專利名稱：以環(huán)糊精為偶聯(lián)劑的單抗藥物偶聯(lián)物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種以環(huán)糊精分子作為偶聯(lián)劑，將單克隆抗體(單抗)與藥物進(jìn)行偶聯(lián)并用于腫瘤治療的方法。
環(huán)糊精(cyclodextrin)是一種小分子葡聚糖，包括α、β和γ三種，分子量為分別為973、1135和1297Da。
為提高單抗藥物偶聯(lián)物對(duì)腫瘤組織的穿透力，增強(qiáng)抗腫瘤作用，需將偶聯(lián)物分子小型化。已報(bào)道，以葡聚糖T-40為偶聯(lián)劑構(gòu)建的完整單抗或單抗Fab’片段與抗腫瘤抗生素平陽霉素(PYM)偶聯(lián)物，其分子量分別為270kDa和170kDa；兩種偶聯(lián)物均有較游離PYM更強(qiáng)的抗腫瘤作用(藥學(xué)學(xué)報(bào)2000,35:649)。但未見將單抗Fab’片段與PYM偶聯(lián)物分子進(jìn)一步裁小的報(bào)道。據(jù)報(bào)道，β-環(huán)糊精與二苯基乙酸的偶聯(lián)物與盲腸和結(jié)腸的內(nèi)容物共同孵育，可釋放出β-環(huán)糊精和二苯基乙酸，但偶聯(lián)物與胃和小腸的內(nèi)容物共同孵育時(shí)，卻非常穩(wěn)定，表明β-環(huán)糊精與藥物的共價(jià)偶聯(lián)物可作為靶向藥物載體(Journal of Pharmacy and Pharmacology,1996,48:27)。β-環(huán)糊精與甲氧基-甘氨酸-甘氨酸-亮氨酸-(2S,3S)-環(huán)氧琥珀酸-亮氨酸-脯氨酸偶聯(lián)物對(duì)腫瘤細(xì)胞有良好的靶向性，該偶聯(lián)物可與氨甲蝶呤形成共合物(Bioorganic and Medicinal ChemistryLetter,2000,10:677)。表明環(huán)糊精分子是良好的靶向藥物載體，但迄今為止，國內(nèi)外均未見以環(huán)糊精分子作為單抗與藥物連接的偶聯(lián)劑的報(bào)道。本項(xiàng)發(fā)明的研究表明，以環(huán)糊精分子為偶聯(lián)劑構(gòu)建的單抗活性片段與藥物的偶聯(lián)物不僅具有分子量小的特點(diǎn)，而且具有明顯抗腫瘤作用，有可能成為新型的抗腫瘤單抗導(dǎo)向藥物。
本發(fā)明的目的是以環(huán)糊精分子作為偶聯(lián)劑，制備分子小型化的單抗活性片段與平陽霉素偶聯(lián)物，用于臨床治療腫瘤。本發(fā)明的內(nèi)容與要點(diǎn)是1．單抗3D6的Fab’片段制備小鼠抗Ⅳ型膠原酶單抗3D6用0.05mol/L的Tris緩沖液(含2mmol/L EDTA,1mmol/L半胱胺酸)調(diào)整為4mg/ml,pH7.2。加入適量無花果蛋白酶，37℃反應(yīng)6小時(shí)，產(chǎn)物經(jīng)Sephadex G-150層析純化獲得F(ab’)2片段。F(ab’)2片段經(jīng)β-巰基乙醇還原和Sephadex G-75層析純化獲得Fab’片段，其分子量約為53kDa。
2．Fab’片段與平陽霉素偶聯(lián)物的制備β-環(huán)糊精經(jīng)高碘酸鈉氧化后以Sephadex G-10純化，去離子水洗脫。收集僅與斐林試劑反應(yīng)而與硝酸銀無反應(yīng)的洗脫液部分，冷凍干燥，得多醛基β-環(huán)糊精(PAC)。按一定比例將PAC與PYM共溶于適量磷酸鹽緩沖液(PBS)中，4℃避光攪拌12小時(shí)，加入單抗Fab′片段繼續(xù)反應(yīng)12小時(shí)。0.3mol/L硼氫化鈉還原2小時(shí)，以截留分子量為10kDa的透析袋攪拌透析24h，透析內(nèi)液即為偶聯(lián)物Fab’-平陽霉素。
3．偶聯(lián)物中單抗Fab′片段、環(huán)糊精及PYM的含量以分光光度法測定偶聯(lián)物中各組分含量并計(jì)算分子比和偶聯(lián)物分子量。結(jié)果表明，偶聯(lián)物中Fab′片段、環(huán)糊精及PYM的分子比為1∶2.4∶7.3，偶聯(lián)物分子量為68kDa。
4．偶聯(lián)物免疫活性偶聯(lián)物免疫活性用ELISA法進(jìn)行測定。偶聯(lián)物與人體肺癌PG細(xì)胞、口腔鱗癌KB細(xì)胞及小鼠肝癌22細(xì)胞(H22)均呈免疫學(xué)陽性反應(yīng)，但與肝癌BEL-7402細(xì)胞無反應(yīng)，表明偶聯(lián)物對(duì)腫瘤細(xì)胞的反應(yīng)具有選擇性(圖1)。
5．偶聯(lián)物對(duì)體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞的作用體外培養(yǎng)的KB和BEL-7402細(xì)胞，用克隆形成法測定，藥物作用1小時(shí)。偶聯(lián)物對(duì)靶細(xì)胞KB的作用強(qiáng)于游離平陽霉素，二者抑制50％克隆形成的濃度(IC50)分別為0.02μmol/L和0.42μmol/L；偶聯(lián)物對(duì)非靶細(xì)胞BEL-7402的作用略低于游離平陽霉素，IC50分別為0.51μmol/L和0.17μmol/L。表明偶聯(lián)物對(duì)靶細(xì)胞具有選擇性殺傷作用(圖2，圖3)。
6．偶聯(lián)物對(duì)動(dòng)物皮下移植肝癌22的治療作用昆明小鼠皮下接種1.5×106個(gè)細(xì)胞。至第7天，腫瘤直徑達(dá)4-5mm，此時(shí)分組并開始治療。靜脈注射平陽霉素或偶聯(lián)物，隔日給藥一次，共5次。實(shí)驗(yàn)期間每兩天測定一次腫瘤大小，以公式1/2ab2(a腫瘤長徑；b腫瘤短徑)計(jì)算腫瘤體積。實(shí)驗(yàn)第21天處死動(dòng)物，稱皮下瘤重，計(jì)算抑瘤率。結(jié)果表明，治療期間，生理鹽水對(duì)照組腫瘤生長迅速，平陽霉素和偶聯(lián)物對(duì)腫瘤生長有抑制作用；停止治療后，平陽霉素組腫瘤生長較快，但偶聯(lián)物對(duì)腫瘤生長仍有抑制作用(圖4)。實(shí)驗(yàn)第21天，對(duì)照組和平陽霉素治療組腫瘤分別達(dá)9.90±1.80g和8.47±1.19g，偶聯(lián)物治療組腫瘤分別為2.67±1.64g和1.87±0.92g，表明偶聯(lián)物有明顯抑瘤作用(表1)。
表1偶聯(lián)物對(duì)小鼠肝癌22的抑制作用
皮下接種腫瘤，靜脈給藥，兩天一次；**p＜0.01與對(duì)照組比較△△ p＜0.01與平陽霉素組比較7．Fab′-CD-PYM偶聯(lián)物對(duì)動(dòng)物主要臟器的影響病理組織切片結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)所用劑量的偶聯(lián)物，動(dòng)物心、肝、脾、肺、腎、胃、小腸和股骨均未見毒性病變。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是確定了一種新的制備單抗藥物偶聯(lián)物方法。平陽霉素是臨床常用的抗腫瘤藥物，以環(huán)糊精分子為偶聯(lián)劑構(gòu)建的平陽霉素與單抗活性片段偶聯(lián)物具有分子量小的優(yōu)點(diǎn)，而且抗腫瘤作用明顯強(qiáng)于游離平陽霉素，有可能開發(fā)成新型抗腫瘤導(dǎo)向藥物用于臨床腫瘤治療，并取得良好療效。


圖1單抗Fab’-平陽霉素偶聯(lián)物與PG、KB、H22和BEL-7402細(xì)胞的免疫反應(yīng)性其中橫坐標(biāo)為抗體濃度(mg/ml)縱坐標(biāo)為490nm吸光值1為人肺癌PG細(xì)胞2為人口腔鱗癌KB細(xì)胞3為小鼠肝癌22細(xì)胞4為人肝癌BEL-7402細(xì)胞圖2平陽霉素及Fab’-平陽霉素偶聯(lián)物對(duì)KB細(xì)胞的抑制作用其中橫坐標(biāo)為平陽霉素濃度(μmol/L)縱坐標(biāo)為克隆形成率(％)1為平陽霉素2為Fab’-平陽霉素偶聯(lián)物圖3平陽霉素及Fab’-平陽霉素偶聯(lián)物對(duì)BEL-7402細(xì)胞的抑制作用其中橫坐標(biāo)為平陽霉素濃度(μmol/L)縱坐標(biāo)為克隆形成率(％)1為平陽霉素2為Fab’-平陽霉素偶聯(lián)物圖4平陽霉素及Fab’-平陽霉素偶聯(lián)物對(duì)小鼠皮下接種肝癌22的抑制作用其中橫坐標(biāo)為接種后天數(shù)(天)縱坐標(biāo)為腫瘤體積(cm3)1為對(duì)照2為10mg/kg劑量的平陽霉素3為5mg/kg劑量的Fab’-平陽霉素偶聯(lián)物4為10mg/kg劑量的Fab’-平陽霉素偶聯(lián)物
權(quán)利要求
1．以環(huán)糊精為偶聯(lián)劑的單克隆抗體(單抗)藥物偶聯(lián)物，其特征是所說的偶聯(lián)物的實(shí)施包括以下步驟A．單抗3D6的Fab’活性片段的制備；B．以環(huán)糊精分子為偶聯(lián)劑將Fab’片段與平陽霉素偶聯(lián)；C．Fab’-平陽霉素偶聯(lián)物分子構(gòu)成和分子量測定；D．Fab’-平陽霉素偶聯(lián)物抗腫瘤作用的檢測；
2．按照權(quán)利要求1所述的偶聯(lián)物，其特征是利用抗Ⅳ型膠原酶單克隆抗體3D6制備Fab’片段。
3．按照權(quán)利要求1所述的偶聯(lián)物，其特征是Fab’片段與平陽霉素偶聯(lián)物的制備是先將環(huán)糊精分子以高碘酸鈉氧化，再分別與Fab’片段及平陽霉素偶聯(lián)，經(jīng)透析獲得Fab’-平陽霉素偶聯(lián)物。
4．按照權(quán)利要求1所述的偶聯(lián)物，其特征是體外培養(yǎng)的人體口腔鱗癌KB細(xì)胞和肝癌BEL-7402細(xì)胞，用克隆形成法檢測平陽霉素及Fab’-平陽霉素偶聯(lián)物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用。
5．按照權(quán)利要求1所述的偶聯(lián)物，其特征是動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，昆明小鼠皮下接種肝癌22，通過靜脈注射給藥判斷平陽霉素及Fab’-平陽霉素偶聯(lián)物對(duì)腫瘤生長的抑制作用。
全文摘要
以環(huán)糊精分子為偶聯(lián)劑,以適當(dāng)方法獲得抗Ⅳ型膠原酶單抗3D6 Fab’片段,將Fab’片段與平陽霉素偶聯(lián),獲得偶聯(lián)物Fab’－平陽霉素,分光光度法測定結(jié)果表明偶聯(lián)物分子量為68kDa,偶聯(lián)物對(duì)人口腔鱗癌KB細(xì)胞、小鼠肝癌22細(xì)胞等呈陽性免疫反應(yīng),以克隆形成法檢測偶聯(lián)物對(duì)體外培養(yǎng)的KB細(xì)胞的殺傷作用,結(jié)果表明偶聯(lián)物對(duì)靶細(xì)胞KB的作用強(qiáng)于平陽霉素,體內(nèi)實(shí)驗(yàn)用肝癌22模型,Fab’－平陽霉素偶聯(lián)物抑制肝癌生長作用明顯強(qiáng)于等劑量平陽霉素,確定以環(huán)糊精作為偶聯(lián)劑可制備新型、有效的抗腫瘤單抗導(dǎo)向藥物并用于腫瘤治療。
文檔編號(hào)A61K39/395GK1305847SQ0110193
公開日2001年8月1日 申請(qǐng)日期2001年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月18日
發(fā)明者甄永蘇, 劉小云, 劉秀均, 李毅 申請(qǐng)人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所