 130827，mRNA :NM_144632，SeQ ID#5，#9)and(5)Homo sapiens chromosome 6 open reading frame 108 C6orf108, GeneID : 10591 SeQID #14，#15). pUC19(SEQ ID #1)與人類基因匹配的序列列于“NCBI Blast-pUC19-Human_Transcripts and genome (2686 letters) "NCBIBlast_siRNA2 Nucleotide sequence (24 letters)，，and，，NCBI Blast_pcDNA3 Nucleotide sequence (5448 letters)，，。在此列出的多聚核苷酸序列(SEQ ID NO =2,3,4, 5 and 14)，以及與此衍生的氨 基酸序列(SEQ ID N0:6，7，8，9 and 15)可作為腫瘤治療的靶目標(biāo)用于發(fā)抗腫瘤藥物的 研發(fā)。其中包括但不限于肽與蛋白質(zhì)，多肽抑制劑，抗體，小分子抑制劑，siRNAs, shRNA, antisense-RNA，反義寡核苷酸，和dominant negative DNA。在此所說(shuō)的siRNAs包括但不 限于 siRNAl (SEQ ID#10), siRNA2(SEQ ID #11) siRNA3 (SEQ ID #12)。在此應(yīng)用的作為基因產(chǎn)物的多聚核苷酸和多肽包括從組多聚核苷酸和多肽，天 然的和人工合成的多聚核苷酸和多肽，以及化學(xué)修飾的多聚核苷酸和多肽。
在此所述匹配于人類基因周邊調(diào)節(jié)部位的pUC19的核苷酸和的多肽包括從組多 聚核苷酸和多肽，天然的和人工合成的多聚核苷酸和多肽，以及化學(xué)修飾的多聚核苷酸和 多肽。在此所述的多聚核苷酸和多態(tài)肽可用于本發(fā)明所述的用途。例如多聚核苷酸序 列(SEQ ID#2,3,4,5and 14)的衍生物和類似物可由i) DNA序列的片段且可含有40%以下 的錯(cuò)配；ii)插融合入DNA質(zhì)粒的DNA序列；iii)經(jīng)過(guò)修飾的核苷酸序列所替代。在此所述的多聚核苷酸和多態(tài)肽可用于本發(fā)明所述的用途。例如多肽序列(SEQ ID6，7，8，9 and 15)的衍生物和類似物可由i) 一種一個(gè)或多個(gè)氨基酸被遺傳守恒的氨基 酸或非遺傳守恒的氨基酸所替代，而且這些替代的氨基酸不必是與其相應(yīng)基因的DNA序列 一致；ii) 一種其中包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸的替代物；iii)成熟多肽與另一個(gè)復(fù)合物融合， 如一種化合物可增加了多肽半衰期的化合物(例如聚乙二醇)；或(iv) —種額外的氨基酸 的半衰期中這融入成熟的肽，例如一個(gè)引導(dǎo)肽鏈，或分泌的序列，或用于純化成熟多肽的 序列(如組氨酸hexapeptide)或蛋白原的序列。相關(guān)專業(yè)人士可根據(jù)此說(shuō)明制作出或得 到這些多肽片段，衍生物，和類似物。在此所述siRNAs (SEQ ID 10，11、12)的替代物可用于本發(fā)明所述的用途。示例可 能包括但不是限于以(i)可匹配到同一基因其他部位的DNA編碼序列的siRNA在的基因 siRNA序列；(ii)針對(duì)相同的基因的堿基的變異的siRNA但仍有能力減少此基因的表達(dá)水 平；(iii)任何類型的經(jīng)過(guò)修飾的siRNA，可為核苷酸的修適，或整個(gè)siRNA的修飾；(iv)使 siRNA序列結(jié)合于任何形式的載體，如質(zhì)?；蚧衔镆灾趯⑵渌腿爰?xì)胞內(nèi)。以上所述基因的mRNA列及其可翻譯區(qū)的核苷酸序列和氨基酸序列，可根據(jù)其基 因ID從NCBI序列數(shù)據(jù)庫(kù)獲取。在此所述的藥劑成分及醫(yī)療應(yīng)用至少部分是基于發(fā)現(xiàn)pUC19質(zhì)粒與IKK抑制劑和WST-Ir聯(lián)合應(yīng)用對(duì)于腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖的抑制作用和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡的作用以及 與化療藥物相結(jié)合的協(xié)同增效的治療作用。PUC19的這一作用可由siRNA，化合物或小分子 抑制劑、肽抑制劑、抗體、顯性抑制性DNA，反義RNA、寡聚反義DNA，和抗體，可特異靶向改變 上述基因或蛋白的表達(dá)水平所取代或可部分被干擾素的作用所取代。可由此治療的腫瘤包括但不限于前列腺癌、結(jié)腸癌、直腸癌、胰腺癌、子宮頸癌、 胃癌、子宮內(nèi)膜癌、腦癌、肝癌，膀胱癌、卵巢癌、睪丸癌、頭頸部癌，皮膚癌(包括黑素瘤和 基底癌)間皮瘤、食管癌、乳腺癌、(包括小細(xì)胞肺癌肺癌、非小細(xì)胞癌)腎上腺癌、甲狀腺 癌、腎癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，間皮瘤、腎細(xì)胞癌、絨毛膜上皮癌，皮基底細(xì)胞癌和睪丸生殖細(xì)胞 癌，橫紋肌肉瘤，結(jié)締組織或骨肉瘤和白血病。三、WST-Ir作為組合藥物成分用于抗腫瘤治療在此以前，WST-Ir從未用作藥物，更未用于抗腫瘤治療。其抗腫瘤作用是其作為測(cè) 定細(xì)胞生長(zhǎng)的試劑時(shí)發(fā)現(xiàn)的。當(dāng)WST-Ir與(1)芹黃素(Apigenin)、一個(gè)黃酮(Flavonoids) 類化合物或及其有效的替代物、(2) IKK抑制劑(3)的Pucl9轉(zhuǎn)染或其有效的替代物以及至 少一種IKK抑制劑，結(jié)合應(yīng)用時(shí)，WSTlr可起到增強(qiáng)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡療效的協(xié)同作用。此 藥物的成分可以合適的濃度溶于磷酸鹽緩沖液或其藥要用載體中并以有效的劑量用于腫 瘤病人的治療。細(xì)胞增殖測(cè)定試劑WSTlr 由 tetrazolium 鹽 WST-lc {4_[3_ (4-lodophenyl) _2 -(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzenedilsulfonate}(WST-1, Ishiyam Μ, et al Biol Pharm Bull 1996,19 1515-20 ；Berridge MV, et alBiotechnology Annual Review, Vol. II : 127-152，2005)，和一個(gè)中間電子受體(IEA) l-methoxy-5-methyl-phenaz iniummethyl sulfate(mPMS,Berridge MV, et al Biotechnology Annual Review,Vol. II 127-152，2005)、以適當(dāng)?shù)臐舛缺冉M成并溶于磷酸鹽緩沖液中。WSTlr可用于癌癥治療的活性成分可以是WST-I或mPMS或二者以優(yōu)化比率濃度的 組合，在此文以上和以下所指的WSTlr，代表具有相同功能和活性的一組化合物或一組由水 溶性的tetrazolium鹽，與IEA組成的混合物。這些化合物具有，但并不限于，跨細(xì)胞膜電 子轉(zhuǎn)運(yùn)的功能和產(chǎn)生活性氧的功能。有效的WST-Ic替代物包括，但不是限于其它的tetrazolium鹽包括WST-3、WST_4、 WST-5、XTT、等以最適濃度并于可接受的藥用介質(zhì)中。有效的mPMS的替代物包括其他IEAs，例如但不限于輔酶Ql (Berridge MV, et al BiotechnologyAnnual Review, Vol. II 127-152, 2005)等以最適濃度并于可接受的藥用介質(zhì)中。WSTlr包括至少一種tetrazolium鹽的成分WST-lc，和至少一個(gè)IEA，mPMS等以最 適濃度和比例并于可接受的藥用介質(zhì)中。WSTlr的有效替代物包括但不限于(1)由至少一個(gè)tetrazolium鹽和至少一個(gè) IEA 組成的混合溶液。例如但并不限于WST-l+mPMS，WST-3+mPMS, WST-4+mPMS, XTT+mPMS ； (2)至少一個(gè)， tetrazolium鹽，例如，但不限于WST 3 ； (3)至少一個(gè)IEA，例如，但不限于、mPMS 和輔酶Ql在以最適濃度和比例并于可允許的藥用介質(zhì)中。本發(fā)明用于治療癌癥的另一個(gè)用法特點(diǎn)是WST-Ir和芹菜素及其他有效的替代品可同時(shí)使用也可以任何順序先后使用從而成為更適宜的用法。此法適用于在此以上及以下 的說(shuō)明。本發(fā)明用于治療癌癥的另一個(gè)用法特點(diǎn)是WST-Ir和至少有一個(gè)IKK抑制劑及其 他有效的替代品可同時(shí)使用也可以任何順序先后使用從而成為更適宜的用法。此法適用于 在此以上及以下的說(shuō)明。本發(fā)明用于治療癌癥的另一個(gè)用法特點(diǎn)是按照以下順序(I)DNA轉(zhuǎn)染，或干擾素，或SiRNA轉(zhuǎn)染或其他有效的替代品，然后同時(shí)應(yīng)用(2)至 少有一個(gè)IKK，或CK2的或GSK3b抑制劑，然后，(3)再順序應(yīng)用WSTlr從而成為更適宜的用 法。此法適用于在此以上及以下的說(shuō)明。本發(fā)明用于治療癌癥的另一個(gè)用法特點(diǎn)是按照以下順序(I)DNA轉(zhuǎn)染，或干擾素，或SiRNA轉(zhuǎn)染或其他有效的替代品，然后同時(shí)應(yīng)用(2)至 少有一個(gè)IKK，或CK2的或GSK3b抑制劑，然后，(3)再順序應(yīng)用WST-Ir成分中的IEA，從而 成為更適宜的用法。此法適用于在此以上及以下的說(shuō)明。 本發(fā)明用于治療癌癥的另一個(gè)用法特點(diǎn)是按照以下順序(I)DNA轉(zhuǎn)染，或干擾素，或SiRNA轉(zhuǎn)染或其他有效的替代品，然后同時(shí)應(yīng)用(2)至 少有一個(gè)IKK，或CK2的或GSK3b抑制劑，然后，(3)再順序應(yīng)用WST-Ir成分中除IEA外的 其他成分，從而成為更適宜的用法。此法適用于在此以上及以下的說(shuō)明。本發(fā)明用于治療癌癥的另一個(gè)用法特點(diǎn)是按照以下順序(I)DNA轉(zhuǎn)染，或干擾素，或SiRNA轉(zhuǎn)染或其他有效的替代品，然后同時(shí)應(yīng)用(2)至 少有一個(gè)IKK，或CK2的或GSK3b抑制劑，然后，(3)再順序應(yīng)用WST-Ir成分中任何有效成 分，從而成為更適宜的用法。此法適用于在此以上及以下的說(shuō)明。本發(fā)明用于治療癌癥的另一個(gè)用法特點(diǎn)是按照以下順序(I)DNA轉(zhuǎn)染，或干擾素，或SiRNA轉(zhuǎn)染或其他有效的替代品，然后同時(shí)應(yīng)用(2)至 少有一個(gè)IKK，或CK2的或GSK3b抑制劑，然后，(3)再順序應(yīng)用WST-Ic任何有效的替代物， 從而成為更適宜的用法。此法活用于在此以上及以下的說(shuō)明。本發(fā)明用于治療癌癥的另一個(gè)用法特點(diǎn)是按照以下順序(I)DNA轉(zhuǎn)染，或干擾素，或SiRNA轉(zhuǎn)染或其他有效的替代品，然后同時(shí)應(yīng)用(2)至 少有一個(gè)IKK，或CK2的或GSK3b抑制劑，然后，(3)再順序應(yīng)用WST-Ir成分中的IEA的有 效的替代物，從而成為更適宜的用法。此法適用于在此以上及以下的說(shuō)明。本發(fā)明用于治療癌癥的另一個(gè)用法特點(diǎn)是按照以下順序(I)DNA轉(zhuǎn)染，或干擾素，或SiRNA轉(zhuǎn)染或其他有效的替代品，然后同時(shí)應(yīng)用(2)至 少有一個(gè)IKK，或CK2的或GSK3b抑制劑，然后，(3)再順序應(yīng)用WST-Ir成分中任何有效的 有效替代物，從而成為更適宜的用法。此法適用與在此以上及以下的說(shuō)明。本發(fā)明用于治療癌癥的另一個(gè)用法特點(diǎn)是按照以下順序(I)DNA轉(zhuǎn)染，或干擾素，或SiRNA轉(zhuǎn)染或其他有效的替代品，然后同時(shí)應(yīng)用(2)至 少有一個(gè)IKK，或CK2的或GSK3b抑制劑，然后，(3)再順序應(yīng)用WST-Ir中任何有效成分及 其中任何有效成分的有效替代物的各種組合，從而成為更適宜的用法。此法適用于在此以 上及以下的說(shuō)明。至此，本發(fā)明提供了以有效劑量的WST-Ir及其有效的替代品作為為癌癥病人的治療方法。 優(yōu)化的治療濃度可能會(huì)不同于作為細(xì)胞增殖測(cè)定劑的WSTlr中每一個(gè)成分的濃度。每一個(gè)組成成分及其有效替代物的最適濃度也會(huì)不同。體內(nèi)應(yīng)用的最適濃度與體外的 應(yīng)用濃度也會(huì)不同。體外mPMS的有效濃度范圍為20-601microM，WST-lc，0. l-lmM，WST_3， 0. 1-lmM，并溶于藥用介質(zhì)。 根據(jù)我們所擁有的最有效的數(shù)據(jù)WST-Ir，WST-3+mPMS和WST-3是最優(yōu)選的化合物 與試劑組份。由此，本發(fā)明提供了以至少一個(gè)有效劑量的WST-Ir及其有效的替代品作為為癌 癥病人的治療方法。此夕卜，本發(fā)明專門提供了應(yīng)用WST-Ir需要的的適宜的治療時(shí)間為，WST-Ir需與癌 細(xì)胞直接接觸15分鐘至8小時(shí)。多數(shù)WST-Ir的治療時(shí)間為30分鐘至4小時(shí)。更適宜的 WST-Ir的治療時(shí)間為2-4小時(shí)?？蛇m用與此治療的腫瘤包括但不限于前列腺，結(jié)腸直腸，胰腺，宮頸癌，胃癌，子 宮內(nèi)膜癌，腦癌，肝癌，膀胱癌，卵巢癌，睪丸癌，頭頸部腫瘤，皮膚(包括黑色素瘤和基底細(xì) 胞癌)，內(nèi)皮層癌，食道癌，乳腺癌，橫紋肌肉瘤，結(jié)締組織腫瘤，肺癌(包括小細(xì)胞肺癌和非 小細(xì)胞癌)，腎上腺癌，甲狀腺癌，腎癌，或骨；膠質(zhì)瘤，間皮瘤腎細(xì)胞癌，胃癌，肉瘤，絨毛膜 癌，皮膚基底癌，睪丸精原細(xì)胞瘤，和肉瘤。四。組合療法與抑制劑和WST-Ir，用于癌癥治療本發(fā)明提供了誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡，抑制腫瘤生長(zhǎng)，用于治療腫瘤的新方法。根據(jù)本發(fā) 明的規(guī)定，已發(fā)現(xiàn)的PUC19質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染及其有效替代品和IKK抑制劑組合應(yīng)用具有促進(jìn) 協(xié)同抑制癌癥細(xì)胞生長(zhǎng)和腫瘤的生長(zhǎng)和促進(jìn)協(xié)同抑制IKK抑制劑的有效替代品的誘導(dǎo)癌 細(xì)胞死亡的作用。由此，本發(fā)明提供了一個(gè)由PUC19質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染，或其至少一個(gè)有效的 替代品，至少有一個(gè)IKK抑制劑，和WST-lr，及其有效替代藥物聯(lián)合組成的用于治療癌癥， 腫瘤的藥用組分及治療應(yīng)用步奏和方法。本發(fā)明還提供了一個(gè)聯(lián)合應(yīng)用干擾素，至少一個(gè) IKK抑制劑或其效替代物，和WST-I或至少一個(gè)WST-Ir的有效替代物作為治療腫瘤的有效 方法。此外，本發(fā)明還提供了聯(lián)合應(yīng)用轉(zhuǎn)染siRNA及其有效替代品，至少一個(gè)IKK抑制劑和 至少一個(gè)WST-Ir或至少之一個(gè)WST-Ir的有效替代品治療癌癥的方法。該DNA轉(zhuǎn)染，可由以下替代物取代1)至少一個(gè)合適劑量的干擾素，或2)至少有 一個(gè)特異siRNA針對(duì)至少一個(gè)如前所述的基因，或3)針對(duì)至少有一個(gè)如前面所述的目標(biāo) 基因和/或其基因產(chǎn)物的化合物或小分子抑制劑4)針對(duì)至少有一個(gè)如前面所述的目標(biāo)基 因和/或其基因產(chǎn)物的抗體，或5)針對(duì)至少有一個(gè)如前面所述的目標(biāo)基因和/或其基因 產(chǎn)物的反義RNA，6)針對(duì)至少有一個(gè)如前面所述的目標(biāo)基因和/或其基因產(chǎn)物的shRN A， 7)針對(duì)至少有一個(gè)如前面所述的目標(biāo)基因和/或其基因產(chǎn)物的反義括何干算gim寡核甘 酸(antisense-oligo)』)針對(duì)至少有一個(gè)如前面所述的目標(biāo)基因和/或其基因產(chǎn)物的顯 性負(fù)DNA載體，9)針對(duì)至少有一個(gè)如前面所述的目標(biāo)基因和/或其基因產(chǎn)物的peptide和 polypeptide。以上所述的目標(biāo)靶基因包括，但不限于，(I)Homo sapiens transient receptor potential cation channel，subfamily C，member 6 (TRPC6, GeneID :7225)， mRNA(gi119923256 INM_004621. 3) synonyms :TRP6, FSGS2, FLJ11098(SEQ ID #2，#6)，(2)Homo sapiens SH3 禾口 PX domains 2B (SH3PXD2B)，mRNA (· (SH3PXD2B，GeneID :285590)， mRNA(NM_001017995) synonyms :H0FI ；FLJ20831 ；KIAA1295 (SEQ ID #3，#7)，(3)Homo sapiensmembrane associated guanylate kinase，WW and PDZ domain containing 3(MAGIKK，GeneID :260425)，transcriptvariant 2，mRNA(gi|23097339|NM—152900. 1) synonyms :MAGI-3，MGC163281 (SEQ ID #4，#8)，禾口 (4)the Homosapiens transmembrane protein 182 (TMEM182，GeneID : 130827)，mRNA(gi|40255064|NM—144632. 2)(SEQ ID #5， #9)·與如上所述相應(yīng)的基因產(chǎn)物包括，但不限于這些基因的mRNA和蛋白質(zhì)。上述siRNA以及作為siRNA靶目標(biāo)的基因的核甘酸序列也可包括這些基因的周邊 的核甘酸序列。這些序列存于“NCBI Blast-pUC19-Human-Transcripts and genome (2686 letters)”，“NCBI Blast_siRNA2 Nucleotidesequence(241etters)"and "NCBI Blast_ pcDNA3 Nucleotide sequence (5448 letters)，，，NCBI Blast-pUC19-Human_Transcripts and genome 之中.至少一個(gè)干擾素可以選擇從I型干擾素包括亞科，但不限于IFNaA，IFNaB, IFNa C，IFNaD, IFNa F，IFNaG, IFNa H，IFNa I，IFNa J, IFNa K，IFNa 4b，IFNa WA，and IFN α .。
用于以上所述的癌癥治療的干擾素的有效的濃度為10單位/毫升或更低。適用的IKK抑制劑包括任何所有具有抑制IKK活性的化合物性。如上所述至少一個(gè)IKK抑制劑包括，但不限于以下各組的化合物 1)已知具有抑制 IKK 活性的化合物SPC839 (Signal Pharmaceutical Inc.)， Anilino-Pyrimidine Derivative(Signal Pharmaceutical Inc.)，PS1145 (Millennium Pharmaceutical Inc.)， BMS-345541^(IKK inhibitor III， Bristol-Myers Squibb PharmaceuticalResearch Institute)，SC-514*(SmithkiIne Beecham Corp.)，Amino-imidazolecarboxamide derivative (SmithkilneBeecham Corp.)， Ureudo-thiophenecarboxamide derivatives (AstraZeneca)，Diarylpybidine derivative(Bayer) , Pyridooxazinone derivative(Bayer) , Indolecarboxamide derivative (Aventis Pharma)，Benzoimidazole carboxamidederivative (Aventis Pharma)，Pyrazolo[4,3-c]quinoline derivative (Pharmacia Corporation), Imidaz olylquinoline-carbxaldehyde semicarbazide derivative (Tulark Inc.)，Pyridyl Cyanoguanidine derivate(Leo Pharma)，IkB KinaseInhibitor Peptide (CalBiochem)， IKK-2 Inhibitor IV[5-(p-Fluoropheny1)-2-ureido]thiophene-3-carboxamide (CalBiochem)，IKK Inhibitor II (Wedelolactone(CalBiochem)，IKK Inhibitor VII (CalBiochem)，IKK_2Inhibitor V (N- (3，5-Bis-trifluoromethylphenyl)-5-chloro-2-hydroxybenzamide IMD-0354，CalBiochem)，IKK-2 InhibitorVI (5-Phenyl-2-ureido) thiophene-3-carboxamide，CalBiochem)，IKK-2 Inhibitor VIII (ACHP 2-Amino_6-(2_(c yclopropyImethoxy)-6-hydroxyphenyl)~4~(4-piperidinyl)-3-pyridinecarbonitrile, CalBiochem).2)在一些特殊的體現(xiàn)，本發(fā)明所述IKK抑制劑組還可包括先前已被列為抗腫瘤 齊[J，包括但不限于PS1145Millennium Pharmaceutical Inc.)，BMS-345541*(IKK inhibitorIll, Bristol-Myers Squibb Pharmaceutical Researchlnstitute)。如上文所述，適合于WST-Ir和至少一個(gè)的WST-Ir的有效替代品包括，但不限于 WST-Ir和WST-Ir的每一個(gè)組成成分及其有效的代替品包括WST_lr及其水溶性四唑鹽得 替代物，和電子中間受體，mPMS,由所有這些有效替代品可能的組合而成的有效替代物，以 及這些WST-I和其每一個(gè)組成WST-Ir的有效的替代品的水溶性四唑鹽和電子中間受體的 單獨(dú)成分，在最適濃度并溶于藥用介質(zhì)或左劑。本發(fā)明的一個(gè)要點(diǎn)是，本發(fā)明所選用的用于腫瘤治療的pUC19質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染或其 有效的替代品，至少有一個(gè)IKK抑制劑和WST-lr，或者至少一個(gè)WST-Ir的有效替代品可按 任何類型的順序進(jìn)行治療。然而，PUC19質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染或干擾素治療，或siRNA轉(zhuǎn)染或其他 有效替代品，至少有一個(gè)IKK抑制劑和WST-Ir或WST-Ir的至少一個(gè)有效的替代品可同時(shí) 或順序應(yīng)用與治療病人和細(xì)胞。換句話說(shuō)，可首先進(jìn)行PUC19質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染，或首先應(yīng)用至 少有一個(gè)IKK抑制劑，或WST-lr，或至少一個(gè)WST-Ir的替代型物，或者pUC19質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn) 染，至少有一個(gè)IKK抑制劑和WST-Ir或至少有一個(gè)WST-Ir的替代物可在同一時(shí)間進(jìn)行應(yīng) 用。此外，當(dāng)如上面所述的PUC19質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染，換為siRNA轉(zhuǎn)染，干擾素應(yīng)用，或針對(duì)靶目 標(biāo)基因的小分子，與至少有一個(gè)IKK抑制劑和WST-lr，或者至少有一個(gè)WST-Ir的有效的替 代物應(yīng)用，這些化合物的應(yīng)用可以以任何順序進(jìn)行?？梢赃m用于這一治療方法的腫瘤包括癌和肉瘤，但不限于以上所述的癌癥和腫 瘤。不過(guò)，具有異常合NF- κ B活性的癌癥和腫瘤細(xì)胞對(duì)此治療方法會(huì)更加敏感。 本發(fā)明在此還包括了另一個(gè)可為誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡和抑制癌癥病人的腫瘤的方 法。根據(jù)此本發(fā)明，已發(fā)現(xiàn)聯(lián)合應(yīng)用在有效濃度的黃酮類(flavonoids)成分，apigenin，或 其有效的替代品，或IKK抑制劑與有效濃度的WST-Ir或其有效替代品可協(xié)同誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞 死亡。由此，本發(fā)明提供了一種應(yīng)用于腫瘤治療的藥物組分和實(shí)際應(yīng)用的步鄹與方法。此 方法包括聯(lián)合應(yīng)用有效劑量的黃酮類(flavonoids)成分，尤其是apigenin，或其有效的替 代品，或IKK抑制劑與有效濃度的WST-Ir或其有效替代品組成，并溶于藥用介質(zhì)中。從細(xì)胞或體內(nèi)移除這些化合物對(duì)于誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡是必要的。適用的黃酮(flavonoids)包括但不限于，apigenin和有效的替代品溶于藥用介 質(zhì)之中。如上所述至少一個(gè)IKK抑制劑包括，但不限于以下各組的化合物 1)已知具有抑制 IKK 活性的化合物SPC839 (Signal Pharmaceutical Inc.)， Anilino-Pyrimidine Derivative(Signal Pharmaceutical Inc.), PSl145(Millennium Pharmaceutical Inc.), BMS-345541* (IKK inhibitor III, Bristol-Myers Squibb PharmaceuticaIResearch Institute), SC-514*(SmithkiIne Beecham Corp.), Amino-imidazolecarboxamide derivative(SmithkilneBeecham Corp.), Ureudo-thiophenecarboxamide derivatives (AstraZeneca) , Diarylpybidine derivative (Bayer), Pyridooxazinone derivative (Bayer), Indolecarboxamide derivative (Aventis Pharma), Benzoimidazole carboxamidederivative (Aventis Pharma), Pyrazolo[4,3~c]quinoline derivative (Pharmacia Corporation), Imidaz olylquinoline-carbxaldehyde semicarbazide derivative(Tulark Inc.), Pyridyl Cyanoguanidine derivate (Leo Pharma), IkB KinaseInhibitor Peptide (CalBiochem),IKK-2 Inhibitor IV[5- (ρ-Fluoropheny1)-2-ureido]thiophene-3-carboxamide (CalBiochen)，IKK Inhibitor II (Wedelolactone(CalBiochem)，IKK Inhibitor VII (CalBiochem)，IKK-2Inhibitor V (N-(3，5~Bis~trifluoromethylpheny1)-5-chloro-2-hydroxybenzamide IMD-0354，CalBiochem)，IKK-2 InhibitorVI (5-Phenyl-2_ureido) thiophene-3-carboxamide，CalBiochem)，IKK_2Inhibitor VIII (ACHP 2-Amino_6-(2_( eyelopropyImethoxy)-6-hydroxyphenyl)~4~(4-piperidinyl)-3-pyridinecarbonitril e, CalBiochem).2)在一些特殊的體現(xiàn)，本發(fā)明所述IKK抑制劑組還可包括先前已被列為 抗腫瘤劑，包括但不限于 PS1145 MillenniumPharmaceutical Inc.)，BMS-345541* (IKK inhibitor III, Bristol-Myers Squibb Pharmaceutical Research Institute)。如上文 所述，適合于WST-Ir和至少一個(gè)的WST-Ir的有效替代品包括，但不限于WST-IR和WST-Ir 的每一個(gè)組成成分及其有效的代替品包括=WST-Ir及其水溶性四唑鹽得替代物，和電子中 間受體，mPMS,由所有這些有效替代品可能的組合而成的有效替代物，以及這些WST-I和其 每一個(gè)組成WST-Ir的有效的替代品的水溶性四唑鹽和電子中間受體的單獨(dú)成分，在最適 濃度并溶于藥用介質(zhì)或左劑。Apigenin的有效濃度可能因不同類型細(xì)胞的而不同。體外首選的劑量是在 IO-IOOmM(微摩)范圍。由此以上及由此一下的關(guān)于WST-Ir及其有效的替代品的每一個(gè)組分的有效濃度可能會(huì)不同于作為細(xì)胞增殖測(cè)定劑的WSTlr中每一個(gè)成分的濃度。每一個(gè)組成成分及其有 效替代物的最適濃度也會(huì)不同。體內(nèi)應(yīng)用的最適濃度與體外的應(yīng)用濃度也會(huì)不同。體外應(yīng) 用WST-Ir細(xì)胞增生試劑的最適濃度是3-10%于藥用介質(zhì)中。體外mPMS的有效濃度范圍為 20-601 μ M, WST-lc,0. 1-lmM, WST-3,0. 1-lmM，并融于藥用介質(zhì)。本發(fā)明的另一個(gè)要點(diǎn)是，本發(fā)明所選用的用于腫瘤治療的WST-Ir或其有效的替 代品，至少有一個(gè)IKK抑制劑和apigenin，或者至少一個(gè)apigenin的有效替代品可按任何 類型的順序進(jìn)行治療。然而，apigenin，或apigenin的有效替代品，至少有一個(gè)IKK抑制 劑和WST-Ir或WST-Ir的至少一個(gè)有效的替代品可同時(shí)或順序應(yīng)用與治療病人和細(xì)胞。換 句話說(shuō)，可首先應(yīng)用apigenin，或首先應(yīng)用至少有一個(gè)IKK抑制劑，或WST_lr，或至少一個(gè) WST-Ir的替代型物，或者apigenin，至少有一個(gè)IKK抑制劑和WST-Ir或至少有一個(gè)WST-Ir 的替代物可在同一時(shí)間進(jìn)行應(yīng)用。此發(fā)明的治療首選順序是同時(shí)應(yīng)用WST-Ir或WST-Ir的有效替代品和apigenin 或apigenin的有效替代品，或者至少有一個(gè)IKK抑制劑，然后加用apigenin或IKK抑制劑 保持另一個(gè)24小時(shí)。本發(fā)明的另一個(gè)要點(diǎn)是，是所有上述和以下的體現(xiàn)，治療用的WST-Ir需與細(xì)胞接 觸15分鐘至8小時(shí)。適宜的時(shí)間在30分鐘至4小時(shí)。最佳時(shí)間是2-4小時(shí)。需移除WST-Ir 或其有效的替代品對(duì)于促使細(xì)胞死亡。由此，本發(fā)明提供了治療癌癥病人的方法。此治療方法需要應(yīng)用有效劑量的至少 一個(gè)WST-Ir或其有效的替代品并與apigenin，或者至少一個(gè)其有效替代品于藥用介質(zhì)中 聯(lián)合應(yīng)用。由此，本發(fā)明提供了治療癌癥病人的方法。此治療方法需要應(yīng)用有效劑量的至少 一個(gè)WST-Ir或其有效的替代品并與至少一個(gè)上述的IKK抑制劑，于藥用介質(zhì)中聯(lián)合應(yīng)用。
可適用與此治療的腫瘤包括但不限于前列腺，結(jié)腸直腸，胰腺，宮頸癌，胃癌，子 宮內(nèi)膜癌，腦癌，肝癌，膀胱癌，卵巢癌，睪丸癌，頭頸部腫瘤，皮膚(包括黑色素瘤和基底細(xì) 胞癌)，內(nèi)皮層癌，食道癌，乳腺癌，橫紋肌肉瘤，結(jié)締組織腫瘤，肺癌(包括小細(xì)胞肺癌和非 小細(xì)胞癌)，腎上腺癌，甲狀腺癌，腎癌，或骨；膠質(zhì)瘤，間皮瘤腎細(xì)胞癌，胃癌，肉瘤，絨毛膜 癌，皮膚基底癌，睪丸精原細(xì)胞瘤，和肉瘤。適用于至少一個(gè)IKK抑制劑與WST-Ir及有效替代品聯(lián)合治療方法的腫瘤包括，但 不僅限于部分癌，與肉瘤，如黑色素細(xì)胞瘤，如=SK-MelUP T294黑色素細(xì)胞瘤細(xì)胞。本發(fā)明還提供了協(xié)同抑制癌細(xì)胞中NF-kB活性的方法。根據(jù)本發(fā)明，當(dāng)用無(wú)磷酸 激酶活性的IKKl-KA和IKK2-KA同時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞pUC19質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染可起到協(xié)同抑制NF_kB 在癌細(xì)胞中活性的作用。聯(lián)合應(yīng)用WST-Ir或WST-Ir的有效替代物這種抑制作用，可進(jìn)一 步加強(qiáng)這種抑制作用。與上述同理，pUC19質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)染可由以下方法代替1)至少一個(gè)合適劑量的干 擾素，或2)至少有一個(gè)特異siRNA針對(duì)至少一個(gè)如前所述的基因，或3)針對(duì)至少有一個(gè)如 前面所述的目標(biāo)基因和/或其基因產(chǎn)物的化合物或小分子抑制劑4)針對(duì)至少有一個(gè)如前 面所述的目標(biāo)基因和/或其基因產(chǎn)物的抗體，或5)針對(duì)至少有一個(gè)如前面所述的目標(biāo)基因 和/或其基因產(chǎn)物的反義RNA，6)針對(duì)至少有一個(gè)如前面所述的目標(biāo)基因和/或其基因產(chǎn) 物的反義寡核甘酸(antisense-oligo)，并與至少一個(gè)IKK抑制劑聯(lián)合應(yīng)用。至少一個(gè)干擾素包括，但不限于IFNaA, IFNa B, IFNa C, IFNa D, IFNa F, IFNa G, IFNa H, IFNa I，IFNa J, IFNa K, IFNa 4b, IFNa WA, IFNb，IFNg or IL 6。可作為目標(biāo)基因，并作為該siRNA，shRNA,小分子抑制劑，多肽抑制劑，抗體，反 義RMA，反義寡核苷酸，和抗體的靶目標(biāo)的mRMA和蛋白包括，但不限于(I)Homo sapiens transient receptor potentialcation channel, subfamily C, member 6(TRPC6, SEQ ID 2,6), (2)Homo sapiens SH3 and PX domains 2B(SH3PXD2B, SeQ ID #3，#7)，(3) Homo sapiens membrane associated guanylate kinase, Wff and PDZdomain containing 3(MAGIKK,SeQ ID #4，#8)， (4)the Homo sapiens transmembrane protein 182(TMEM182, SeQ ID #5, #9)and (5)the C6orfl08(Seq ID #14，#15)。如上文所述，適合于WST-Ir和至少一個(gè)的WST-Ir的有效替代品包括，但不限于 WST-IR和WST-Ir的每一個(gè)組成成分及其有效的代替品包括WST_lr及其水溶性四唑鹽得 替代物，和電子中間受體，mPMS,由所有這些有效替代品可能的組合而成的有效替代物，以 及這些WST-I和其每一個(gè)組成WST-Ir的有效的替代品的水溶性四唑鹽和電子中間受體的 單獨(dú)成分，在最適濃度并溶于藥用介質(zhì)。如上所述至少一個(gè)IKK抑制劑包括，但不限于以下各組的化合物 1)已知具有抑制 IKK 活性的化合物SPC839 (Signal Pharmaceutical Inc.)， Anilino-Pyrimidine Derivative(Signal Pharmaceuticallnc.), PS1145(Millennium Pharmaceutical Inc.), BMS-345541* (IKK inhibitor III, Bristol-MyersSquibb Pharmaceutical Research Institute), SC-514*(Smithkilne Beecham Corp.), Amino-imidazolecarboxamide derivative(Smithkilne Beecham Corp.), Ureudo-thi ophenecarboxamidederivatives(AstraZeneca)， Diarylpybidine derivative(Bayer)， Pyridooxazinone derivative (Bayer), Indolecarboxamide derivative (AventisPharma)，Benzoimidazole carboxamide derivative (AventisPharma), Pyrazolo-4, 3-c]quinoline derivative(Pharmacia Corporation)， Imidazolylquinoline-car bxaldehyde semicarbazide derivative(Tulark Inc.)， Pyridyl Cyanoguanidine derivate (Leo Pharma), IkB Kinase Inhibitor Peptide (CalBiochem), IKK-2 Inhibitor IV [5- (p-Fluorophenyl)-2-ureido]thiophene-3-carboxamide(CalBioche m)，IKK Inhibitor II(Wedelolactone(CalBiochem)，IKKInhibitor VII (CalBiochem)， IKK-2 Inhibitor V (N- (3，5-Bis-trifluoromethylpheny1)-5-chloro-2-hydrox ybenzamide IMD-0354, CalBiochem), IKK-2 Inhibitor VI (5-Phenyl-2-ureido) thiophene-3-carboxamide， CalBiochem)， IKK-2 Inhibitor VIII(ACHP 2-Amino_6(2_( eyelopropyImethoxy)-6-hydroxyphenyl)~4~ (4-piperidinyl)-3-pyridinecarbonitri1 e, CalBiochem).2)在一些特殊的體現(xiàn)，本發(fā)明所述IKK抑制劑組還可包括先前已被列為 抗腫瘤劑，包括但不限于 PS1145 Millennium Pharmaceutical Inc.)，BMS-345541* (IKK inhibitor III,Bristol-Myers Squibb Pharmaceutical Research Institute)。首選 IKK 抑制劑是可以抑制IKKl和IKK2磷酸激酶的活性的IKK抑制劑，。本發(fā)明提供了另一個(gè)誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡，和抑制腫瘤的方法。按照本發(fā)明的規(guī)定，聯(lián) 合應(yīng)用GSK3bata抑制劑和CK2的抑制劑，同時(shí)合用WST-Ir或至少其中一個(gè)WST-Ir的有效 替代物可有協(xié)同抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。由此，本發(fā)明提供了一個(gè)作用于部分癌癥細(xì)胞和癌 癥病人治療的藥物組分。這一藥物組分包括至少一個(gè)GSK3bata抑制劑，至少有一個(gè)CK2的 抑制劑和WST-Ir或至少其中一個(gè)WST-Ir的有效替代物于藥用載體。同時(shí)，本發(fā)明還提供了 一種治療腫瘤病人的有效方法，包括聯(lián)合應(yīng)用至少一個(gè)CK2的抑制劑和至少一個(gè)GSK3bata 抑制劑。適用于此治療方法的GSK酶3bata抑制劑包括任何例如具有GSK酶3bata抑制劑 活性的化合物，如氯化鋰。適用于CK2的抑制劑，包括但不限于芹菜素apigenin。
上述至少一個(gè)CK2的抑制劑選自，但不限于TBB，TBBz，大黃素(emodin)，CK2的 抑制劑3 (Sigma)的化合物組成的組分。如上文所述，適合于WST-Ir和至少一個(gè)的WST-Ir的有效替代品包括，但不限于 WST-Ir和WST-Ir的每一個(gè)組成成分及其有效的代替品包括WST_lr及其水溶性四唑鹽得 替代物，和電子中間受體，mPMS,由所有這些有效替代品可能的組合而成的有效替代物，以 及這些WST-I和其每一個(gè)組成WST-Ir的有效的替代品的水溶性四唑鹽和電子中間受體的 單獨(dú)成分，在最適濃度并溶于藥用介質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明，用于癌細(xì)胞或腫瘤病人治療的至少有一個(gè)GSK3bata抑制劑，和至少 一個(gè)CK2的抑制劑，可同時(shí)或相繼的應(yīng)用。換言之，可首先應(yīng)用至少有一個(gè)GSK3bata抑制 劑或，首先應(yīng)用至少有一個(gè)CK2的抑制劑，或者可同時(shí)應(yīng)用至少有一個(gè)GSK3bata抑制劑和 至少一個(gè)CK2的抑制劑。此外，當(dāng)使用一個(gè)以上的GSK3bata抑制劑和/或CK2的抑制劑， 這種化合物可以按任何順序應(yīng)用?？捎糜诖税┌Y治療方法的腫瘤細(xì)胞包括，但不限于UM-SCC-6細(xì)胞。此癌癥治療方 法也可以用于，但不限于治療本說(shuō)明中所列的癌癥。本發(fā)明提供了增強(qiáng)或協(xié)同化療藥物對(duì)癌癥的治療作用的效果影響的另一個(gè)方法。 基于本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)，PUC19質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染還協(xié)同加強(qiáng)化療藥物抑制腫瘤生長(zhǎng)，并促進(jìn)癌細(xì)胞 死亡。因此，本發(fā)明提供了一個(gè)由聯(lián)合應(yīng)用PUC19質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染病人或至少一個(gè)其有效替代品作為癌癥治療藥物成分和至少一個(gè)化療藥物的治療方法。加用在藥用介質(zhì)中的WST-Ir 或WST-Ir的有效替代物與上述療法聯(lián)合應(yīng)用可進(jìn)一步提高這種誘導(dǎo)癌癥細(xì)胞死亡的作 用。本發(fā)明還提供了一種應(yīng)用至少一個(gè)有效劑量的DNA轉(zhuǎn)染，或DNA轉(zhuǎn)染的有效替代品，并 聯(lián)合應(yīng)用至少一個(gè)化療藥物作為治療癌細(xì)胞或癌癥的方法。在首選的體現(xiàn)，作為最適宜的 用于轉(zhuǎn)染的DNA是此前所屬的原核細(xì)胞克隆質(zhì)粒pUC19 (SEQ ID 1)。至少一個(gè)pUC19質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染的有效替代品包括但不限于1)至少一個(gè)合適劑量 的干擾素，或2)至少有一個(gè)特異siRNA針對(duì)至少一個(gè)如前所述的基因，或3)針對(duì)至少有一 個(gè)如前面所述的目標(biāo)基因和/或其基因產(chǎn)物的化合物或小分子抑制劑4)針對(duì)至少有一個(gè) 如前面所述的目標(biāo)基因和/或其基因產(chǎn)物的抗體，或5)針對(duì)至少有一個(gè)如前面所述的目標(biāo) 基因和/或其基因產(chǎn)物的反義RNA，6)針對(duì)至少有一個(gè)如前面所述的目標(biāo)基因和/或其基 因產(chǎn)物的shRN A，7)針對(duì)至少有一個(gè)如前面所述的目標(biāo)基因和/或其基因產(chǎn)物的反義括何 干算gim寡核甘酸(antisense-oligohS)針對(duì)至少有一個(gè)如前面所述的目標(biāo)基因和/或 其基因產(chǎn)物的顯性負(fù)DNA載體，9)針對(duì)至少有一個(gè)如前面所述的目標(biāo)基因和/或其基因產(chǎn) 物的 peptide 禾口 polypeptide。適用的干擾素包括亞科，但不限于IFNa A, IFNa B, IFNa C，IFNa D，IFNa F, IFNa G, IFNa H, IFNa I，IFNa J, IFNa K, IFNa 4b, IFNa WA, and IFNa, IFNg and Interlukine-6(IL-6)。本發(fā)明的首選的干擾素是IFNa和IFNb亞族。用于以上所述的癌 癥治療的干擾素的有效的濃度為10單位/毫升或更低?？勺鳛槟繕?biāo)基因，并作為該siRNA，shRNA,小分子抑制劑，多肽抑制劑，抗體，反義 RNA，反義寡，和抗體的靶目標(biāo)的mRMA和蛋白包括，但不限于(I)Homo sapiens transient receptor potential cationchannel, subfamily C, member 6(TRPC6, SEQ ID 2,6), (2)Homo sapiens SH3 and PX domains 2B(SH3PXD2B, SeQ ID 3,7), (3)Homo sapiens membrane associated guanylate kinase, Wff and PDZ domaincontaining 3(MAGIKK, SeQ ID 4,8), (4)the Homo sapiens transmembrane protein 182 (TMEM182,SeQID 5,9)and(5) the C6orfl08(Seq ID 14，15)。相應(yīng)的基因的產(chǎn)物包括，但不限于，相應(yīng)的從這些基因轉(zhuǎn)錄的核甘酸序列和由此 產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。上述siRNA和shRNA以及作為siRNA靶目標(biāo)的基因的核甘酸序列也可包括這些 基因的周邊的核甘酸序列。這些序列存于附件:"NCBI Blast-pUC19-Human-Transcripts and genome(2686 letters)"NCBI Blast_siRNA2 Nucleotide sequence(24 letters)，，and ‘‘NCBI Blast_pcDNA3 Nucleotidesequence (5448 letters)，，，NCBI Blast-pUC19-Human_Transcripts and genome 之中.如上所述，適用的siRNAs 包括上述 siRNAl(SEQ ID No 10), siRNA2(SEQ ID No: 11)，和siRNA3(SEQ ID No 12)以及所有潛在的可配對(duì)于人類基因組DNA序列的pUC19質(zhì) 粒DNA序列片段(IO-IOObp或更長(zhǎng))。這些核甘酸序列和其相應(yīng)的基因列于題為“NCBI Blast-pUC19-Human-Transcripts andgenome(2686 letters)，，禾口 "NCBI Blast_siRNA2 Nucleotide sequence (24 letters) ”的附件。通常，這些siRNA序列變化與基因的確切序 列比較可以高達(dá)40%。此外，這些siRNAs可以被匹配于相應(yīng)的靶基因序列的其他部分的 siRNA和/或shRNA替代。作為小分子抑制劑，多太(ρ印tide)抑制劑，抗體，反義RNA，反義寡核甘酸和顯性負(fù)DNA的質(zhì)粒，靶目標(biāo)的基因產(chǎn)物，以及作為上述siRNA靶目標(biāo)的基因 包括，但不限于(1)TRPC6, (SEQ ID No 2,6) (2)SH3PXD2B, (SEQ ID No :3，7)，(3)MAGIKK, (SEQ ID No 4,8), (4) TMEM182,, (SEQ ID No 5,9), (5) C6orf 108 (SEQ ID No: 14，15)。如上文所述，適合于WST-Ir和至少一個(gè)的WST-Ir的有效替代品包括，但不限于WST-Ir和WST-Ir的每一個(gè)組成成分及其有效的代替品包括WST_lr及其水溶性四唑鹽得 替代物，和電子中間受體，mPMS,由所有這些有效替代品可能的組合而成的有效替代物，以 及這些WST-I和其每一個(gè)組成WST-Ir的有效的替代品的水溶性四唑鹽和電子中間受體的 單獨(dú)成分，在最適濃度并溶于藥用介質(zhì)或。合適的化療藥物包括但不限于紫杉醇(Taxol.RTM)，順鉬，多西紫杉醇，卡鉬，長(zhǎng) 春新堿，長(zhǎng)春堿，甲氨蝶呤，環(huán)磷_胺，中華映管-11，5氟尿嘧啶(5-FU的)，吉西他濱，雌莫 司汀，卡莫司汀，阿霉素(阿霉素)，足葉乙_，三氧化二砷，伊立替康，和埃博霉素衍生物。首 選的化療藥物是紫杉醇(Taxol. RTM。)，順鉬，和5氟尿嘧啶(5-FU)。本發(fā)明的一個(gè)要點(diǎn)是，首選治療應(yīng)用順序是首先應(yīng)用PUC19質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的DNA或至 少是它的有效替代品，然后應(yīng)用化療藥物。PUC19DNA轉(zhuǎn)染。然而，pUC19質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染或至 少一個(gè)其有效的替代品之一可與化療藥物同時(shí)或相繼應(yīng)用于治療給予癌細(xì)胞或病人。換句 話說(shuō)，可首先應(yīng)用PUC19質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染，也可首先應(yīng)用化療藥物。可適用于此治療的腫瘤包括但不限于上述癌和肉瘤。除了上述所有情況，本發(fā)明還提供了另外的抑制NF-kappaB活性和抑制腫瘤生長(zhǎng) 的方法。根據(jù)本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)，用無(wú)磷酸激酶活性的IKKl和IKK2(IKK_1-KA和IKK2-KA)同時(shí) 轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞可協(xié)同抑制NF- κ B的活性和腫瘤的生長(zhǎng)。如應(yīng)用無(wú)磷酸激酶活性的IKKl和 IKK2 (IKK1_-KA和IKK2-KA)同時(shí)轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞以將抑制NF-kappaB的活性，再同時(shí)聯(lián)合應(yīng) 用WST-Ir或至少一個(gè)WST-Ir的有效替代品，可進(jìn)一步抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)。由此，本說(shuō)明提供 了一個(gè)抑制NF- κ B的活性和腫瘤的藥用組分包括聯(lián)合應(yīng)用轉(zhuǎn)染至少一個(gè)IKKl-KA和至少 一個(gè)IKK2-KA以及同時(shí)合用WST-Ir或至少一個(gè)WST-Ir的有效替代型物于藥用介質(zhì)治療癌 癥病人。此外，本說(shuō)明還提供了同時(shí)抑制IKKl和IKK2磷酸激酶活性以有效的抑制NF-k B 的活性和/或?yàn)椴∪颂峁┲委煱┌Y的方法。有效抑制IKKl和IKK2激酶活性方法可由下列 方法替代應(yīng)用針對(duì)IKKl和/或IKK2的⑴siRNA⑵反義RNA，(3)反義寡脫氧核甘酸， (4)小分子抑制劑，(5)多太(ρ印tide)抑制劑，(6)抗體，單獨(dú)或同時(shí)以任何結(jié)合的方式聯(lián) 合應(yīng)用，尤其是與，WST-Ir或至少一個(gè)WST-Ir的有效替代品合用。如上所述IKK抑制劑包括，但不限于以下各組的化合物1)已知具有抑 制 IKK 活性的化合物SPC839 (Signal Pharmaceutical Inc.)，Anilino-Pyrimidine Derivative(Signal Pharmaceuti cal Inc.), PS1145(Millennium Pharmaceutical Inc. ), BMS-345541*(IKK inhibitor III, Bristol-Myers SquibbPharmaceutical Research Institute), SC-514*(Smithkilne Beecham Corp.), Amino-imidazolecar boxamidederivative(Smithkilne Beecham Corp.), Ureudo thiophenecarboxamide derivatives (AstraZeneca) , Diarylpybidine derivative(Bayer), Pyridooxazinone derivative (Bayer) , Indolecarboxamidederivative(Aventis Pharma), Benzoimidazole carboxamide derivative(Aventis Pharma), Pyrazolo-4, 3_c] quinoline derivative(Pharmacia Corporation) , Imidazolylquinoline-carbxaldehyde semicarbazidederivative(Tulark Inc.)，Pyridyl Cyanoguanidine derivate (Leo Pharma)，IkB Kinase InhibitorPeptide (CalBiochem)，IKK-2 Inhibitor IV [5 -(p-Fluorophenyl)-2-ureido]thiophene-3-carboxamide(Ca IBiochem)，IKK Inhibitor 11 (WedeIolactone (CalBiochem), IKK Inhibitor VII (CalBiochem)，IKK-2 Inhibitor V (N (3，5_Bis trifluoromethylpheny1)_5 chloro 2 hydroxybenzamideIMD-0354, CalBiochem), IKK-2 Inhibitor VI (5-Phenyl-2-ureido) thiophene-3-carboxamide， CalBiochem)， IKK-2 Inhibitor VIII(ACHP 2-Amino_6-(2_( eyelopropyImethoxy)-6-hydroxyphenyl)~4~(4-piperidinyl)-3-pyridinecarbonitril e, CalBiochem).2)在一些特殊的體現(xiàn)，本發(fā)明所述IKK抑制劑組還可包括先前已被列為 抗腫瘤劑，包括但不限于 PS1145 Millennium Pharmaceutical Inc.)，BMS-345541* (IKK inhibitorIII, Bristol-Myers Squibb Pharmaceutical Research Institute)。本發(fā)明的一個(gè)要點(diǎn)是，應(yīng)用轉(zhuǎn)染無(wú)磷酸激酶活性的IKKl-KA和IKK2-KA，或本說(shuō)明 上述的其他任何方式抑制IKK的活性，和聯(lián)合應(yīng)用如上所述WST-lr，或其至少一種WST-Ir 的有效替代品，可同時(shí)應(yīng)用或順序應(yīng)用。換句話說(shuō)，可首先進(jìn)行轉(zhuǎn)染無(wú)磷酸激酶活性的 IKKl-KA和IKK2-KA，或應(yīng)用本說(shuō)明上述的其他任何方式抑制IKK的活性，或首先應(yīng)用NOX 的底物/活化劑(WST-lr，或其至少一種WST-Ir的有效替代品)，或兩者可同時(shí)聯(lián)合應(yīng)用。 如同時(shí)應(yīng)用多余一個(gè)的IKK抑制劑，可以任何順序進(jìn)行。可適用與此方法的癌癥包括但不限于上述各種癌癥。本發(fā)明提供了另一個(gè)誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡，抑制腫瘤的方法。根據(jù)本發(fā)明，IKK抑制劑 或CK2的抑制劑與Stat3的抑制劑，stattic，或者至少為stattic的有效替代品聯(lián)合應(yīng)用 可得到協(xié)同促使癌細(xì)胞死亡，抑制腫瘤的生長(zhǎng)的作。由此，本發(fā)明提供了一個(gè)用于癌癥細(xì)胞 和癌癥治療的藥物組分，包括至少一個(gè)IKK抑制劑或至少一個(gè)CK2的抑制劑，加之stattic 或至少為一個(gè)stattic的有效的替代品于藥用介質(zhì)。此外，還提供了一種聯(lián)合應(yīng)用至少一 個(gè)IKK抑制劑或至少一個(gè)CK2的抑制劑，與stattic或至少為一個(gè)stattie的有效的替代 品治療癌癥的方法。適合的IKK抑制劑如前所述。適用的CK2的抑制劑，包括但不限于序 菜素(apigenin)。適用的Stat抑制劑需能抑制Stat磷酸化，激活和細(xì)胞核轉(zhuǎn)移的抑制劑， 包括，但不限于stattic。IKK抑制劑或CK2的抑制劑和stattic可以任何順序或方式的應(yīng) 用。首選的應(yīng)用方式是同時(shí)應(yīng)用。
五，給藥方式及藥品成分和化合物本發(fā)明涉及及的藥物成分，可以通過(guò)任何合適的方式給予，例如，通過(guò)注射，口服， 吸入，鼻腔或其他方法。一般來(lái)說(shuō)，本發(fā)明所包括的藥品成分還報(bào)括其他藥用的稀釋劑， 防腐劑，增溶劑，乳化劑，助劑和/或運(yùn)營(yíng)商載體。這些成分可以包括各種緩沖劑成分的 稀釋劑(如Tris-HCl，醋酸鹽，磷酸鹽)，pH值和離子強(qiáng)度，如清潔劑和助溶劑(例如，吐 溫80，Polysorbate80)添加劑，抗氧化劑(例如，抗壞血酸，焦亞硫酸鈉)，防腐劑(例如， Thimersol，苯甲醇)和膨脹的物質(zhì)(如乳糖，甘露醇)。這些成分可以被納入特殊微粒，如 聚乳酸，聚羥基酸等，或?qū)⒅|(zhì)體聚合化合物的工藝制作。這些成分可能會(huì)影響本發(fā)明的 藥物的物理性能，狀況，穩(wěn)定性，體內(nèi)釋放的速率和速度，藥物的體內(nèi)清除速體率。例如，見(jiàn) Remington’ sPharmaceutical Sciences，18th Ed. (1990， Mack Publishing Co. ， Easton， Pa. 18042)pages 1435-1712。本發(fā)明的藥物成分，可以，比如說(shuō)，在液態(tài)形式，或可以在干燥粉末狀(如凍干)。藥物組合物的應(yīng)用方法已在以上給予介紹。另一個(gè)要點(diǎn)是，本發(fā)明的藥物成分，可以通過(guò)可控釋系統(tǒng)提供，如使用靜脈注射， 植入滲透泵，皮膚貼劑，脂質(zhì)體，或其他給藥方式。在一特定的情況下，可使用泵給藥(見(jiàn) Langer, supra ；Sefton, CRC Crit.Ref. Biomed. Eng. (1987) 14 201 ；Buchwald et al., Surgery (1980)88 507 ；Saudek et al. , N. Engl. J. Med. (1989)321:574)。在另一些情況 下，可應(yīng)用高分子材料，(見(jiàn) Medical Applications ofControlled Release, Langer and Wise (eds. ), CRC Press :Boca Raton, Fla. (1974) ；Controlled DrugBioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball(eds. ) , Wiley :New York(1984) ；Ranger and Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. (1983)23:61 ；see also Levy etal.，Science (1985) 228 190 ；During et al.，Ann. Neurol. (1989)25 351 ； Howard et al.，J. Neurosurg. (1989)71 105).。在另一種情況下，控制釋放系統(tǒng)，可以放置 在動(dòng)物目標(biāo)組織附近，由此可只需要系統(tǒng)性給藥劑量的一小部分(見(jiàn)G00dS0n，in Medical Applications of Controlled Release, supra, (1984) vol. 2，pp. 115-138)。特別是,控釋 設(shè)備可以直入動(dòng)物異常的免疫激活或腫瘤部位附近。其他控制釋放系統(tǒng)在蘭格的綜述中介 紹((Science(1990)249 1527-1533)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明此發(fā)明涉及腫瘤細(xì)胞特異的細(xì)胞雕亡，對(duì)正常細(xì)胞沒(méi)有毒性，只作 用于腫瘤細(xì)胞。這項(xiàng)發(fā)明涉及的癌細(xì)胞死亡是之前從未報(bào)導(dǎo)的。其所涉及的機(jī)理可能是一 個(gè)新的細(xì)胞調(diào)節(jié)的途徑，仍需進(jìn)一步深入的癌究。。 雖然上面和下面已經(jīng)證明特定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和數(shù)據(jù)，一個(gè)從事腫瘤研究的專業(yè)人士 可通過(guò)閱讀本說(shuō)明所介紹的化合物名稱，劑量變化，應(yīng)用的順序及時(shí)間，所述藥物的有效的 替代物，可得到相同或類似的結(jié)果。這些藥物可以應(yīng)用在任何哺乳動(dòng)物的任何癌癥。發(fā)明 人指出在這個(gè)文件中沒(méi)有對(duì)任何說(shuō)明或任何后繼文件加以限制。發(fā)明人還指出，這項(xiàng)發(fā)明 可單獨(dú)應(yīng)用，也可與傳統(tǒng)的癌癥治療方法如化療和放療合用，但是，在此沒(méi)有任何限制這一 發(fā)明使用的范圍內(nèi)。此外，這對(duì)化療和放射療法的聯(lián)合使用，這個(gè)發(fā)明可減少化療或放療毒 性由于化療和放療的劑量。最后，此發(fā)明可能會(huì)進(jìn)一步增加腫瘤細(xì)對(duì)常規(guī)化療，放療的敏感 性，減少化療/輻射劑量。以上述的說(shuō)明和描述，并不是用于限制其發(fā)明的全部。應(yīng)用過(guò)程中還會(huì)進(jìn)行與上 述說(shuō)明一致的修改和變更。因此，應(yīng)該指出，該發(fā)明的范圍定義于權(quán)利要求及其相應(yīng)的描 述。本發(fā)明現(xiàn)通過(guò)在下面的示例進(jìn)行更詳細(xì)地說(shuō)明。在此聲明這些例子只會(huì)描述了本 發(fā)明的具體體現(xiàn)，但不以任何方式對(duì)此發(fā)明加以限制。此發(fā)明提供了序列數(shù)據(jù)。在某種程 度上，這些新的序列數(shù)據(jù)可作為開(kāi)發(fā)新的癌癥治療的新的靶目標(biāo)，并不對(duì)本發(fā)明加以任何 限制。所說(shuō)靶目標(biāo)是指應(yīng)用以上方法進(jìn)一步作藥物開(kāi)發(fā)發(fā)展的潛在目標(biāo)。雖然此說(shuō)明沒(méi)有 具體詳述其它小分子藥物的DNA，RNA, siRNA和已知的癌癥治療技術(shù)的所有其他方法使用 輻射治療的方法，專業(yè)人士可修改調(diào)整具體的應(yīng)用方法和步鄹。實(shí)例示例1協(xié)同抑制NF- κ B的活性概述通常情況下，體外NF- κ B活性測(cè)定是通過(guò)人造報(bào)告基因分析，電子凝膠阻 滯分析，及最近的DNA結(jié)合和ELISA法。然而，這些方法都采用外源DNA寡核苷酸或結(jié)構(gòu)進(jìn)行測(cè)量特定NF- κ B的DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄活性的共識(shí)和NF- κ B啟動(dòng)子序列。此外，NF- κ B啟動(dòng) 子作用是不同于真正的啟動(dòng)子序列。真正的啟動(dòng)子需要多個(gè)蛋白分子之間復(fù)雜的相互作 用，而人為的NF-K B啟動(dòng)子可能引入人為的影響。實(shí)驗(yàn)方法UM-SCC 6細(xì)胞的細(xì)胞，effectene (Qiagen的)轉(zhuǎn)染1) 20 %的顯性負(fù) IKKl-KA(K44A)和 80% pUC19 中，2) 20% 的顯性負(fù) IKK2-KA(K44A)和 80% pUC19 質(zhì)粒轉(zhuǎn) 染，3) 20% 的顯性負(fù) IKKl-KA (K44A)，20% 的顯性負(fù) IKK2-KA (K44A)和 60% pUC19,4)20% pcDNA3和80%pUC19為陰性對(duì)照。所有細(xì)胞轉(zhuǎn)染均持續(xù)72小時(shí)。然后，所有試驗(yàn)的細(xì)胞 均用GeneSpectra藥箱(Panomics)的細(xì)胞裂解液裂解并所有試驗(yàn)的細(xì)胞均用GeneSpectra 藥箱測(cè)定I κ B α，plOO，CSNK2B mRNA的水平。I κ B α，plOO，CSNK2BmRNA的水平均經(jīng)相應(yīng) 的同時(shí)測(cè)定的18S-RNA矯正。結(jié)果在此之前，用無(wú)磷酸激酶活性的IKK1-K44A或IKK2-K44A單獨(dú)轉(zhuǎn)染 UM-SCC-6細(xì)胞和其他頭頸部鱗狀細(xì)胞癌的腫瘤細(xì)胞我們看到部分( 50% )抑制NF- κ B 的活性。以內(nèi)源性的I κ B α，P100andCK2 β等NF- κ B的下游基因作為NF- κ B的活性指 標(biāo)，單獨(dú)轉(zhuǎn)染無(wú)磷酸激酶活性的11 1-1(444導(dǎo)致20%抑制順-1^8的活性，而單獨(dú)轉(zhuǎn)染無(wú) 磷酸激酶活性的ΙΚΚ2-Κ44Α，對(duì)NF- κ B的活性無(wú)抑制作用。相反，當(dāng)用無(wú)磷酸激酶活性的 ΙΚΚ1-Κ44Α或ΙΚΚ2-Κ44Α同時(shí)抑制IKKl和ΙΚΚ2，所有三個(gè)目標(biāo)基因的表達(dá)水平均降低90% (圖IA和B)。兩種不同的測(cè)定結(jié)果說(shuō)明前者可能有人為因素的影響。此外，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié) 果與目前關(guān)于IKKl和ΙΚΚ2獨(dú)立的通過(guò)不同的途徑激活NF- κ B的概念相矛盾。相反，我們 的數(shù)據(jù)顯示同時(shí)抑制IKKl和ΙΚΚ2可得到協(xié)同抑制的作用。此結(jié)果暗示IKKl和ΙΚΚ2兩者 之間有潛在的互換功能。示例2同時(shí)對(duì)IKKl和ΙΚΚ2抑制也可導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡 除了抑制NF- κ B的活性，同時(shí)用Κ44Α-ΙΚΚ1 and K44A-IKK2轉(zhuǎn)染SCC-6細(xì)胞還導(dǎo) 致細(xì)胞死亡(圖2)。同時(shí)轉(zhuǎn)染K44A-IKK1 and K44A-IKK2后48小時(shí)85%的細(xì)胞數(shù)目減少 (圖2WST-lno no)和大量的細(xì)胞死亡(圖2b)。該數(shù)據(jù)代表了 7組平行實(shí)驗(yàn)的平均值。這一結(jié)果表明，抑制NF-K B的活性并導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡，這種作用只能通過(guò)同時(shí)抑 制兩種IKKl和IKK2才能達(dá)到。此外，共轉(zhuǎn)染的K44A-IKK1和K44A_IKK2sensitize還可增 強(qiáng)UM-SCC-6細(xì)胞對(duì)順鉬和5-FU的敏感性10至100倍。示例3 (原為第二個(gè)“示例2”)四唑染料WST-Ir增加IKKs雙重抑制造成的癌細(xì) 胞死亡在此研究中，常規(guī)的WST-Ir的方法不能準(zhǔn)確的測(cè)定細(xì)胞的數(shù)量。這是因?yàn)樵璉KK 磷酸激酶抑制NF- κ B的活性干擾這一測(cè)量。此外，我們發(fā)現(xiàn)，同時(shí)抑制IKKl和IKK2磷酸 激酶的活性后應(yīng)用WST-Ir起到協(xié)同細(xì)胞死亡的作用(圖2)。在圖2A我們展示同時(shí)轉(zhuǎn)染 K44A-IKK1 和 K44A-IKK2 導(dǎo)致 80%細(xì)胞死亡。如加用 WST-Ir 于 K44A-IKK1 和 K44A-IKK2 共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，可導(dǎo)致β95%以上細(xì)胞死亡。圖中所標(biāo)示的實(shí)施的結(jié)果為7組平行實(shí)驗(yàn) 的平均值。圖4Β顯示雙重轉(zhuǎn)染Κ44Α-ΙΚΚ1和Κ44Α-ΙΚΚ2細(xì)胞所致細(xì)胞死亡與單獨(dú)轉(zhuǎn)染 Κ44Α-ΙΚΚ1或Κ44Α-ΙΚΚ2所致部分細(xì)胞死亡。示例4(原為“示例3”)四唑染料WST-I促進(jìn)協(xié)同殺死癌細(xì)胞的DNA轉(zhuǎn)染與IKK 抑制劑聯(lián)合作用導(dǎo)致的SCC-6死亡概述為進(jìn)一步研究IKK抑制劑是否能有轉(zhuǎn)染Κ44Α-ΙΚΚ1和Κ44Α-ΙΚΚ2導(dǎo)致癌癥細(xì)胞死亡類似的效力，由于無(wú)IKK-I抑制劑，此實(shí)驗(yàn)采用聯(lián)合應(yīng)用轉(zhuǎn)染K44A-IKK1和可抑 制NF- κ B活性的IKK2抑制劑。結(jié)果顯示10 · M IKK抑制劑III，20 μ M抑制劑IV，VI and VII，30 μ M for抑制劑II and sc-514 and 60 μ M for MLN120b均導(dǎo)致大量腫瘤細(xì)胞死亡。 當(dāng)IKK抑制劑與轉(zhuǎn)染K44A-IKK-1和用時(shí)可導(dǎo)致更多細(xì)胞死亡，但二者差異是有限的。然而， 當(dāng)在應(yīng)用K44A-IKK1轉(zhuǎn)染和IKK抑制劑后和用WST-Ir，則導(dǎo)致協(xié)同細(xì)胞死亡。WST-I增加 這些癌細(xì)胞對(duì)此治療的敏感性，從而使達(dá)到同樣效果所需的IKK2抑制劑的濃度可降低千 倍以上。聯(lián)合抑制超過(guò)1萬(wàn)倍以上濃度的IKK2抑制劑使用的少。這種協(xié)同作用的應(yīng)用適 用于全部七個(gè)已經(jīng)過(guò)測(cè)試過(guò)的IKK2抑制劑。圖3顯示了聯(lián)合應(yīng)用轉(zhuǎn)染K44A-IKK-1與IKK 抑制劑III或IIV造成的這種協(xié)同的癌細(xì)胞死亡。抑制劑II，VI，sc-514and MLNl20b也有 相似的作用。這些數(shù)據(jù)表明，IKK抑制劑可能只會(huì)使癌細(xì)胞脆弱，需要與WST，第三個(gè)試劑， 結(jié)合應(yīng)用引起癌細(xì)胞死亡。因此，我們的數(shù)據(jù)表明，在IKK1，IKK2以及與WST以下三種藥物 聯(lián)合治療抑制-1可以協(xié)同促進(jìn)癌細(xì)胞的死亡，并會(huì)與癌癥治療有關(guān)。另一方面，數(shù)據(jù)還顯示，與對(duì)照組比較(pCDNA3+pUC19)， K44A-IKK1 (K44A-IKKl+pUC19)的差異非常有限。更詳細(xì)的分析發(fā)現(xiàn)，這是pUC19的影響，因 此上述聯(lián)合作用應(yīng)為pUC19DNA轉(zhuǎn)染，IKK2抑制劑和WST-I的聯(lián)合作用。示例5 (原“示例4”)WST-I促進(jìn)三項(xiàng)聯(lián)合治療所致HT1080人肉瘤細(xì)胞死亡方法HT1080細(xì)胞培養(yǎng)在96孔板分別轉(zhuǎn)染pUC19，pCDNA3，IKK1-KA， IKK1-KA+PUC19.和pCDNA3+pUC19DNA質(zhì)粒，然后順序應(yīng)用IKK抑制劑和WST_lr。除對(duì)照組 夕卜，每一組細(xì)胞轉(zhuǎn)染一種上述所列質(zhì)粒24小時(shí)，然后應(yīng)用3-30 μ M IKK抑制劑 III，24小時(shí) 后，再應(yīng)用WST4小時(shí)，然后再繼續(xù)培養(yǎng)過(guò)夜后再用CCK8藥箱進(jìn)行測(cè)定并與此后24，48和96 小時(shí)測(cè)定。結(jié)果數(shù)據(jù)顯示，(1)腫瘤細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染DNA并應(yīng)用IKK抑制劑III，并應(yīng)用WST-Ir 治療后24，48和96小時(shí)均表現(xiàn)出IKK抑制劑III劑量依賴性的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制和減少的細(xì) 胞成活。然而轉(zhuǎn)染PUC19或IKKl-KA并無(wú)明顯區(qū)別(圖4)。(2)與未加用WST-Ir的細(xì)胞 比較，加用WST-Ir的細(xì)胞治療后24，48和96小時(shí)進(jìn)一步誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞死亡，降低細(xì)胞存 活率；(3)在治療后96小時(shí)，所有未經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞重新生長(zhǎng)到與無(wú)治療的陰性對(duì)照相等的 水平，經(jīng)過(guò)DNA轉(zhuǎn)染達(dá)沒(méi)有經(jīng)過(guò)WST-I治療的細(xì)胞也部分恢復(fù)生長(zhǎng)，(4)在96小時(shí)后，與經(jīng) 過(guò)各種治療的腫瘤細(xì)胞相比，只有經(jīng)過(guò)DNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞也同時(shí)應(yīng)用WST-Ir治療仍然沒(méi)有恢 復(fù)細(xì)胞生長(zhǎng)，這一結(jié)果表明DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞和應(yīng)用IKK抑制劑造成這些細(xì)胞損傷。加用WST 進(jìn)行三項(xiàng)聯(lián)合治療，進(jìn)一步促進(jìn)這些腫瘤細(xì)胞100%死亡。在24小時(shí)后的存活細(xì)胞測(cè)定的 差異也包括了由于WST-Ir對(duì)于應(yīng)用CCK8檢測(cè)細(xì)胞存活測(cè)定的影響。在治療48小時(shí)后這 種影響減弱；96小時(shí)后這種影響完全消除。細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，在應(yīng)用WST-Ir 24小時(shí) 之后，30 · M IIKK抑制劑III治療過(guò)的細(xì)胞大部分死亡。然而，未用WST-Ir治療過(guò)的為死 亡的細(xì)胞又可重新生長(zhǎng)。反之，經(jīng)過(guò)DNA轉(zhuǎn)染，IKK抑制劑III和WST-Ir治療的腫瘤細(xì)胞 為100%死亡。這些數(shù)據(jù)表明WST-Ir增強(qiáng)IKK抑制劑III的效果的作用，并誘導(dǎo)促進(jìn)腫瘤 細(xì)胞死亡，而轉(zhuǎn)染PUC19質(zhì)粒也可有助于抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的綜合效應(yīng)。示例6 (原“例7”)干擾素取代pUC19質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，以加強(qiáng)IKK抑制劑III和WST-Ir 的作用概述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，DNA轉(zhuǎn)染可協(xié)同IKK抑制劑III和WST-Ir的三項(xiàng)聯(lián)合的治療作用導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡，此外，已知干擾素(IFN)的反應(yīng)與DNA轉(zhuǎn)染有關(guān)。在此，檢驗(yàn)干 擾素是否可作為PUC19DNA治理轉(zhuǎn)染的替代品。方法HT1080細(xì)胞培養(yǎng)在96孔板順書須應(yīng)用干擾素，IKK抑制劑III和WST-I治療。每一組細(xì)胞用一種2-1000單位干擾素亞型治療24小時(shí)，隨之相繼用3-30 μ M的IKK抑 制劑III治療24小時(shí)和WST-Ir 4小時(shí)，然后經(jīng)24和48小時(shí)后用CCK8試劑盒測(cè)定細(xì)胞成 活性?？偣矞y(cè)試了 15 干擾素亞型包括IFNaA，IFN a B，IFN a C，IFN a D，IFN a F，IFN a G， IFN a H，IFN a I IFN a J，IFN a K，IFN a 4b，and IFNaffA, IFN^ , IFNyand IL_6結(jié)果(圖24)與未應(yīng)用干擾素治療的細(xì)胞比較，結(jié)果表明干擾素劑量依賴性，和 IKK抑制劑III IKK劑量相關(guān)的抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和增加細(xì)胞死亡。根據(jù)治療后48小時(shí)的 測(cè)定結(jié)果，與PUC19質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染并聯(lián)合應(yīng)用30 μ M IKK抑制劑III和WST-Ir相比，應(yīng)用 干擾素可達(dá)到80-90%的pUC19質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染造成的抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制和促進(jìn)腫瘤細(xì) 胞死亡的作用。例7 (原“例5 ” ) WST-I誘導(dǎo)活性氧(ROS)生成概述Ishiyamaet al 在 1996 年首次描述了 WST-1 (Ishiyam M, et al Biol Pharm Bull 1996，19 :1515_20).)。這是一個(gè)細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑由羅氏公司生產(chǎn)的。WST-I 是由氮唑鹽 WST-l({4-[3-(4-lodophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]-l， 3-benzenedilsulfonate})和電子耦合試劑稀釋與磷酸鹽緩沖液。WST-I可通過(guò)線粒體 琥珀酸裂解四氮唑還原酶系統(tǒng)。這種分裂被用來(lái)作為對(duì)活細(xì)胞的測(cè)量依據(jù)。然而，已發(fā) 現(xiàn)WST-I不能透過(guò)細(xì)胞膜，在細(xì)胞表面被還原，或在通過(guò)跨細(xì)胞膜電子傳輸系統(tǒng)(tPMET， Berridge,MV et al, Biotechnol AnnuRev，2005 ； 11 127052)。另外，WST-1 可以被細(xì)胞表 面的 NAD (P)H 氧化酶還原(Berridge，MV，et al, AntioxidRedox Signal，2000，2 :231_42， Scalett, DJ, et al, Biofactors, 2004, 20 199-206)本發(fā)明已發(fā)現(xiàn) WST-Ir 當(dāng)與 DNA 轉(zhuǎn)染， 或干擾素，或siRNA轉(zhuǎn)染以及至少一個(gè)IKK，或CK2的抑制劑或GSK3 聯(lián)合應(yīng)用可協(xié)同其對(duì) 細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的死亡。從理論上說(shuō)，JNK活化和NF-κ B的活性之間 的平衡決定細(xì)胞死亡或存活。長(zhǎng)時(shí)間的JNK活化誘導(dǎo)細(xì)胞程序性死亡?；钚匝跎烧T導(dǎo)的 JNK 活化而 NF- κ B 的活性導(dǎo)致抑制 ROS 水平(Luo,幾，et al, J. Clin. Invest, (2005) 115 2625-32, Shen, HM, et al, Free Radical Biology & Medicine 2006,40:928-939)。本發(fā) 明發(fā)現(xiàn)，WST-I誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞活性氧生成，促進(jìn)細(xì)胞死亡。方法HT1080細(xì)胞培養(yǎng)在可進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的載玻片上并順序進(jìn)行pUC19質(zhì)粒的轉(zhuǎn) 染和IKK抑制劑III的治療。然后，一部分細(xì)胞使用熒光染料CM-H2-DCFDA標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的 活性氧，然后用WST-Ir 30分鐘(圖10-A)或另一部分細(xì)胞先用WST-Ir治療2小時(shí)，然后 使用CM-H2-DCFDA活性氧(圖5_b)項(xiàng)。結(jié)果用帶有Spotlight軟件的數(shù)碼相機(jī)記錄。人 工曝光控制以保證熒光強(qiáng)度的可比性。結(jié)果以上兩個(gè)實(shí)驗(yàn)均記錄了顯著的WST-I誘導(dǎo)的活性氧代的生成(圖5A和B)。 在圖8-A，IKK那些經(jīng)pUC19質(zhì)粒轉(zhuǎn)染并應(yīng)用了 IKK抑制劑III，但未經(jīng)WST-Ir治療的細(xì)胞 也產(chǎn)生與IKK抑制劑III劑量依賴性的細(xì)胞活性氧生成。此結(jié)果表明，IKK抑制劑III也 可引發(fā)活性氧產(chǎn)生。例8 (原“例6” )氯化鋰和芹菜素(Apigenin)聯(lián)合應(yīng)用的協(xié)同作用，和WST-1可 進(jìn)一步加強(qiáng)此作用總述=LiCl是眾所周知的GSK3 β的抑制劑，而apigenin是CK2的抑制劑。GSK3 β和CK2均可影NF- κ B的活性。此實(shí)驗(yàn)旨在檢查響LiCl和apigenin聯(lián)合應(yīng)用 以替代DNA轉(zhuǎn)染的協(xié)同抑制作用方法:UM-SCC6細(xì)胞培養(yǎng)在96孔板，并分別應(yīng)用1，3，10，30，100 · M LiCl和1，3， 10，30，100 · M芹菜素的各種不同組合治療24小時(shí)，然后進(jìn)行WST-Ir治療。細(xì)胞存活性應(yīng) 用CCK8測(cè)定試劑盒測(cè)定。結(jié)果數(shù)據(jù)顯示，與陰性對(duì)照組相比，可見(jiàn)氯化鋰和芹菜素劑量相關(guān)的抑制細(xì)胞生 長(zhǎng)和增加的細(xì)胞死亡。ΙΟμΜ芹菜素和30mM LiCl聯(lián)合應(yīng)用可得到協(xié)同抑制作用。(圖6A) 條。加用WST-I進(jìn)一步增強(qiáng)這種抑制作用(圖6B型)。例9 (原“例7”)轉(zhuǎn)染pUC19質(zhì)粒協(xié)同化療藥物對(duì)UM_SCC_6細(xì)胞的殺傷作用UM-SCC-6 細(xì)胞經(jīng)分別轉(zhuǎn)染 pUC19DNA，pCDNA3, pUC19+pCDNA3，IKKl_KA+pUC19， IKK2-KA+pUC19, andIKKl-KA+IKK2_KA+pUC19， IKKl_KA+pCDNA3， IKK2_KA+pCDNA3， or IKKl-KA+IKK2-KA+pCDNA3，48小時(shí)，然后應(yīng)用不同劑量的5-氟尿嘧啶(5-FU，圖7a)或順鉬 (Cis-Platinum,圖7b為96或72小時(shí))96和72小時(shí)，并于治療72 he 96小時(shí)后測(cè)定細(xì)胞 生長(zhǎng)和存活。PUC19質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和存活的最強(qiáng)的抑制作用。例10 (原“例8”)轉(zhuǎn)染pUC19質(zhì)粒協(xié)同化療藥物對(duì)HT1080細(xì)胞的殺傷作用 HT1080 細(xì)胞經(jīng)分別轉(zhuǎn)染 pUC19DNA，pCDNA3, pUC19+pCDNA3，IKKl_KA+pUC19， IKK2-KA+pUC19, andIKKl-KA+IKK2_KA+pUC19， IKKl_KA+pCDNA3， IKK2_KA+pCDNA3， or IKKl-KA+IKK2-KA+pCDNA3，48小時(shí)，然后應(yīng)用不同劑量的化療藥96和72小時(shí)，并于治療72 和96小時(shí)后測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)和存活。藥物治療順鉬(Cis-Platinum)30ng/ml_3 μ g/ml(圖 7D)，紫杉醇 (Paclitaxel)InM-IO μM(圖 7C),5-FU 50ηΜ_500μ M(data not shown),阿霉素 (Doxorubicin) 30ηΜ_3· 3 μ M (數(shù)據(jù)未顯示)結(jié)果DNA載體轉(zhuǎn)染可導(dǎo)致對(duì)化療藥作用不同程度的加強(qiáng)和協(xié)同效應(yīng)。與其他DNA 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染相比，PUC19質(zhì)粒DNA的單獨(dú)轉(zhuǎn)染展示了對(duì)化療藥的療放的最強(qiáng)勁的協(xié)同作用。轉(zhuǎn) 染pUC19質(zhì)粒導(dǎo)致化療藥物的IC50比相應(yīng)的未用pUC19質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的腫瘤細(xì)胞分別降低約 10倍。加之，在治療后96小時(shí)后順鉬或紫杉醇(Paclitaxel)治療但未經(jīng)pUC19質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 的細(xì)胞恢復(fù)生長(zhǎng)，而轉(zhuǎn)染DNA質(zhì)粒的細(xì)胞，特別是單獨(dú)應(yīng)用pUC19質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞的死亡是 不可逆轉(zhuǎn)的，這意味著它們分別為100%的死亡。這些數(shù)據(jù)表明，這些化療藥物抑制癌細(xì)胞 的生長(zhǎng)，但不能殺死這些細(xì)胞。與轉(zhuǎn)染PUC19質(zhì)粒相結(jié)合可促進(jìn)細(xì)胞死亡。例11 (原“例9”)pUC 19轉(zhuǎn)染協(xié)同無(wú)磷酸激酶活性的K44A-IKK抑制NF- κ B的活 性圖1顯示了同時(shí)抑制IKKl和ΙΚΚ2磷酸激酶活性可協(xié)同抑制NF- κ B的活性，在 此實(shí)驗(yàn)中PUC19中被用作DNA轉(zhuǎn)染載體。為審查pUC19是否在其中發(fā)揮了對(duì)抑制NF- κ B 的活性的協(xié)同作用，ΗΤ1080細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染不同的質(zhì)粒，或共轉(zhuǎn)染各種不同的組合的質(zhì)粒 包括20% dominant negative IKK1-KA(K44A)and 80% pUC19，ii)20%無(wú)磷酸激酶活 性的 IKK2-KA (K44A) and 80% pUC19, iii) 20 % 無(wú)磷酸激酶活性的 IKK1-KA (K44A)，20 % 無(wú)磷酸激酶活性的 IKK2-KA(K44A)and 60% pUC19, iv)20% pCDNA3 and 80%pUC19 作 為陰性對(duì)照ν) 100% pUC19作為另一個(gè)陰性對(duì)照，以及另一組轉(zhuǎn)染包括vi) 20%無(wú)磷酸激 酶活性的 IKKl-KA (K44A) and 80% pCDNA3，vii) 20 % 無(wú)磷酸激酶活性的 IKK2-KA (K44A)and 80% pCDNA3，viii) 20 %無(wú)磷酸激酶活性的IKKl-KA (K44A). 20 %無(wú)磷酸激酶活性 的IKK2-KA(K44A)and 60% ρ⑶NA3，持續(xù)72小時(shí)。在結(jié)束轉(zhuǎn)染后，經(jīng)過(guò)治療的細(xì)胞用 GeneSpectra包(Panomics)的裂解液裂解并測(cè)定NF- κ B調(diào)控的基因的mRNA的表達(dá)水平， 并以同時(shí)測(cè)量的18sRNA水平矯正，作為NF-KAPPAB的轉(zhuǎn)錄活性。pUC19質(zhì)粒和pcDNA3轉(zhuǎn)染 色細(xì)胞作為對(duì)照。結(jié)果表明相比于pCDNA3，pUC19 對(duì) I κ Ba (圖 8A)，CSNK2B (圖 8B)and ρ 100 (圖 8C)mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯示出更強(qiáng)的抑制作用例12 (原“例10”)聯(lián)合應(yīng)用WST和芹菜素(Apigenin)協(xié)同加強(qiáng)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡方法UM-SCC6，MDA-MB-231，Cal27,HT1080, B6-5 和 A431 細(xì)胞分別給與 3 % 的 WST-Ir 或 100 μ M 芹菜素(Apigenin)或 3% 的 WST-Ir 和 100 · M 芹菜素(Apigenin)，與未 經(jīng)處理的細(xì)胞為平行對(duì)照，DMSO作為溶劑對(duì)照，持續(xù)治療4小時(shí)。治療后，所有細(xì)胞環(huán)衛(wèi)正 常培養(yǎng)液并繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。行處理相結(jié)合μ 受體withlOO，那么，在處理被拆除的細(xì) 胞，因此，處理改為正常增長(zhǎng)中，文化再維持24小時(shí)。細(xì)胞存活經(jīng)CCK8藥箱測(cè)定。結(jié)果與未經(jīng)治療的對(duì)照細(xì)胞相比較，聯(lián)合應(yīng)用WST-IR和芹菜素(Apigenin)誘導(dǎo) 所有6個(gè)被測(cè)定的腫瘤細(xì)胞株75%至95%的細(xì)胞死亡。(圖9)。示例13 (原“例11”)芹菜素(Apigenin)和WST-Ir應(yīng)用治療順序?qū)φT導(dǎo)細(xì)胞凋 亡治療的影響方法UM_SCC6 (圖10A)和HT1080 (圖10B)細(xì)胞按照?qǐng)D中及以下所示的順序先后 組合應(yīng)用10% WST-IR和100 · M的芹菜素(Apigenin)。未經(jīng)治療的細(xì)胞作為陰性對(duì)照。 細(xì)胞存活用CCK8試劑盒性測(cè)定，并用未經(jīng)治療的細(xì)胞的測(cè)定結(jié)果矯正為相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞 的百分比(％正常陰性對(duì)照)。對(duì)照細(xì)胞不做任何治療，或只應(yīng)用芹菜素(Apigenin)治 療，根據(jù)圖中所示的劑量24小時(shí)，然后換為正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后測(cè)定細(xì)胞存活； Ap-WST 細(xì)胞先應(yīng)用芹菜素(Apigenin)根據(jù)圖中所示的劑量24小時(shí)，然后加入終濃度為 10%的WST-Ir 4小時(shí)后換為正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后測(cè)定細(xì)胞存活；.WST+Ap 細(xì)胞 首先應(yīng)用10%的WST-Ir分別和根據(jù)圖中所示的劑量的芹菜素(Apigenin)4小時(shí)后換為正 常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后，測(cè)定細(xì)胞存活；WST+Ap — Ap 細(xì)胞首先應(yīng)用10%的WST-Ir 分別和根據(jù)圖中所示的劑量的芹菜素(ApigeninM小時(shí)后換為正常培養(yǎng)液并繼續(xù)應(yīng)用相 應(yīng)劑量的芹菜素(Apigenin)培養(yǎng)24小時(shí)后，測(cè)定細(xì)胞存活；WST — Ap 細(xì)胞首先應(yīng)用10% 的WST-Ir 4小時(shí)后換為正常培養(yǎng)液并應(yīng)用根據(jù)圖中所示的劑量的芹菜素(Apigenin)培養(yǎng) 24小時(shí)后，測(cè)定細(xì)胞存活。結(jié)果顯示，上述四種治療方法均可誘導(dǎo)細(xì)胞死亡(圖10的A，B)，但最有效的治療 順序可能會(huì)根據(jù)特定的細(xì)胞株而異。GS+Ap — Ap從兩個(gè)細(xì)胞系均顯示為最佳組合順序。示例14(原“例12”)WST_lr和芹菜素(Apigenin)聯(lián)合應(yīng)用治療的時(shí)間歷程和反 應(yīng)劑量關(guān)系方法Cal27(Cl)，HT1080(C2)和UM_SCC6(C3)細(xì)胞給與不同治療濃度的(1%，3% 和10% )WST-lr，并同時(shí)聯(lián)合應(yīng)用不同劑量的芹菜素(Apigenin 3，10，30和100 · M)持續(xù) 0. 5，1，2或4，然后，更換為相應(yīng)濃度的芹菜素(Apigenin)繼續(xù)治療24小時(shí)后，用CCK8試 劑盒測(cè)定細(xì)胞成活并用未經(jīng)治療的對(duì)照校正為其的％。
結(jié)果結(jié)果顯示，所有三個(gè)經(jīng)過(guò)測(cè)定的細(xì)胞系均顯示出WST-Ir治療的時(shí)間和劑量 依賴的和芹菜素(Apigenin)治療劑量依賴的細(xì)胞死亡(圖11的C1-3)。聯(lián)合應(yīng)用10% WST-Ir 0. 5hour 和 100 μ M 芹菜素 apigeinin)治療 Cal27 和 UM-SCC6 (圖 11-C1 的，3)，以 及 3% WST-Ir Ihour 和 100 μ M 芹菜素 apigeinin)治療 HT1080 細(xì)胞(圖 11C2)可協(xié)同 誘導(dǎo)細(xì)胞死亡(80% )。增加WST-Ir治療時(shí)間至4小時(shí)10% WST-Ir聯(lián)合應(yīng)用30 μ M芹菜 素apigeinin)治療HT1080和UM-SCC6細(xì)胞(Figll_C2_3)，以及聯(lián)合應(yīng)用30 μ M芹菜素 apigeinin)和10% WST-Ir治療Cal27細(xì)胞1小時(shí)(Figll-Cl)均可將誘導(dǎo)細(xì)胞死亡提高 到 80-90% ο示例15 (原“例13” )聯(lián)合應(yīng)用IKK抑制劑和WST治療對(duì)黑色素瘤細(xì)胞系的作用方法SK Mel-5和T294人黑色素瘤細(xì)胞分別應(yīng)用終濃度為或3%的WST-Ir治 療4小時(shí)，然后換用正常培養(yǎng)液并加入3 μ M或10 μ M IKK抑制劑III繼續(xù)培養(yǎng)24個(gè)小時(shí)。 然后換用正常細(xì)胞培養(yǎng)液再繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后用CCK8試劑葙測(cè)定細(xì)胞存活。結(jié)果數(shù)據(jù)表明，3% WST-Ir與10 μ M IKK抑制劑III聯(lián)合應(yīng)用可協(xié)同誘導(dǎo)細(xì)胞死 亡(圖 12-Α1-2)。示例16 (原“例14” ) IKK抑制劑III和WST-Ir聯(lián)合應(yīng)用治療順序?qū)φT導(dǎo)細(xì)胞凋 亡治療的影響方法Τ294細(xì)胞按照?qǐng)D中下面所示的不同順序先后分別應(yīng)用3% WST-Ir和3或 10 ·Μ的IKK抑制劑III。未經(jīng)治療的細(xì)胞作為陰性對(duì)照。細(xì)胞存活用CCK8試劑盒性測(cè)定， 并用未經(jīng)治療的陰性對(duì)照細(xì)胞的測(cè)定結(jié)果矯正為相對(duì)于對(duì)照細(xì)胞的百分比(％正常陰性對(duì) 照)。對(duì)照細(xì)胞無(wú)任何治療，或只應(yīng)用IKK抑制劑III根據(jù)圖中所示的劑量治療24小時(shí)， 然后換為正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后測(cè)定細(xì)胞存活；13 — WST 細(xì)胞先應(yīng)用IKK抑制劑 III根據(jù)圖中所示的劑量24小時(shí)，然后加入終濃度為3%的WST-lr4小時(shí)后換為正常培養(yǎng) 液繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后測(cè)定細(xì)胞存活；.WST+I3 細(xì)胞首先應(yīng)用3%的WST-Ir分別和根據(jù)圖 中所示的劑量的IKK抑制劑III治療4小時(shí)后換為正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)后，測(cè)定細(xì) 胞存活；.WST+I3 — 13 細(xì)胞首先應(yīng)用3%的WST-Ir分別和根據(jù)圖中所示的劑量的IKK抑 制劑III治療4小時(shí)后換為正常培養(yǎng)液并繼續(xù)應(yīng)用相應(yīng)劑量的IKK抑制劑III培養(yǎng)24小 時(shí)后，測(cè)定細(xì)胞存活；WST — 13 細(xì)胞首先應(yīng)用10%的WST-Ir 4小時(shí)后換為正常培養(yǎng)液并 應(yīng)用根據(jù)圖中所示的劑量的IKK抑制劑III培養(yǎng)24小時(shí)后，測(cè)定細(xì)胞存活。結(jié)果數(shù)據(jù)顯示，.WST+I3 — I3WST — 13治療順序可協(xié)同誘導(dǎo)細(xì)胞死亡(圖13)。示例17 (原“例15”)WST-Ir和芹菜素(Apigenin)聯(lián)合治療誘導(dǎo)JNK活化 方法UM_SCC6細(xì)胞用WST-Ir和芹菜素指定的劑量治療4小時(shí)，然后應(yīng)用測(cè)定JNK 的FACE藥箱(Qiogen)分別測(cè)定磷酸化的JNK和總JNK，再用總JNK將磷酸化的JNK進(jìn)行矯 正為磷酸化的JNK/總JNK的比值，并用crystal violet染色所得的細(xì)胞總數(shù)進(jìn)行矯正，以 進(jìn)行比較。結(jié)果數(shù)據(jù)顯示，UM-SCC6細(xì)胞顯示出WST-Ir和芹菜素劑量相關(guān)的JNK的磷酸化 (圖14)。聯(lián)合應(yīng)用WST-Ir和芹菜素進(jìn)一步增加JNK磷酸化。3%和10%，WST-Ir與100-M 芹菜素聯(lián)合應(yīng)用治療UM-SCC6細(xì)胞可協(xié)同誘導(dǎo)JNK的磷酸化。相反，IOmM芹菜素有抑制JNK 磷酸化的作用。這一結(jié)果支持聯(lián)合應(yīng)用WST-Ir與芹菜素可誘導(dǎo)JNK活化的假說(shuō)。示例18 (原“例16”)WST_lr和芹菜素，IKK抑制劑III聯(lián)合應(yīng)用致活性氧生成的劑量反應(yīng)關(guān)系方法UM-SCC6細(xì)胞用10 μ MCM_H2_DCFDA標(biāo)記15分鐘，然后分別用不同劑量的WST-Ir或CCK8試劑與不同劑量的芹菜素(A)或IKK抑制劑III (B)聯(lián)合應(yīng)用治療4個(gè)小 時(shí)。然后測(cè)定CM-H2-DCFDA標(biāo)記的Ex485/Em535熒光強(qiáng)度用于測(cè)定ROS的生成。結(jié)果數(shù)據(jù)顯示，WST-Ir誘導(dǎo)產(chǎn)生其劑量依賴性的活性氧(R0S，圖23A和B)。另 一方面，4小時(shí)CCK8治療劑量只產(chǎn)生低水平和非常有限的活性氧水平，且與CCK8劑量不相 關(guān)。芹菜本身不能導(dǎo)致產(chǎn)生活性氧。然而，與單純應(yīng)用相應(yīng)濃度的WST-Ir相比，芹菜素結(jié)合 應(yīng)用和3% WST-Ir的確顯示芹菜劑量依賴性，有限的，但穩(wěn)定的，活性氧的生成。.(圖 23-A)。.相反，10%的WST-Ir與芹菜素聯(lián)合應(yīng)用導(dǎo)致活性氧水平的下降(圖23-B)。此外， 當(dāng)芹菜素與CCK8結(jié)合，芹菜也可增加活性氧生成水平(圖23-A)。這種效果是芹菜素劑量 依賴性。同樣，單獨(dú)應(yīng)用IKK抑制劑III，或聯(lián)合應(yīng)用IKK抑制劑III和WST-Ir可得到與上 述情芹菜素相似的作用(圖23-B)。5 μ M IKK抑制劑III增加活性氧水平，而10 μ M IKK 抑制劑III降低活性氧水平(圖23-Β)。然而，IKK抑制劑III和WST-Ir結(jié)合活性氧的生 成與水平無(wú)影響。示例19 (原“例17”)WST_1R和芹菜素，IKK抑制劑III聯(lián)合應(yīng)用所致久活性氧生 成的時(shí)間歷程方法UM-SCC6細(xì)胞用10 μ M CM_H2_DCFDA標(biāo)記15分鐘，然后分別用不同劑量的 WST-Ir或CCK8試劑與不同劑量的芹菜素(A)或IKK抑制劑III (B)聯(lián)合應(yīng)用治療不同的時(shí) 間，從15分鐘至4個(gè)小時(shí)。在每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定CM-H2-DCFDA標(biāo)記的Ex485/Em535熒光強(qiáng) 度用于測(cè)定ROS的生成。結(jié)果數(shù)據(jù)顯示，WST-Ir誘導(dǎo)持續(xù)增加的活性氧生成，這種增加至少持續(xù)4個(gè)小時(shí) 以上(圖15-B和D)，而CCK8只有誘導(dǎo)產(chǎn)生低水平的，而且是一過(guò)性的活性氧的增加(圖 15-A 禾Π C)。示例20 (原“例18” ) CCK8，-XTT和WST-Ir與芹菜素聯(lián)和應(yīng)用誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的作 用能力方法ΗΤ1080和UM-SCC6細(xì)胞聯(lián)合應(yīng)用10% WST_lr，CCK8或XTT與不同劑量的芹 菜素進(jìn)行治療4小時(shí)，然后再換為正常生長(zhǎng)培養(yǎng)基再培養(yǎng)24小時(shí)。細(xì)胞存活用CCK8試劑 盒測(cè)定。結(jié)果數(shù)據(jù)顯示，對(duì)HT1080和UM-SCC6細(xì)胞兩個(gè)測(cè)定的腫瘤細(xì)胞株，CCK8不能至 細(xì)胞死亡，而與WST-Ir相比，XTT誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的作用居中(圖16)。示例21(原“例19”)比較其他四唑鹽誘導(dǎo)細(xì)胞死亡作用的能力方法HT1080和 UM-SCC6 細(xì)胞分別應(yīng)用下列之一 lmM WST-1,0. 4mM WST-3, 0. 5mM WST-4,0. 5mMWST_5，或單獨(dú)應(yīng)用 0. 12mM mPMS，或 0. 4mM WST-3+0. 12mM mPMS，0. 5mM WST-4+0. 12mM mPMS,0. 5mMWST-5+0. 12mM mPMS，，并聯(lián)合應(yīng)用芹菜素進(jìn)行治療4小時(shí)。然后 換為正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。細(xì)胞存活用CCK8試劑測(cè)定。結(jié)果數(shù)據(jù)顯示，WST-3，WST-3+mPMS和WST_4+mPMS并與芹菜素相結(jié)合的誘導(dǎo)細(xì)胞 死亡的作用與WST-Ir的相應(yīng)作用相似的效果(圖17AB)。WST-1，WSTUP WST-5單獨(dú)應(yīng) 用沒(méi)有這樣的效果(Figl7A，B)，WST-3+mPMS的作用強(qiáng)于WST-Ir誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的作用。
示例22 (原“例20”)HT1080細(xì)胞mPMS至細(xì)胞死亡的劑量反應(yīng)關(guān)系方法HT1080細(xì)胞分別與不同濃度的mPMS，并與ImM的WST-Ir及10，30或100 ·Μ 的芹菜素合用4小時(shí)，然后再換為正常細(xì)胞培養(yǎng)液再繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。細(xì)胞存活經(jīng)用CCK8 試劑盒測(cè)定，ImM WST-1,0. 12mM的MPM和10% WST-Ir作為平行對(duì)照。結(jié)果數(shù)據(jù)顯示，mPMS和芹菜素分別劑量依賴的細(xì)胞死亡(圖18)。圖19根據(jù)各種治療所致的細(xì)胞存活相對(duì)于芹菜素濃度制圖。此圖還包括各種 相應(yīng)的對(duì)照，數(shù)據(jù)標(biāo)簽Ctrl 未經(jīng)處理的陰性對(duì)照，GS =WST-Ir, mPMS 1. 2mM的MPM單獨(dú) 應(yīng)用，WST-I :WST-1 單獨(dú)應(yīng)用，1 :lmMWST-lr 加 0. 12mM mPMS，2:lmM WST-lr 加 0. ImM 的 mPMS，3 =ImM WST-Ir 力口 0. 08mMmPMS,4 =ImM WST-Ir 力口 0. 06mM 的 mPMS，5 =ImM WST-Ir 力口 0. 04mMmPMS,6 =ImM WST-Ir 加 0. 02mM 的 mPMS。結(jié)果數(shù)據(jù)顯示mPMS導(dǎo)致的其劑量依賴的細(xì)胞死亡。0. 12mM的mPMS有極高細(xì)胞 毒性.與WST-Ir合用可減弱其毒性。當(dāng)mPMS與WST-Ir和芹菜素聯(lián)合應(yīng)用，數(shù)據(jù)顯示，mPMS 和芹菜素劑量依賴的細(xì)胞死亡。0. 08mM WST-1+0. 12mM mPM顯示類似于WST-Ir所致的細(xì)胞 死亡作用。ImM WST-1,0. 06mM mPMS以及100 μ M芹菜素聯(lián)合應(yīng)用導(dǎo)致100%的細(xì)胞死亡。示例23 (原“例21”)WST3替代WST-Ir與芹菜素聯(lián)合應(yīng)用誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡 方法UM_SCC6，HT1080,Cal27, SK-Me 1-5 和 HEKa 細(xì)胞，單獨(dú)應(yīng)用 WST-3，或聯(lián)合應(yīng) 用WST-3和10或30 μ M芹菜素4小時(shí)，然后換為正常的細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。之 后，用CCK8試劑盒測(cè)定細(xì)胞存活，細(xì)胞存活數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化為未經(jīng)處理的對(duì)照細(xì)胞的百分比。結(jié)果數(shù)據(jù)顯示，30μΜ芹菜素(apigenin)he 50 μ MWST-31聯(lián)合治療的SCC6， Cal27，HT1080和SK-Mel-5腫瘤細(xì)胞顯示出超過(guò)80%的細(xì)胞死亡(圖20A，)。與之相反，與 這些腫瘤細(xì)胞同時(shí)，經(jīng)同樣治療的原代培養(yǎng)人鱗狀上皮細(xì)胞，HEKa能耐受這種治療。這種敏 感性的差異為治療腫瘤提供了一種可特意殺傷腫瘤細(xì)胞而對(duì)正常細(xì)胞無(wú)毒性的治療窗口。示例24 (原“例22”) WST-3+mPMS替代WST-Ir與芹菜素組合治療誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的 作用方法UM-SCC6，HT1080,Cal27, SK-Me 1-5 和 HEKa 細(xì)胞，應(yīng)用 0. ImM WST-3 力口 30 μ MmPMS,或單獨(dú)應(yīng)用WST-3，或無(wú)治療對(duì)照，聯(lián)合應(yīng)用10或30 μ M芹菜素4小時(shí)，然后換 為正常的細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。之后，用CCK8試劑盒測(cè)定細(xì)胞存活。細(xì)胞存活數(shù) 據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化為未經(jīng)處理的對(duì)照細(xì)胞的百分比。結(jié)果數(shù)據(jù)顯示，經(jīng)0. ImM WST-3加30 μ M mPMS和30 μ M芹菜素治療的導(dǎo)致90% 以上的UM-SCC6，ΗΤ1080, Cal27，SK-Me 1-5腫瘤細(xì)胞死亡(圖20B, C，D)。另一方面，與這 些腫瘤細(xì)胞比較，同時(shí)進(jìn)行的經(jīng)同樣治療的原代培養(yǎng)人鱗狀細(xì)胞HEKa細(xì)胞對(duì)這一治療不 敏感。這一治療的條件，是一個(gè)腫瘤細(xì)胞特異的治療窗口口。這種敏感性的差異為治療腫 瘤提供了一種可特意殺傷腫瘤細(xì)胞而對(duì)正常細(xì)胞無(wú)毒性的治療窗口。示例25 (原“例23”)pUC19質(zhì)粒和有根據(jù)pUC19的DNA序列演化出的siRNAs可 增強(qiáng)紫杉醇(Paclictaxel)治療效果方法HT1080細(xì)胞轉(zhuǎn)染pUC19質(zhì)粒和根據(jù)pUC19的DNA序列設(shè)計(jì)的siRNAs和 針對(duì)與此相應(yīng)的目標(biāo)基因的siRNA24小時(shí)，然后的給與3，10，30和IOOnM的紫杉醇治 療48小時(shí)。紫杉醇治療后，細(xì)胞在正常細(xì)胞培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)24至72小時(shí)。細(xì)胞存 活率用CCK8試劑葙監(jiān)測(cè)。每24小時(shí)測(cè)定一次。細(xì)胞存活數(shù)據(jù)用未經(jīng)治療的對(duì)照細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)化為其百分比。這項(xiàng)研究所用的siRNA包括單獨(dú)應(yīng)用siRNA#l，siRNA#2, siRHA#3, siRNAtargeting TRPC6, SH3PXD2B, C6orfl08, TTBKl, MAGI3, and TMEM182 以及聯(lián)合應(yīng) 用 siRNA32+#3，andsiRNA#l+#2+#3+#4+#5 (siRNA Σ 1-5)錫爾納 #1，#2 錫爾納，錫拉 #3， 錫爾納目標(biāo) TRPC6，SH3PXD2B, C6orfl08, TTBKl, MAGI3 和 TMEM182 以及 siRNA#2+#3，禾口 siRNA#l+#2+#3+#4+#5(siRNA Σ 1-5)。結(jié)果所示數(shù)據(jù)代表紫杉醇治療后72小時(shí)的測(cè)定結(jié)果。細(xì)胞存活的數(shù)據(jù)顯示， 紫杉醇劑量依賴性細(xì)胞死亡和由PUC19質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的和siRNA轉(zhuǎn)染的進(jìn)一步增強(qiáng)的細(xì)胞死 亡(圖 21)。pUC19 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，以及轉(zhuǎn)染針對(duì) TRPC6, SH3PXD2B, C6orfl08, TTBKl, MAGI3, and TMEM182 的 siRNA 和聯(lián)合轉(zhuǎn)染 siRNA#2+#3，和 siRNA#l+#2+#3+#4+#5 使紫杉醇的 IC50 減少超過(guò)3倍。轉(zhuǎn)染siRNA#2，siRHA#3，和針對(duì)SH3PXD2B, C6orfl08的siRNA使紫杉醇的 IC50下降超過(guò)2. 5倍。這些數(shù)據(jù)支持這假設(shè)的PUC19質(zhì)粒的DNA序列包含短片段的功能序 列以攻擊和干擾相應(yīng)基因的表達(dá)水平和細(xì)胞功能。至少，經(jīng)測(cè)試所列的這些基因(TRPC6， SH3PXD2B, C6orfl08, MAGI3和TMEM182)可作為靶目標(biāo)基因用于藥物設(shè)計(jì)以提高化療藥物 的療效作用。在此所示的可攻擊這些基因的siRNAs也可以作為一種工具用于來(lái)達(dá)到提高 化療藥物的療效作用這個(gè)目的。此外，這些綜合治療誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡，而不是簡(jiǎn)單的抑制 細(xì)胞生長(zhǎng)。治療后72小時(shí)，經(jīng)過(guò)治療的細(xì)胞不能重新生長(zhǎng)。這一功能更增加了治療作用的 持久性。示例26 (原“例24”)用針對(duì)TMEM182和MAGI3的siRNA替代轉(zhuǎn)染pUC19質(zhì)粒用 于PUC19-IKK1抑制劑III-WST-Ir-I的聯(lián)合治療方法HT1080細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染siRNA#3，或從pUC19的DNA序列衍生的，針對(duì)MAGI3， 和TMEM182設(shè)計(jì)的siRNAs，或可針對(duì)pUC19質(zhì)粒所能攻擊的基因的siRNA24小時(shí)，然后應(yīng)用 IKK抑制劑III治療24小時(shí)，再加入WST-Ir治療4小時(shí)后，換為正常細(xì)胞 培養(yǎng)液再繼續(xù)培 養(yǎng)24小時(shí)。每24小時(shí)用CCK8試劑葙細(xì)胞測(cè)定存活率一次。數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化為未經(jīng)處理的對(duì) 照細(xì)胞的百分比。AllStar siRNA(Qiagen)作為siRNA轉(zhuǎn)染的陰性對(duì)照，pUC19質(zhì)粒轉(zhuǎn)染用 作陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果數(shù)據(jù)顯示，IKK抑制劑III劑量依賴性細(xì)胞死亡。轉(zhuǎn)染針對(duì)MAGI3和TMEM182 的siRNA具有協(xié)同誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的作用(圖22)。同樣，這些數(shù)據(jù)顯示，攻擊TMEM182和 MAGI3可以提高癌癥的治療效果。核苷酸序列和多肽的氨基酸序列SeqID#1 pUC19 nucleotide sequence#2 TRPC6 nucleotide sequence> gi I 19923256 | ref | NM_004621. 3 | Homo sapiens transient receptor potential cationchannel, subfamily C, member 6(TRPC6), mRNA#3 SH3PXD2B nucleotide sequence> gi|63055058|ref|NM_001017995. 11Homo sapiens SH3 and PX domains 2B (SH3PXD2B)，mRNA#4 MAGI3 nucleotide sequence> giI23097339ref|NM_152900.1|Homo sapiens membrane associatedguanylate kinase, Wff and PDZ domain containing 3(MAGIKK), transcript variant 2, mRNA#5 TMEMl82 nucleotide sequence
> gi|40255064|ref|NM_144632. 2|Homo sapiens transmembrane protein 182 (TMEM182)，mRNA#6 TRPC6 peptide sequence> giI5730102ref|NP_004612. 2|transient receptor potential cation channel, subfamily C, member 6[Homo sapiens]#7 SH3PXD2B Polyp印tide> gi I63055059ref|NP_001017995. 11SH3 and PX domains 2B[Homo sapiens]#8 MAGI-3 membrane associated guanylate kinase, Wff and PDZ domain containing 3 Polypeptide sequence> gi I 23097340 I ref I NP_690864. 1 I membrane-associated guanylate kinase-related 3isoform 2[Homo sapiens]#9 TMEMl82 polypeptide sequence> giI 40255065|refINP_653233. 2 I hypothetical protein L0C130827[Homo sapiens]#10 siRNAlSense UGA AUU CGA GCU CGG UAC CCG GGG AAntisense :UCC CCG GGU ACC GAG CUC GAA UUC A#11 siRNA 2Sense CAG GAA AGA ACA UGU GAG CAA AAGAntisense :CUU UUG CUC ACA UGU UCU UUC CUG#12 siRNA3Sense CUU UUA AAU UAA AAA UGA AGU UUU AAntisense :UAA AAC UUC AUU UUU AAU UUA AAA G#13 pcDNA3mSEQ ID N0#14 C6orfl08> gi|40354200|ref|NM_199184. 1|Homo sapiens chromosome 6 open reading frame 108(C6orf108), transcript variant 2, mRNASEQ ID N0#15 C6orfl08> giI 40354201|ref|Np_954653. 1|putative c-Myc-responsive isoform 2[Homo sapiens]
權(quán)利要求
一種誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡和治療哺乳動(dòng)物或癌癥病人的腫瘤的醫(yī)學(xué)應(yīng)用，包括(comprising)在一個(gè)療程中同時(shí)，或以任何一種順序聯(lián)合應(yīng)用，給與可協(xié)同誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡的，包括藥學(xué)有效劑量的至少一種化合物，和至少有一種WST-1r或WST-1r的任何有效的替代物，用于癌癥治療。
2.在權(quán)力要求1中所述的醫(yī)學(xué)應(yīng)用，其中所說(shuō)“至少有一種化合物”是選自包括廣義生 物黃酮類化合物(flavonoids)包括“芹菜素(Apigenin) ”和IKK抑制劑。
3.在權(quán)力要求2中所述的IKK抑制劑是選自一下組分SPC839，Anilino-Pyrimidine Derivative, PSl 145, BMS—345541*,, Amino-imidazolecarboxamide derivative, Ureudo-thiophenecarboxamide derivatives, Diarylpybidine derivative, Pyridooxazinone derivative, Indolecarboxami dederivative, Benzoimidazole carboxamide derivative, Pyrazolo[4,3~c]quinoline derivative, Imidazolylquinol ine-carbxaldehyde semicarbazide derivative, Pyridyl Cyanoguanidine derivate, I · B Kinase InhibitorPeptide, IKK-2 Inhibitor IV[5-(p-Fluorophenyl)-2-ureido] thiophene-3-carboxamide, IKK InhibitorII, ffedelolactone, IKK Inhibitor VII, IKK-2 Inhibitor V N-(3,5-Bis-trifluoromethylphenyl)-5-chloro-2-hydroxybenzamid e IMD-0354， IKK-2 Inhibitor VI(5-Phenyl-2-ureido)thiophene-3-carboxamide,IKK-2 Inhibitor VIII ACHP 2-Amino-6-(2-(cyclopropylmethoxy)-6-hydroxyphenyl)~4~(4-p iperidinyl)-3-pyridinecarbonitrile, and SC-514*.
4.對(duì)權(quán)利要求1的醫(yī)學(xué)應(yīng)用，其中說(shuō)WST-lr，或者至少有一種任何有效的WST-Ir替 代品是選自(1)由至少一個(gè)水溶性四唑鹽化合物，和至少有一個(gè)中間電子受體(IEA)組 成的試劑，選自 WST-1+mPMS，WST-3+mPMS, WST-4+mPMS, WST-5+mPMS, XTT+mPMS, MSN+mPMS, WST-I+Ql，WST-3+Q1，WST-4+Q1，WST-5+Q1，XTT+Q1，MSN+Q1，(2)至少一個(gè)水溶性四唑鹽化合 物選自WST-3, WST-10,WST-11,XTT,MTS ；或(3)至少有一個(gè)中間電子受體(IEA)選自mPMS 和Ql ；于藥用載體或介質(zhì)。
5.在權(quán)力要求1中所述的醫(yī)學(xué)應(yīng)用，其中的芹菜素，和至少有一個(gè)WST-Ir或任何 WST-Ir的有效的替代品可另外包括加入第三化合物以增強(qiáng)芹菜素和至少有一個(gè)WST-Ir和 WST任何有效的替代物聯(lián)合治療效果。
6.在權(quán)力要求5中所述的第三個(gè)化合物是選自GSK3·抑制劑包括氯化鋰(LiCl)。
7.對(duì)權(quán)利要求1的醫(yī)學(xué)應(yīng)用，其中說(shuō)，至少有一個(gè)WST-Ir和任何WST-Ir有效的替代品 是與caner細(xì)胞脈沖式接觸30分鐘-4個(gè)小時(shí)。
8.對(duì)權(quán)利要求1的醫(yī)學(xué)應(yīng)用，其中說(shuō)，惡性腫瘤包括癌和肉瘤。
9.一個(gè)配方包括(Comprising)至少一個(gè)化合物，至少一個(gè)WS-Ir或任何WST-Ir有效的替代品在藥物可以接受的載體中，以有效的劑量，同時(shí)，或分別，或相繼以任何順序給與需要 的癌癥患者以協(xié)同誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡。
10.在權(quán)力要求9中所述的組分，其中所說(shuō)“至少有一種化合物”是選自包括廣義生物 黃酮類化合物(flavonoids)包括“芹菜素(Apigenin) ”和IKK抑制劑。
11.對(duì)權(quán)利要求9的組分，其中說(shuō)WST-lr，或者至少有一種任何有效的WST-Ir替代品是選自(1)由至少一個(gè)水溶性四唑鹽化合物，和至少有一個(gè)中間電子受體(IEA)組成的試 齊[J，選自 WS-1+mPMS，WST-3-mPMS，WST-4+mPMS，WST-5+mPMS，XTT+mPMS，MSN+mPMS，WST-I+Ql， WST-3+Q1, WST-4+Q1, WST-5+Q1, XTT-Ql，MSN+Q1, (2)至少一個(gè)水溶性四唑鹽化合物選自 WST-3, WST-10, WST-11, XTT, MTS 或(3)至少有一個(gè)中間電子受體(IEA)選自 mPMS 禾口 Ql ； 于藥用載體或介質(zhì)。
12.—種誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡和治療哺乳動(dòng)物或癌癥病人的腫瘤的醫(yī)學(xué)應(yīng)用，包括 (comprising)在一個(gè)療程中同時(shí)，或以任何一種順序聯(lián)合應(yīng)用，給與可協(xié)同誘導(dǎo)腫瘤細(xì) 胞死亡的，包括藥學(xué)有效劑量的至少一種化合物，至少有一種IKK抑制劑，和至少有一種 WST-Ir或WST-Ir的任何有效的替代物，用于癌癥治療。
13.對(duì)權(quán)利要求12的醫(yī)學(xué)應(yīng)用，其中說(shuō)至少一種化合物是選自多聚核苷酸，合成 多聚核苷酸，蛋白質(zhì)，多肽，肽類，抗體，抗體片段，有機(jī)或無(wú)機(jī)抑制劑，能夠(1)更改或干擾 TPCR6(SEQ ID NO 2/6),SH3PXD2B(SEQ ID NO 3/7)，MAGI3(SEQ ID NO 4/8),TMEM182(SEQ ID NO 5/9)and C6orfl08(SEQ IDNO 14/15)的表達(dá)水平，結(jié)構(gòu)，功能和活性，⑵模仿 PUC19的生物學(xué)功能(SEQ ID NO :1)。
14.在權(quán)力要求13中所述的核苷酸是pUC19質(zhì)粒DNA載體(SEID NO :1)。
15.在權(quán)力要求13中所述的合成核苷酸進(jìn)一步選自siRNA，包括siRNA#l(SEQID NO 10)，siRNA#2 (SEQ IDNO 11), siRNA#3 (SEQ ID NO 12)，siRNA 序列根據(jù) pUC19 質(zhì)粒 DNA 序 列，以及針對(duì)人類 TPCR6 (SEQ ID NO 2)，SH3PXD2B (SEQ ID NO 3)，MAGI3 (SEQ ID NO 4)， TMEM182(SEQ ID NO 5)和 C6orfl08(SEQ IDNO :14)。
16.在權(quán)力要求13中所述的蛋白質(zhì)選自干擾素組包括IFN·Α，IFN .BdFN^CdFNd, IFN · F, IFN · G, IFN · H，IFN · I，IFN · J, IFN · K, IFN · 4b, IFN · WA, IFN · · IFN · · and IL-6。
17.在權(quán)力要求12中所述的至少有一個(gè)IKK抑制劑包括SPC839，苯胺嘧啶衍生物， PS1145,拜耳-345541*，氨基酸組成的咪唑衍生物，Ureudo-thiophcnecarboxamide衍生 物，Diarylpybidine ttj 生物，Pyridooxazinone ttj 生組 ife 擇，Indolecarboxamide ttj 生 物，苯并酰胺衍生物，吡唑并[4，3乙激酶抑制劑肽化激酶-κ-c]并喹啉衍生物，Imida zolylquinoline-carbxaldehyde脲衍生物，吡啶雙氰胺衍生物，我2抑制劑四[5_(對(duì) 氟苯基)-二脲基]噻吩-3-酰胺化激酶抑制劑二，Wedelolactone化激酶抑制劑七化 激酶-2 抑制劑伏 N-(3，5-雙三氟甲基)-5-氯-2-hydroxybenzamide IMD 的-0354， 激酶-2抑制劑六(5-苯基-2-脲基)噻吩-3甲酰胺化激酶_2抑制劑八ACHP 2-氨 基-6-(2-(cyclopropylmethoxy)-6-—S*S)-4-(4-哌啶基)_3_ 吡啶，和 SC-514*.
18.在權(quán)力要求12中所述的WST-lr，或者有至少一個(gè)WST-Ir任何有效的替代品是選 自(1)由至少一個(gè)水溶性四唑鹽化合物，和至少有一個(gè)中間電子受體(IEA)組成的試劑， 包括 WST-1+mPMS，WST-3+mPMS, WST-4+mPMS, WST-5+mPMS, KTT+mPMS, MSN+mPMS, WST-I+Ql, WST-3+Q1, WST-4+Q1, WST-5+Q1, XTT+Q1, MSN+Q1, (2)至少一個(gè)水溶性四唑鹽化合物選自 WST-3, WST-10, WST-11, XTT, MTS ；或(3)至少有一個(gè)中間電子受體(IEA)選自 mPMS 禾口 Ql ； 于藥用載體或介質(zhì)。
19.在權(quán)力要求12中所述的WST-lr，或者有至少一個(gè)WST-Ir任何有效的替代品是與 腫瘤細(xì)胞脈沖接觸30分鐘腫瘤-4個(gè)小時(shí)。
20.在權(quán)力要求12中所述的腫瘤包括癌和肉瘤。
21.一個(gè)配方包括(Comprising)至少一個(gè)化合物，至少有一名IKK抑制劑，至少一個(gè)WS-Ir或任何WST-Ir有效的替代品在藥物可以接受的載體中，以有效的劑量，同時(shí)，或分別，或相繼以任何順序給與需要 的癌癥患者以協(xié)同誘導(dǎo)癌細(xì)胞死亡。
22.對(duì)權(quán)利要求21的組分，其中說(shuō)至少一種化合物是選自(1)多聚核苷酸，包括PUC19質(zhì)粒DNA載體(SEQID NO 1)(2)合成多聚核苷酸，包括siRNA，包括 siRNA#l(SEQ ID NO 10), siRNA#2 (SEQ ID NO: 11)，siRNA#3(SEQ ID NO :12)，根據(jù)pUC19質(zhì)粒DNA序列設(shè)計(jì)的siRNA序列，以及針對(duì)人類 TPCR6(SEQ IDNO 2),SH3PXD2B(SEQ ID NO 3)，MAGI3(SEQ ID NO 4),TMEM182(SEQ ID NO: 5)和 C6orfl08(SEQ ID NO 14)的 siRNA。(3)干擾素包括:IFNIFNaA, IFNa B, IFNaG, IFNaD, IFNa F, IFNaG, IFN a H， IFNa I，IFNa J, IFNa K, IFNa 4b, IFNaffA, IFN^，IFNy，禾口 IL—6。(4)其它可更改或干擾TPCR6(SEQ ID NO 2/6), SH3PXD2B (SEQ ID NO 3/7) ,MAGI3 (SEQ ID NO :4/8)，TMEM182(SEQID NO 5/9) and C6orf 108 (SEQ ID NO 14/15)的表達(dá)水平，結(jié)構(gòu)， 功能和活性的生物分子，有機(jī)或無(wú)機(jī)抑制劑，可模仿PUC19的生物學(xué)功能(SEQ ID N0:1)與 IKK抑制劑和WST-Ir或WST-r有效的替代品聯(lián)合治療的藥物于藥用介質(zhì)。治療效果
23.對(duì)權(quán)利要求21的組分，其中說(shuō)至少有一個(gè)IKK抑制劑包括SPC839，苯胺嘧啶衍 生物，PS1145，拜耳-345541*，氨基酸組成的咪唑衍生物，Ureudo-thiophenecarboxamide ^ 生物，Diarylpybidine 哲]1 生物，Pyridooxazinone 哲]1 生組選擇，Indolecarboxamide ttj 生物，苯并酰胺衍生物，吡唑并-4，3乙激酶抑制劑肽化激酶-κ-c]并喹啉衍生物，Imid azolylquinoline-carbxaldehyde脲衍生物，吡啶雙氰胺衍生物，我2抑制劑四[5_(對(duì) 氟苯基)-二脲基]噻吩-3-酰胺化激酶抑制劑二，Wedelolactone化激酶抑制劑七化 激酶-2 抑制劑伏 N-(3，5-雙三氟甲基)-5_ 氯-2-hydroxybenzamide IMD 的-0354， 激酶一 2抑制劑六(5-苯基-2-脲基)噻吩-3甲酰胺化激酶_2抑制劑八ACHP 2-氨 基-6-(2-(cyclopropymethoxy) -6-羥基苯基)-4 (4_ 哌啶基)_3_ 吡啶，和 SC-514*.
24.對(duì)權(quán)利要求21的組分，其中說(shuō)至少有一個(gè)WST-Ir和任何WST-Ir有效的替代品 選自(1)由至少一個(gè)水溶性四唑鹽化合物，和至少有一個(gè)中間電子受體(IEA)組成的試劑， 選自 WST-1+mPMS，WST-3+mPMS, WST-4+mPMS, WST-5+mPMS, XTT+mPMS, MSN+mPMS, WST-I+Ql, WST-3+Q1, WST-4+Q1, WST-5+Q1, XTT+Q1, MSN+Q1, (2)至少一個(gè)水溶性四唑鹽化合物選自 WST-3, WST-10, WST-11, XTT, MTS ；或(3)至少有一個(gè)中間電子受體(IEA)選自 mPMS 禾口 Ql ； 于藥用載體或介質(zhì)。
25.WST-Ir藥物成分和任何WST-Ir有效的替代品包括(comprising)水溶性四唑鹽，和中間電子受體。
26.對(duì)權(quán)利要求25的組分，其中說(shuō)=WST-Ir的化合物的組合包括一個(gè)水溶性四唑鹽是WST-I，和一個(gè) IEA 是 mPMS在可接受的藥用載體或介質(zhì)。
27.對(duì)權(quán)利要求25的組分，其中，凹唑鹽選自一組四唑鹽包括WST-3，WST-4,WST-5, WST-9, WST-10, WST-11, XTT和MTS于可接受的載體或介質(zhì)之中。
28.對(duì)權(quán)利要求25的組分，其中，IEA選自MPM和Ql于可接受的載體或介質(zhì)。
29.對(duì)權(quán)利要求25的組分，其中說(shuō)，任何WST-Ir有效的替代品選自(1)組成的化合物 的包括，至少一個(gè)水溶性四唑鹽和至少一個(gè)IEA，或(2)至少有一個(gè)水溶性四唑鹽，或(3)至 少有一個(gè)IEA，在可以接受的藥用載體或介質(zhì)。
30.對(duì)權(quán)利要求29的組分，其中說(shuō)，任何WST-Ir有效的替代品選自(1)一組化合 物包括對(duì)至少一個(gè)水溶性四唑鹽化合物的組合組選中，和至少有一個(gè)IE A進(jìn)一步選自 WST-1+mPMS, WST 3+mPMS, WST-4+mPMS, WST-5+mPMS, XTT+mPMS, MTS+mPMS, WST-1+Q1, WST-3+Q1, WST-4+Q1, WST-5+Q1, XTT+Q1, MTS+Q1 于藥用介質(zhì)。
31.對(duì)權(quán)利要求29的組分，其中說(shuō)，任何WST-Ir有效的替代物選自四唑鹽單獨(dú)應(yīng)用，包 括 WST-I，WST-3, WST-4, WST-5，WST-9, WST-10, WST-11, XTT, MTSjP Ql 于可以接受的載體 中。
32.對(duì)權(quán)利要求31的組分，其中說(shuō)，至少有一個(gè)四唑鹽WST-3于可以接受的載體中。
33.對(duì)權(quán)利要求29的組分，其中說(shuō)，至少有一個(gè)IEA進(jìn)一步選自包括mPMS和Ql的一組 IEA在可接受的載體中。
34.一種誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡和治療哺乳動(dòng)物或癌癥病人的腫瘤的醫(yī)學(xué)應(yīng)用，包括 (comprising)在一個(gè)療程中同時(shí)，或以任何一種順序聯(lián)合應(yīng)用，給與可協(xié)同誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞 死亡的，包括藥學(xué)有效劑量的至少一種化合物，和至少一個(gè)細(xì)胞毒性化療藥物，用于腫瘤病人的治療。
35.對(duì)權(quán)利要求34的醫(yī)學(xué)應(yīng)用稱，至少其中一個(gè)化合物是從生物和非生物有機(jī)或無(wú)機(jī) 化合物組成的，能夠攻擊和干擾 TPRC6 (SEQ ID NO :2，NO :6)，SH3PXD2B (SEQ ID NO :3，NO 7)，MAGI3(SEQ ID NO :4，NO :8)，TMEM182 (SEQ ID NO :5，NO :9)和 C6orfl08 (SEQ ID NO: 14， NO 15)的表達(dá)水平，分子結(jié)構(gòu)，功能和活性。
36.根據(jù)對(duì)權(quán)利要求34的醫(yī)學(xué)應(yīng)用，其中說(shuō)，生物分子進(jìn)一步選自多核苷酸，合成多核 苷酸，蛋白質(zhì)，肽類，多肽，抗體，抗體片段。
37.對(duì)權(quán)利要求36其中說(shuō)，多核苷酸是純化的PUC19質(zhì)粒(SEQID NO :1)。
38.根據(jù)對(duì)權(quán)利要求35其中說(shuō)，合成的多核苷酸是選自一組siRNA，成員包括 siRNA#l(SEQ ID NO 10), siRNA#2 (SEQ ID NO 11), siRNA#3 (SEQ ID NO 12)；根據(jù) pUC19 質(zhì) 粒 DNA 序列設(shè)計(jì)的 siRNA 序列，以及針對(duì)人類 TPCR6 (SEQ ID NO 2), SH3PXD2B (SEQ ID NO 3), MAGI3(SEQ ID NO :4)，TMEM182 (SEQ IDNO 5)和 C6orfl08(SEQ ID NO 14)的 siRNA。
39.根據(jù)對(duì)權(quán)利要求34其中說(shuō)，其中至少有一個(gè)細(xì)胞毒性化療藥物包括紫杉醇 (Taxol. RTM組選中。)，順鉬，多西紫杉醇，卡鉬，長(zhǎng)春新堿，長(zhǎng)春堿，甲氨蝶呤，環(huán)磷酰胺，中 華映管_11，5氟尿嘧啶(5-FU的)，吉西他濱，雌莫司汀，卡氮芥，阿霉素(阿霉素)，足葉乙 甙，三氧化二砷，伊立替康，和埃博霉素衍生物在藥學(xué)上可接受的載體中。
40.根據(jù)對(duì)權(quán)利要求34其中說(shuō)，癌癥包括前列腺癌，結(jié)直腸，胰腺，宮頸癌，胃癌，子宮內(nèi)膜癌，腦，肝，膀胱，卵巢組選定，睪丸，頭部，頸部，皮膚(包括惡性黑色素瘤和基底細(xì)胞 癌)，皮襯里，食道，乳腺，肌肉，結(jié)締組織，肺(包括小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞癌)，腎上腺，甲 狀腺，腎，或骨膠質(zhì)瘤，間皮瘤，腎細(xì)胞癌，胃癌，肉瘤，絨毛膜癌，皮膚基地細(xì)胞癌，睪丸精 原細(xì)胞瘤，和肉瘤，軟組織肉瘤。
41.一種配方，包括有效的劑量的(comprising)至少一種化合物，可以(1)更改或干擾 TPCR6 (SEQ. ID NO :2/6)，SH3PXD2B (SEQ. ID NO 3/7)，MAGI3 (SEQ. ID NO 4/8)，TMEM182 (SEQ. ID NO 5/9)和 C6orf 108 (SEQ. ID NO 14/15) 的表達(dá)水平，分子結(jié)構(gòu)，功能和活性，⑵模仿PUC19的生物學(xué)功能(SEQ. ID NO 1)和至少一個(gè)化療藥物。在藥學(xué)上可接受的載體中。
42.根據(jù)對(duì)權(quán)利要求41的藥物配方，其中說(shuō)至少有1化療藥物選自紫杉醇組成 (Taxol. RTM組選中。)，順鉬，多西紫杉醇，卡鉬，長(zhǎng)春新堿，長(zhǎng)春堿，甲氨蝶呤，環(huán)磷酰胺，中 華映管_11，5氟尿嘧啶(5-FU的)，吉西他濱，雌莫司汀，卡氮芥，阿霉素(阿霉素)，足葉乙 甙，三氧化二砷，伊立替康，和埃博霉素衍生物在藥學(xué)上可接受的載體中。根據(jù)對(duì)權(quán)利要求41的藥物組成，其中說(shuō)至少有一個(gè)生物化合物是包括(1)多核苷 酸包括PUC19質(zhì)粒DNA載體(SEQ. ID NO 1), (2)合成核苷酸進(jìn)一步選自siRNA組包括 siRNA#l (SEQ ID NO 10)，siRNA#2 (SEQ IDNO 11), siRNA#3(SEQ ID NO 12)，根據(jù) pUC19 質(zhì)粒 DNA 序列設(shè)汁的 siRNAs，針對(duì)人類 TPCR6 (SEQ. ID NO 2), SH3PXD2B (SEQ. ID NO 3)， MAGI3 (SEQ. ID NO 4), TMEM182 (SEQ. ID NO 5)和 C6orfl08 (SEQ. ID NO 14)的 mRNA 設(shè)計(jì)的 siRNA在藥學(xué)上可接受載體中。
43.一種誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡和治療哺乳動(dòng)物或癌癥病人的腫瘤的醫(yī)學(xué)應(yīng)用，包括 (comprising)在一個(gè)療程中同時(shí)，或以任何一種順序聯(lián)合應(yīng)用，給與可協(xié)同誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞 死亡的，包括藥學(xué)有效劑量的一個(gè) stattic,禾口至少有一個(gè)NF- · β抑制劑用于癌癥治療。
44.根據(jù)對(duì)權(quán)利要求43的醫(yī)學(xué)應(yīng)用，其中說(shuō)，至少有一個(gè)NF-kB抑制劑選自IKK抑制 劑和CK2
45.根據(jù)對(duì)權(quán)利要求43的醫(yī)學(xué)應(yīng)用，其中說(shuō)腫瘤是敏感的頭頸部鱗狀上皮癌的治療。
46.用于癌癥治療藥物的靶目標(biāo)基因包括核苷酸序列包括:SEQ. ID NO :2，3，4，5，14，和相應(yīng)的多肽的氨基酸序列SEQ. ID NO :6，7，8，9和15。
47.根據(jù)對(duì)權(quán)利要求18和19，其中說(shuō)，pUC19質(zhì)粒的的有效的替代品，包括a)人工合成的siRNA，包括22至25堿基的核苷酸組成的根據(jù)pUC19的DNA序 列(SEQ. ID. NO :1)合成的 siRNA:SEQ ID NO :10 (pUC195，396-418，22bases)，11 (pUC 19 5，797-820，23bases)，and 12(pUC 5，1561-1586，25bases)，和針對(duì)權(quán)利要求 46 的基因的核苷酸序列，氨基酸序列的siRNAs的，反義RNA (antiscnse-RNA)，反義寡核 苷酸(antisenseOligo)，抗體，多肽抑制劑，小分子抑制劑，或顯性負(fù)DNA (dominant negsative)。
全文摘要
本發(fā)明介紹了新的能夠誘導(dǎo)JNK磷酸化，可誘導(dǎo)程序性細(xì)胞死亡的，協(xié)同加強(qiáng)抗癌藥物的療效，可作為藥物的化合物，組合藥物配方，和癌癥治療的醫(yī)學(xué)應(yīng)用。本發(fā)明還包括可作為藥物作用靶目標(biāo)的基因，可用于開(kāi)發(fā)新的癌癥治療藥物。本發(fā)明為更有效率和低或無(wú)細(xì)胞毒性治療癌癥提出了一個(gè)新的發(fā)展新途徑。
文檔編號(hào)A61K31/353GK101842095SQ200880023062
公開(kāi)日2010年9月22日 申請(qǐng)日期2008年7月2日 優(yōu)先權(quán)日2007年7月2日
發(fā)明者于明 申請(qǐng)人:于明