專(zhuān)利名稱(chēng)：：用于遞送核酸的peg-pei共聚物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本文所述的實(shí)施方案涉及將siRNA遞送至細(xì)胞內(nèi)的組合物和方法。更具體地說(shuō)，本文所述的實(shí)施方案涉及涂有水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物的將siRNA遞送至細(xì)胞內(nèi)的板。相關(guān)技術(shù)描述可利用許多技術(shù)將質(zhì)粒DNA編碼的siRNA遞送至細(xì)胞內(nèi)。例如，陽(yáng)離子聚合物已用作基因載體，該陽(yáng)離子聚合物包括聚(L-賴(lài)氨酸)(PLL)、聚乙烯亞胺(PEI)、殼聚糖、PAMAM樹(shù)枝狀聚合物和聚甲基丙烯酸(2-二甲氨基)乙酯(pDMAEMA)。遺憾的是，使用PLL時(shí)轉(zhuǎn)染率尤其差，并且高分子量的PLL表現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞明顯的毒性。在一些情況下，PEI提供了有效的基因轉(zhuǎn)移而不需要分解內(nèi)體試劑(endosomolytic)或靶向劑(參見(jiàn)BoussifO.，etal.，ProcNatlAcadSciUSA.Aug.1，1995，92(16)7297-301)。已研究了一系列的聚酰胺_胺樹(shù)枝狀聚合物作為基因遞送系統(tǒng)(參見(jiàn)EichmanJ.D.，etal.，Pharm.Sci.Technol.Today2000July;3(7):232-245)。遺憾的是，已報(bào)道了高分子量的PEI和已發(fā)現(xiàn)能夠提供良好的轉(zhuǎn)染效率的樹(shù)枝狀聚合物對(duì)細(xì)胞有毒。已報(bào)道用可降解的陽(yáng)離子聚合物制備的質(zhì)粒DNA載體將質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)，并具有降低的細(xì)胞毒性。(參見(jiàn)LimY.B.，etal.，J.Am.Chem.Soc，123(10)，2460-2461，2001)。
發(fā)明內(nèi)容本文所述的實(shí)施方案涉及用于siRNA遞送的組合物。在實(shí)施方案中，用于siRNA遞送的該組合物可以包含水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物，該陽(yáng)離子聚合物可包括(a)重復(fù)的聚乙二醇(PEG)主鏈單元；(b)重復(fù)的陽(yáng)離子聚乙烯亞胺(PEI)主鏈單元和(c)重復(fù)的含有側(cè)鏈脂質(zhì)基團(tuán)的可降解主鏈單元。本文所述的實(shí)施方案涉及制備本文所述的水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物的方法。在一些實(shí)施方案中，水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物可以通過(guò)如下方法合成將含有乙亞胺重復(fù)單元的第一反應(yīng)物溶解在有機(jī)溶劑中以形成溶解的或部分溶解的高分子反應(yīng)物；將該溶解的或部分溶解的高分子反應(yīng)物與可降解單體反應(yīng)物反應(yīng)以形成可降解的交聯(lián)聚合物，其中該可降解單體反應(yīng)物含有脂質(zhì)基團(tuán)；將該可降解的交聯(lián)聚合物與第三反應(yīng)物反應(yīng)，其中該第三反應(yīng)物含有重復(fù)的聚乙二醇單元。本文所述的實(shí)施方案涉及遞送siRNA至細(xì)胞內(nèi)的方法，該方法包括如下步驟將本文所述的任何一種水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物與siRNA混合以形成混合物；并將該混合物與一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞接觸。更優(yōu)選地，siRNA具有19-27個(gè)堿基對(duì)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。更優(yōu)選的是該哺乳動(dòng)物細(xì)胞為癌細(xì)胞。本文所述的實(shí)施方案涉及治療或降低心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的方法，該方法可包括將與本文所述的水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物復(fù)合的、與脂蛋白基因片段的編碼區(qū)的至少一部分相對(duì)應(yīng)的siRNA對(duì)需要的個(gè)體給藥。本文所述的實(shí)施方案涉及用siRNA轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞的裝置，該裝置包括至少部分地固定有含有轉(zhuǎn)染試劑的組合物的固體表面，其中所述轉(zhuǎn)染試劑選自水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物、陽(yáng)離子聚合物、脂質(zhì)聚合物、聚乙二醇化陽(yáng)離子聚合物、聚乙二醇化脂質(zhì)聚合物、陽(yáng)離子脂質(zhì)、聚乙二醇化陽(yáng)離子脂質(zhì)和陽(yáng)離子可降解聚乙二醇化脂質(zhì)聚合物。本文所述的實(shí)施方案涉及測(cè)定siRNA是否能夠進(jìn)入真核細(xì)胞的方法。該方法可包括一個(gè)或多個(gè)如下的步驟(a)提供本文所述的裝置；(b)將siRNA加入該裝置中以使siRNA與轉(zhuǎn)染試劑相互作用；(c)將該真核細(xì)菌以充足的密度并在適于將siRNA引入細(xì)胞內(nèi)的條件下接種到所述裝置上；(d)檢測(cè)siRNA是否已經(jīng)進(jìn)入該細(xì)胞中。本文所述的實(shí)施方案涉及用于將siRNA引入真核細(xì)胞中的方法，該方法可包括如下步驟(a)提供至少部分地涂有本文所述的水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物的固體表面；(b)將待被引入至真核細(xì)胞內(nèi)的siRNA加入至細(xì)胞表面上；以及(c)將該細(xì)胞以充足的密度并在適于將siRNA引入細(xì)胞內(nèi)的條件下接種到固體表面上。附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明圖1顯示合成一部分的水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物的方法。圖2顯示siRNA轉(zhuǎn)染后，在HeLa細(xì)胞內(nèi)綠色熒光蛋白的活性百分率。在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中所使用的水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物如下聚合物2(可降解單元pei:peg(12:i:2))、聚合物3(可降解單元pei:peg(16:i:2))、聚合物4(可降解單元pei:peg(17:i:2))和聚合物5(可降解單元PEI:PEG(20:1:2))。對(duì)照為PEI1200、Cytopure、Lipofectamine2000和可降解單元PEI(5:l)，所有均為摩爾比。聚合物與siRNA的比例為2:1。圖3顯示siRNA轉(zhuǎn)染后，在B16F0細(xì)胞內(nèi)綠色熒光蛋白的活性百分率。該水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物、對(duì)照和聚合物/siRNA的比例如圖2的圖例所述。圖4顯示在用siRNA轉(zhuǎn)染后，HeLa細(xì)胞的細(xì)胞存活百分率。該水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物、對(duì)照和聚合物/siRNA的比例如圖2的圖例所述。圖5顯示使用起始材料聚乙烯亞胺-1200道爾頓(支化的PEI-l.2K，陰性對(duì)照)、質(zhì)粒遞送試劑Cytopure(陰性對(duì)照)、Lipofectamine2000TM(L2K)以及聚合物1，繪制HeLa細(xì)胞的綠色熒光(GFP)活性(％)的柱狀圖。聚合物與siRNA的比例為5:1。結(jié)果顯示與其它已知的質(zhì)粒遞送劑Cytopure相比，聚合物1和Lipofectamine2000提供了更好的siRNA涂布遞送以抑制基因表達(dá)。聚合物1為水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物，其可降解單元pei:peg的摩爾比為5:i:2。圖6顯示使用起始材料聚乙烯亞胺-1200道爾頓(支化的PEI-1.2K，陰性對(duì)照)、質(zhì)粒遞送試劑Cyt0pure(陰性對(duì)照)、Lipofectamine2000(L2K)以及聚合物1，繪制HeLa細(xì)胞的細(xì)胞存活力(％)的柱狀圖。聚合物1為水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物，其可降解單元PEi:PEG的摩爾比為5:i:2。聚合物與siRNA的比例為5:i。結(jié)果表明在此測(cè)定中聚合物1與L2K不顯示細(xì)胞毒性。圖7顯示使用起始材料聚乙烯亞胺-1200道爾頓(支化的PEI-l.2K，陰性對(duì)照)、質(zhì)粒遞送試劑Cytop訓(xùn)TM(陰性對(duì)照)、Lipofectamine2000(L2K)以及聚合物1，繪制HeLa細(xì)胞的綠色熒光(GFP)活性(％)的柱狀圖。聚合物1為水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物，其可降解單元PEI:PEG的摩爾比為5:1:2。聚合物與siRNA的比例為10:1。結(jié)果顯示與質(zhì)粒遞送劑CytopureTM相比，聚合物l和L2K提供了相當(dāng)?shù)膕iRNA涂布遞送以抑制基因表達(dá)。圖8顯示使用起始材料聚乙烯亞胺-1200道爾頓(支化的PEI-l.2K，陰性對(duì)照)、質(zhì)粒遞送試劑Cytop訓(xùn)TM(陰性對(duì)照)、Lipofectamine2000(L2K)以及聚合物1，繪制HeLa細(xì)胞的細(xì)胞存活力(％)的柱狀圖。聚合物1為水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物，其可降解單元pei:peg的摩爾比為5:i:2。聚合物與siRNA的比例為io:i。結(jié)果表明在此測(cè)定中聚合物1與L2K不顯示細(xì)胞毒性。圖9顯示使用起始材料聚乙烯亞胺-1200道爾頓(支化的PEI-l.2K，陰性對(duì)照)、質(zhì)粒遞送試劑Cytop訓(xùn)TM(陰性對(duì)照)、Lipofectamine2000(L2K)以及聚合物1，繪制B16F0細(xì)胞的綠色熒光(GFP)活性(％)的柱狀圖。聚合物1為水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物，其可降解單元PEI:PEG的摩爾比為5:1:2。聚合物與siRNA的比例為2.5:1。結(jié)果顯示與質(zhì)粒遞送劑CytopureTM相比，聚合物l和L2K提供了更好的siRNA涂布遞送以抑制基因表達(dá)。圖10顯示使用起始材料聚乙烯亞胺-1200道爾頓(支化的PEI-l.2K，陰性對(duì)照)、質(zhì)粒遞送試劑Cytop訓(xùn)TM(陰性對(duì)照)、Lipofectamine2000(L2K)以及聚合物1，繪制B16F0細(xì)胞的細(xì)胞存活力(％)的柱狀圖。聚合物1為水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物，其可降解單元PEI:PEG的摩爾比為5:1:2。聚合物與siRNA的比例為2.5:1。結(jié)果表明在此測(cè)定中聚合物1與L2K沒(méi)有顯示細(xì)胞毒性。圖11顯示使用起始材料聚乙烯亞胺-1200道爾頓(支化的PEI-l.2K，陰性對(duì)照)、質(zhì)粒遞送試劑Cytop訓(xùn)TM(陰性對(duì)照)、Lipofectamine2000(L2K)以及聚合物1，繪制B16F0細(xì)胞的綠色熒光(GFP)活性(％)的柱狀圖。聚合物1為水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物，其可降解單元PEI:PEG的摩爾比為5:1:2。聚合物與siRNA的比例為5:1。結(jié)果顯示與質(zhì)粒遞送劑CytopureTM相比，聚合物l和L2K提供了更好的siRNA涂布遞送以抑制基因表達(dá)。圖12顯示使用起始材料聚乙烯亞胺-1200道爾頓(支化的PEI-l.2K，陰性對(duì)照)、質(zhì)粒遞送試劑Cytop訓(xùn)TM(陰性對(duì)照)、Lipofectamine2000(L2K)以及聚合物1，繪制B16F0細(xì)胞的細(xì)胞存活力(％)的柱狀圖。聚合物1為水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物，其可降解單元pei:peg的摩爾比為5:i:2。聚合物與siRNA的比例為5:i。結(jié)果表明在此測(cè)定中聚合物1與L2K沒(méi)有顯示細(xì)胞毒性。圖13顯示使用起始材料聚乙烯亞胺-1200道爾頓(支化的PEI-l.2K，陰性對(duì)照)、質(zhì)粒遞送試劑Cytop訓(xùn)TM(陰性對(duì)照)、Lipofectamine2000(L2K)以及聚合物1，繪制11B16F0細(xì)胞的綠色熒光(GFP)活性(％)的柱狀圖。聚合物1為水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物，其可降解單元PEI:PEG的摩爾比為5:1:2。聚合物與siRNA的比例為10:1。結(jié)果顯示與質(zhì)粒遞送劑CytopureTM相比，聚合物l和L2K提供了更好的siRNA涂布遞送以抑制基因表達(dá)。圖14顯示使用起始材料聚乙烯亞胺-1200道爾頓(支化的PEI-l.2K，陰性對(duì)照)、質(zhì)粒遞送試劑Cytop訓(xùn)TM(陰性對(duì)照)、Lipofectamine2000(L2K)以及聚合物1，繪制B16F0細(xì)胞的細(xì)胞存活力(％)的柱狀圖。聚合物1為水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物，其可降解單元pei:peg的摩爾比為5:i:2。聚合物與siRNA的比例為io:i。結(jié)果表明在此測(cè)定中聚合物1與L2K沒(méi)有顯示細(xì)胞毒性。圖15顯示在H印G2細(xì)胞培養(yǎng)中，轉(zhuǎn)染試劑聚合物6/siApo-B復(fù)合物的量的增加對(duì)apo-B表達(dá)的抑制。聚合物6為水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物，其可降解單元pei:peg的摩爾比為i6.5:i:2。所述的對(duì)照處理僅包括聚合物6和siApo-B(5iig)。圖16顯示在5X的葡萄糖溶液中，應(yīng)用RiboGreenTM綜合測(cè)定通過(guò)熒光測(cè)定轉(zhuǎn)染試劑/siRNA復(fù)合物的穩(wěn)定性。轉(zhuǎn)染試劑為聚合物2以及siRNA為抗Apo-B。聚合物2如圖2的圖例中所述。圖17顯示在裸鼠中使用聚合物6作為轉(zhuǎn)染試劑，抗Apo-B對(duì)即o-B表達(dá)的抑制作用。聚合物6為水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物，其可降解單元PEI:PEG的摩爾比為16.5:1:2。對(duì)照包括PBS(A)、siApo-B(lmg/kg)(B)、聚合物6(5mg/kg)(C)以及比例為5:1的聚合物與隨機(jī)siRNA、在操作后48小時(shí)給予lmg/kgsiApo-B(F)。治療包括操作后48小時(shí)給予1.Omg/kg抗Apo-BsiRNA(D)以及操作后2周給予2.5mg/kg抗Apo-BsiRNA(E)。聚合物與siRNA的比例為5/1。圖18顯示在裸鼠中改變轉(zhuǎn)染試劑(聚合物6)與siRNA(抗Apo-B)的比例對(duì)Apo-B的抑制的影響。聚合物6為水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物，其可降解單元PEI:PEG的摩爾比為16.5:1:2。對(duì)照為PBS(A)。治療為聚合物6+siApo-B，其重量比為5:1(B)、7.5:1(C)和10:l(D)。在所有的治療(B-D)中，均給予lmg/kgsiApo-B。圖19顯示將轉(zhuǎn)染試劑聚合物6:siRNA(抗Apo-B)復(fù)合物注射到裸鼠的尾靜脈后，對(duì)Apo-BmRNA表達(dá)的抑制的時(shí)間過(guò)程。聚合物6為水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物，其可降解單元pei:peg的摩爾比為i6.5:i:2。對(duì)照為pbs(a)。治療為操作后48小時(shí)，聚合物6+siApo-B，給予lmg/kgsiApo-B(B);操作后一周，聚合物6+siApo-B，給予2.5mg/kgsiApo-B(C);操作后兩周，聚合物6+siApo-B，給予2.5mg/kgsiApo-B(D)。在所有的治療(B-D)中，聚合物與siRNA的重量比為5:1。圖20顯示將轉(zhuǎn)染試劑聚合物6:siRNA(抗Apo-B)復(fù)合物注射到C57BL/6小鼠的尾靜脈后，對(duì)Apo-BmRNA表達(dá)的抑制的時(shí)間過(guò)程。聚合物6為水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物，其可降解單元pei:peg的摩爾比為i6.5:i:2。対照包括pbs(a)和siapo-B(lmg/kg)。治療包括聚合物6+siapo-B(重量比5:1，lmg/kg的si即o-B)-48小時(shí)(C)，聚合物6+siapo-B(重量比5:1，lmg/kg的si即o-B)-—周(D)，聚合物6+siapo-B(重量比5:1，lmg/kg的siapo-B)-兩周(E)，聚合物6+siapo-B(重量比5:1，lmg/kg的siapo-B)-三周(F)。所述附圖旨在示例性說(shuō)明本文所述的某些實(shí)施方案，并非旨在限制本發(fā)明。優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述本文所述的實(shí)施方案涉及將siRNA遞送至一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞內(nèi)。該siRNA的遞送可以在溶液中進(jìn)行，優(yōu)選在水溶液中或者更優(yōu)選在諸如轉(zhuǎn)染裝置的固體表面上進(jìn)行。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本文所述的方法包括作為轉(zhuǎn)染試劑的水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物，其在將siRNA轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)方面是非常有效的。本文所述的實(shí)施方案涉及水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物，其在聚合物主鏈上可包括一個(gè)或者多個(gè)含有側(cè)鏈脂質(zhì)基團(tuán)的可降解單元、一個(gè)或者多個(gè)陽(yáng)離子聚乙烯亞胺(PEI)單元以及一個(gè)或者多個(gè)聚乙二醇(PEG)單元。在一些實(shí)施方案中，重復(fù)的聚乙二醇主鏈單元可具有約50道爾頓-約5000道爾頓的分子量。在實(shí)施方案中，重復(fù)的聚乙二醇主鏈單元可具有約400道爾頓-約600道爾頓的分子量。在一些實(shí)施方案中，重復(fù)的陽(yáng)離子聚乙烯亞胺主鏈單元可具有約200道爾頓-約25000道爾頓的分子量。在實(shí)施方案中，重復(fù)的陽(yáng)離子聚乙烯亞胺主鏈單元可具有約600道爾頓-約2000道爾頓的分子量。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，重復(fù)的可降解主鏈單元可以是通式(I)重復(fù)單元在通式(I)中，A1可以不存在或者為任選取代的取代基，該取代基選自烷基、烯基、炔基、雜烷基、雜烯基、雜炔基和-(Cig^-D-O^L-;其中nl和n2可以各自獨(dú)立地為0或者1-10的整數(shù)；以及D可以為任選取代的取代基，該取代基選自環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、雜芳基和雜環(huán)基；A2可以不存在、可以為氧原子或者_(dá)N(RN)，其中RN為H或者6烷基W可以為電子對(duì)、氫、或者任選取代的取代基，該取代基選自烷基、烯基、炔基、雜烷基、雜烯基、雜炔基、芳基、雜芳基和雜環(huán)基，其中如果W為氫或者為任選取代的取代基，所述取代基選自烷基、烯基、炔基、雜烷基、雜烯基、雜炔基、芳基、雜芳基和雜環(huán)基，那么與R1連接的氮原子具有相關(guān)聯(lián)的正電荷W可以選自C2_C5。烷基、C2-Cs。雜烷基丄2-(:5。烯基、(:2-(:50雜烯基、C2-C5。炔基、C2-C5。雜炔基、C5-C5。芳基、C5-C5。雜芳基、_(CH2)pl-E-(CH2)p2-和甾醇；其中pl和p2可以各自獨(dú)立地為0或者1-40的整數(shù)；E可以為任選取代的取代基，該取代基選自環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、雜芳基和雜環(huán)基。在實(shí)施方案中，R2可以為c;-c3。烷基、C4-C3。烯基、C4-C3。炔基或甾醇。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，R2可以為C8-C24烷基、C8-C24烯基、QrCM炔基或甾醇。雖然不被理論所約束，但是認(rèn)為通式(I)中的酯基給予水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物改進(jìn)的生物降解性。在一些實(shí)施方案中，f可以為脂質(zhì)基團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，I^可以選自油基、月桂基、肉豆蔻基、棕櫚基、十七烷基、十八烷基、二十烷基、二十二烷基和二十四烷基。在實(shí)施方案中，I^可以為油基。在一些實(shí)施方案中，I^可以為甾醇。在實(shí)施方案中，所述甾醇可以為膽甾醇部分。通式(I)中與R1連接的氮原子可具有電子對(duì)、與其鍵合的氫或者任選取代的取代基，該取代基選自烷基、烯基、炔基、雜烷基、雜烯基、雜炔基、芳基、雜芳基和雜環(huán)基。本領(lǐng)域的技術(shù)人員理解當(dāng)該氮原子具有電子對(duì)時(shí)，上述的通式(I)重復(fù)單元在低PH值下是陽(yáng)離子型的；當(dāng)R1是氫或者任選取代的取代基時(shí)，所述取代基選自烷基、烯基、炔基、雜烷基、雜烯基、雜炔基、芳基、雜芳基和雜環(huán)基，該氮原子具有相關(guān)聯(lián)的正電荷。在實(shí)施方案中，重復(fù)的可降解主鏈單元可具有如下結(jié)構(gòu)在優(yōu)選的實(shí)施方案中，基于水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物中重復(fù)單元的總摩爾數(shù)，該水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物包括約lmole%-約95mole^的重復(fù)的可降解主鏈單元。更優(yōu)選地，基于水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物中重復(fù)單元的總摩爾數(shù)，該水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物包括約30mole%-約90mole%的重復(fù)的可降解主鏈單元。還更優(yōu)選地，基于水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物中重復(fù)單元的總摩爾數(shù)，該水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物包括約50mole%-約86mole%的重復(fù)的可降解主鏈單元。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，基于水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物中重復(fù)單元的總摩爾數(shù)，該水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物包括約lmole%-約35mole^的重復(fù)的陽(yáng)離子聚乙烯亞胺主鏈單元。更優(yōu)選地，基于水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物中重復(fù)單元的總14摩爾數(shù)，該水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物包括約lmole%-約20mole^的重復(fù)的陽(yáng)離子聚乙烯亞胺主鏈單元。還更優(yōu)選地，基于水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物中重復(fù)單元的總摩爾數(shù)，該水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物包括約5mole%-約15mole^的重復(fù)的陽(yáng)離子聚乙烯亞胺主鏈單元。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，基于水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物中重復(fù)單元的總摩爾數(shù)，該水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物包括約lmole%-約80mole^的重復(fù)的聚乙二醇主鏈單元。更優(yōu)選地，基于水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物中重復(fù)單元的總摩爾數(shù)，該水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物包括約lmole%-約50mole^的重復(fù)的聚乙二醇主鏈單元。還更優(yōu)選地，基于水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物中重復(fù)單元的總摩爾數(shù)，該水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物包括約5mole%-約30mole^的重復(fù)的聚乙二醇主鏈單元。且更優(yōu)選地，基于水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物中重復(fù)單元的總摩爾數(shù)，該水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物包括約8mole%-約30mole^的重復(fù)的聚乙二醇主鏈單元。水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物的示例性部分表示如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>通式(la)在實(shí)施方案中，水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物可包括在該聚合物主鏈上的具有約1200道爾頓分子量的一個(gè)或多個(gè)支化的PEI單元；在該聚合物主鏈上的一個(gè)或者多個(gè)通式(I)可降解單元；在該聚合物主鏈上的具有454道爾頓分子量的一個(gè)或多個(gè)支化的聚乙二醇單元?？捎行У貙⑦f送質(zhì)粒DNA至細(xì)胞內(nèi)的聚合物未必也能有效地將siRNA遞送至細(xì)胞內(nèi)。它們的遞送的不相關(guān)因素涉及它們分子大小的差異siRNA通常具有約21-23個(gè)堿基對(duì)(bp)，而質(zhì)粒DNA具有7，000-9，OOObp。參見(jiàn)Kimetal.J.ControlRelease2007(出版中)。可以有效地遞送諸如質(zhì)粒DNA的大型環(huán)狀大分子的載體完全不適用于短的線性片段，例如siRNA。除非另外定義，本文使用的所有科技術(shù)語(yǔ)具有與本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常所理解的含義相同的含義。本文提及的所有專(zhuān)利、申請(qǐng)、公布的申請(qǐng)及其它出版物都將其全部?jī)?nèi)容引入作為參考。在本文中的術(shù)語(yǔ)有多種定義的情況下，除非另有說(shuō)明，以本部分中的定義為主。本文中所用的"Cm-Cn"，其中"m"和"n"為整數(shù)，是指烷基、烯基或炔基中的碳原子數(shù)，或者是環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、雜芳基或雜脂環(huán)基的環(huán)中的碳原子數(shù)。也就是說(shuō)，烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基的環(huán)、環(huán)烯基的環(huán)、環(huán)炔基的環(huán)、芳基的環(huán)、雜芳基的環(huán)或雜脂環(huán)基的環(huán)能夠含有從"m"至IJ"n"個(gè)碳原子，m和n包括在內(nèi)。因此，例如，"C「(；烷基"指的是具有從1-4個(gè)碳原子的所有烷基基團(tuán)，即CH3-、CH3CH2-、CH3CH2CH2-、(CH3)2CH_、CH3CH2CH2CH2-、CH3CH^H(CH》-和(CH3)3C-。如果關(guān)于烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、雜芳基或雜脂環(huán)基中"m"和"n"沒(méi)有被指定，則可以認(rèn)為具有這些定義中所述的最寬的范圍。本文所用的"烷基"是指包含完全飽和(無(wú)雙鍵或三鍵)的烴基團(tuán)的直鏈或支鏈烴鏈。烷基可以含有1至50個(gè)碳原子(每當(dāng)出現(xiàn)在本文中時(shí)，諸如"1至50"的數(shù)值范圍是指在給定范圍內(nèi)的每一整數(shù)；例如，"l至50個(gè)碳原子"意為烷基可以由1個(gè)碳原子、2個(gè)碳原子、3個(gè)碳原子等等直至并包括50個(gè)碳原子組成，盡管本定義也包括沒(méi)有指定數(shù)值范圍的術(shù)語(yǔ)"烷基"的情況)。烷基也可以是具有1至30個(gè)碳原子的中等大小的烷基。烷基也可以是具有i至5個(gè)碳原子的低級(jí)烷基。可以將化合物的烷基指定為"c「c;烷基"或類(lèi)似的指定。僅以實(shí)例的方式，"Q-c;烷基"表明在烷基鏈中有一至四個(gè)碳原子，g卩，烷基鏈選自甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基和叔丁基。典型的烷基包括但絕不限于甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、叔丁基、戊基、己基等。烷基可以被取代或不被取代。被取代時(shí)，取代基是一個(gè)或多個(gè)各自獨(dú)立地選自如下的基團(tuán)烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、雜芳基、雜脂環(huán)基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環(huán)基)烷基、羥基、被保護(hù)的羥基、烷氧基、芳氧基、酰基、酯、巰基、氰基、卣素、羰基、硫代羰基、0-氨基甲酰基、N-氨基甲?；?-硫代氨基甲?；?、N-硫代氨基甲酰基、C-酰胺基、N-酰胺基、S-磺酰氨基、N-磺酰氨基、C-羧基、被保護(hù)的C-羧基、0-羧基、異氰酸基、硫氰基(thiocyanato)、異硫氰基(isothiocyanato)、硝基、甲硅烷基、亞氧硫基、亞硫?；⒒酋；⒇沾榛?、卣代烷氧基、三卣代甲烷磺?；⑷沾淄榛酋０被虬▎稳〈碗p取代的氨基在內(nèi)的氨基、及上述基團(tuán)的被保護(hù)的衍生物。本文中所用的"烯基"是指在直鏈或支鏈的烴鏈上含有一個(gè)或多個(gè)雙鍵的烴基基團(tuán)。烯基基團(tuán)可以不被取代或者被取代。當(dāng)被取代時(shí)，除非另有說(shuō)明，取代基可以選自與上文公開(kāi)的關(guān)于烷基取代的相同的基團(tuán)。本文中所用的"炔基"是指在直鏈或支鏈的烴鏈上含有一個(gè)或多個(gè)三鍵的烴基基團(tuán)。炔基基團(tuán)可以不被取代或者被取代。當(dāng)被取代時(shí)，除非另有說(shuō)明，取代基可以選自與上文公開(kāi)的關(guān)于烷基取代的相同的基團(tuán)。本文所用的"雜烷基"是指本文所述的烷基基團(tuán)，其中該烷基基團(tuán)主鏈中的一個(gè)或多個(gè)碳原子被諸如氮、硫和/或氧的雜原子所替換。本文所用的"雜烯基"是指本文所述的烯基基團(tuán)，其中該烯基基團(tuán)主鏈中的一個(gè)或多個(gè)碳原子被諸如氮、硫和/或氧的雜原子所替換。本文所用的"雜炔基"是指本文所述的炔基基團(tuán)，其中該炔基基團(tuán)主鏈中的一個(gè)或多個(gè)碳原子被諸如氮、硫和/或氧等的雜原子所替換。本文所用的"芳基"是指具有完全離域的電子體系的碳環(huán)(全碳)單環(huán)或多環(huán)芳香環(huán)體系。芳基的實(shí)例包括但不限于苯、萘和奧。芳基的環(huán)可以具有5-50個(gè)碳原子。芳基可以被取代或不被取代。被取代時(shí)，氫原子被取代基置換，所述取代基是獨(dú)立地選自如下的一個(gè)或多個(gè)基團(tuán)烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、雜芳基、雜脂環(huán)基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環(huán)基)烷基、羥基、被保護(hù)的羥基、烷氧基、芳氧基、酰基、S旨、巰基、氰基、卣素、羰基、硫代羰基、0-氨基甲?；?、N-氨基甲?；?、O-硫代氨基甲酰基、N-硫代氨基甲?；?、C-酰胺基、N-酰胺基、S-磺酰氨基、N-磺酰氨基、C-羧基、被保護(hù)的C-羧基、o-羧基、異氰酸基、硫氰基、異硫氰基、硝基、甲硅烷基、亞氧硫基、亞硫?；?、磺?；Ⅺu代烷基、鹵代烷氧基、三卣代甲烷磺?；?、三卣代甲烷磺酰氨基和包括單取代和雙取代的氨基在內(nèi)的氨基，及上述基團(tuán)的被保護(hù)的衍生物，除非另外指明取代基。本文中所用的"雜芳基"是指單環(huán)或者多環(huán)的芳香環(huán)體系(具有完全離域的Ji電子系統(tǒng)的環(huán)體系)，其含有一個(gè)或多個(gè)雜原子、即除碳以外的元素，該雜原子包括但不限于氮、氧和硫。雜芳基基團(tuán)的環(huán)具有5-50個(gè)原子。該雜芳基可以被取代或不被取代。雜芳基環(huán)的實(shí)例包括但不限于呋喃、呋咱、噻吩、苯并噻吩、酞嗪、吡咯、噁唑、苯并噁唑、1，2，3-噁二唑、1，2，4-噁二唑、噻唑、1，2，3-噻二唑、1，2，4-噻二唑、苯并噻唑、咪唑、苯并咪唑、噴哚、口引唑、妣唑、苯并吡唑、異噁唑、苯并異噁唑、異噻唑、三唑、苯并三唑、噻二唑、四唑、妣啶、噠嗪、嘧啶、吡嗪、嘌呤、蝶啶、喹啉、異喹啉、喹唑啉、喹喔啉、噌啉和三嗪。雜芳基基團(tuán)可以被取代或不被取代。當(dāng)被取代時(shí)，氫原子被取代基置換，該取代基為獨(dú)立地選自如下的一個(gè)或者多個(gè)基團(tuán)烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、雜芳基、雜脂環(huán)基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環(huán)基)烷基、羥基、被保護(hù)的羥基、烷氧基、芳氧基、?；?、酯、巰基、氰基、鹵素、羰基、硫代羰基、0-氨基甲酰基、N-氨基甲?；?、O-硫代氨基甲?；-硫代氨基甲?；?、C-酰胺基、N-酰胺基、S-磺酰氨基、N-磺酰氨基、C-羧基、被保護(hù)的C-羧基、0-羧基、異氰酸基、硫氰基、異硫氰基、硝基、甲硅烷基、亞氧硫基、亞硫?；⒒酋；?、卣代烷基、鹵代烷氧基、三鹵代甲烷磺酰基、三鹵代甲烷磺酰氨基和包括單取代和雙取代的氨基在內(nèi)的氨基，及上述基團(tuán)的被保護(hù)的衍生物。本文中所用的"環(huán)烷基"是指完全飽和的(無(wú)雙鍵)單環(huán)或多環(huán)烴環(huán)體系。當(dāng)其由兩個(gè)或兩個(gè)以上的環(huán)組成時(shí)，所述環(huán)可以以稠合、橋接或螺接的方式連接在一起。環(huán)烷基基團(tuán)可以從C3至C1Q變化，在其它實(shí)施方案中，其可以從C3至C8變化。環(huán)烷基基團(tuán)可以不被取代或者被取代。典型的環(huán)烷基基團(tuán)包括但決不僅限于環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基等等。如果被取代，除非另有說(shuō)明，則取代基可以是烷基或者選自上文指明的關(guān)于烷基取代的那些取代基。本文中所用的"環(huán)烯基"是指在環(huán)中含有一個(gè)或多個(gè)雙鍵的環(huán)烴基基團(tuán)，但是如果存在大于一個(gè)的雙鍵，則所述雙鍵在環(huán)中不能形成完全離域的n電子體系(否則該基團(tuán)就是本文中所定義的芳基)。當(dāng)其由兩個(gè)或兩個(gè)以上的環(huán)組成時(shí)，所述環(huán)可以以稠合、橋接或螺接的方式連接在一起。環(huán)烯基基團(tuán)可以不被取代或者被取代，當(dāng)被取代時(shí)，除非另有說(shuō)明，取代基可以是烷基或者選自上文公開(kāi)的關(guān)于烷基取代的那些取代基。本文中所用的"環(huán)炔基"是指在環(huán)中含有一個(gè)或多個(gè)三鍵的環(huán)烴基基團(tuán)。當(dāng)其由兩個(gè)或兩個(gè)以上的環(huán)組成時(shí)，所述環(huán)可以以稠合、橋接或螺接的方式連接在一起。環(huán)炔基基團(tuán)可以不被取代或者被取代，當(dāng)被取代時(shí)，除非另有說(shuō)明，取代基可以是烷基或者選自上文公開(kāi)的關(guān)于烷基取代的那些取代基。本文中所用的"雜脂環(huán)"或"雜脂環(huán)基"是指由碳原子和1-5個(gè)雜原子組成的穩(wěn)定的3-18元環(huán)，該雜原子選自氮、氧和硫。該"雜脂環(huán)"或"雜脂環(huán)基"可以是單環(huán)、雙環(huán)、三環(huán)或四環(huán)體系，可以以稠合、橋接或螺接的方式連接在一起；"雜脂環(huán)"或"雜脂環(huán)基"中的氮、碳和硫原子可以任選被氧化；氮原子可以任選被季銨化；所述環(huán)可以含有一個(gè)或多個(gè)雙鍵，前提是該雙鍵不能形成遍及所有環(huán)的完全離域的n電子體系。雜脂環(huán)基基團(tuán)可以不被取代或被取代。當(dāng)被取代時(shí)，取代基可以是獨(dú)立地選自如下基團(tuán)的一個(gè)或者多個(gè)基團(tuán)烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、雜芳基、雜脂環(huán)基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環(huán)基)烷基、羥基、被保護(hù)的羥基、烷氧基、芳氧基、酰基、酯、巰基、烷硫基、芳硫基、氰基、鹵素、羰基、硫代羰基、0-氨基甲?；?、N-氨基甲?；?、0-硫代氨基甲?；-硫代氨基甲酰基、C-酰胺基、N-酰胺基、S-磺酰氨基、N-磺酰氨基、C-羧基、被保護(hù)的C-羧基、0-羧基、異氰酸基、硫氰基、異硫氰基、硝基、甲硅烷基、卣代烷基、卣代烷氧基、三卣代甲烷磺酰基、三鹵代甲烷磺酰氨基和包括單取代和雙取代的氨基在內(nèi)的氨基，及上述基團(tuán)的被保護(hù)的衍生物。這樣的"雜脂環(huán)"或"雜脂環(huán)基"的實(shí)例包括但不限于氮雜卓基、吖啶基、咔唑基、噌啉基、l，3-二氧芑、l，3-二噁烷、l，4-二噁烷、l，2-二氧戊環(huán)基、l，3-二氧戊環(huán)基、l，4-二氧戊環(huán)基、1，3-氧硫雜環(huán)己烷、1，4-氧硫雜環(huán)己二烯、1，3-氧硫雜環(huán)戊烷、1，3-二硫雜環(huán)戊二烯、1，3-二硫戊環(huán)、1，4-氧硫雜環(huán)己烷、四氫-1，4-噻嗪、2H-1，2-噁嗪、馬來(lái)酰亞胺、琥珀酰亞胺、巴比妥酸、硫代巴比妥酸、二酮哌嗪、乙內(nèi)酰脲、二氫尿嘧啶、三噁烷、六氫-l，3，5-三嗪、咪唑啉基、咪唑烷、異噁唑啉、異噁唑烷、噁唑啉、噁唑烷、噁唑烷酮、噻唑啉、噻唑烷、嗎啉基、環(huán)氧乙烷基、哌啶基、N-氧化物、哌啶基、哌嗪基、吡咯烷基、吡咯烷酮、pyrrolidione、4-哌啶酮基、妣唑啉、妣唑烷基、2-氧代吡咯烷基、四氫吡喃、4H-吡喃、四氫噻喃、硫代嗎啉基、硫代嗎啉基亞砜、硫代嗎啉基砜以及它們的苯并稠合類(lèi)似物(例如，苯并咪唑啉酮、四氫喹啉、3，4-亞甲二氧基苯基)。每當(dāng)基團(tuán)被描述為"任選取代"時(shí)，該基團(tuán)可以不被取代或被一個(gè)或多個(gè)所指明的取代基取代。同樣地，當(dāng)基團(tuán)被描述為"不被取代或被取代"時(shí)，如果被取代，則取代基可以選自一個(gè)或多個(gè)所指明的取代基。除非另有說(shuō)明，當(dāng)取代基被認(rèn)為"任選取代"或"取代"時(shí)，意為該取代基為可以被一個(gè)或多個(gè)基團(tuán)取代的基團(tuán)，所述的一個(gè)或多個(gè)基團(tuán)分別獨(dú)立地選自烷基、烯基、炔基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、雜芳基、雜脂環(huán)基、芳烷基、雜芳烷基、(雜脂環(huán)基)烷基、羥基、被保護(hù)的羥基、烷氧基、芳氧基、?；?、酯、巰基、氰基、卣素、羰基、硫代羰基、o-氨基甲?；-氨基甲?；?-硫代氨基甲?；-硫代氨基甲?；?、C-酰胺基、N-酰胺基、S-磺酰氨基、N-磺酰氨基、C-羧基、被保護(hù)的C-羧基、0-羧基、異氰酸基、硫氰基、異硫氰基、硝基、甲硅烷基、亞氧硫基、亞硫?；⒒酋；⒇沾榛?、卣代烷氧基、三卣代甲烷磺?；?、三卣代甲烷磺酰氨基和包括單取代和雙取代的氨基在內(nèi)的氨基，及上述基團(tuán)的被保護(hù)的衍生物?？梢孕纬缮鲜鋈〈谋Ｗo(hù)性衍生物的保護(hù)基是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并可以在參考書(shū)中找至Ll，例如GreeneandWuts，ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis(有機(jī)合成中的保護(hù)基)，3rdEd.，JohnWiley&Sons，NewYork,NY，1999，在此將其整體內(nèi)容引入本文中作為參考。18應(yīng)當(dāng)理解，在具有一個(gè)或多個(gè)手性中心的本文所述的任何化合物中，如果未明確指明絕對(duì)立體化學(xué)，則每一中心可以獨(dú)立地為R-構(gòu)型或S-構(gòu)型或其混合物。因此，本文提供的化合物可以為對(duì)映純或者為立體異構(gòu)混合物。另外，應(yīng)當(dāng)理解，在本文所述的任何化合物中，當(dāng)其具有一個(gè)或多個(gè)產(chǎn)生能夠被定義為E或Z的幾何異構(gòu)體的雙鍵時(shí)，每一雙鍵可以獨(dú)立地為E或Z或其混合物。同樣，還旨在包括所有的互變形式。本文所用的術(shù)語(yǔ)"脂質(zhì)"是指脂肪和類(lèi)似脂肪的化合物。示例性脂質(zhì)包括脂肪酸和甾醇。脂肪酸是長(zhǎng)鏈的一元羧酸。脂肪酸可以是飽和的或不飽和的。脂質(zhì)的特點(diǎn)是基本上不溶于水，在水中具有小于約0.01%(基于重量)的溶解性。本文所使用的術(shù)語(yǔ)"脂質(zhì)基團(tuán)"是指直接與其它基團(tuán)相連接的脂質(zhì)或者其部分。例如，脂質(zhì)基團(tuán)可以通過(guò)脂肪酸上的官能團(tuán)(如羧酸基團(tuán))與所述單體上的適當(dāng)?shù)墓倌軋F(tuán)之間的化學(xué)反應(yīng)來(lái)與其它化合物(如單體)相連接。本文中使用的術(shù)語(yǔ)"交聯(lián)"是指已經(jīng)通過(guò)諸如共價(jià)鍵等化學(xué)鍵橫向連接在一起的聚合物鏈。本文所用的術(shù)語(yǔ)"交聯(lián)"意為包括各種不同的交聯(lián)度，如輕度交聯(lián)，中度交聯(lián)和高度交聯(lián)。本文所述的實(shí)施方案涉及本文所述的水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物的合成。Lyrn等人已描述了采用二丙烯酸酯作為陽(yáng)離子化合物之間的連接分子來(lái)合成可生物降解的陽(yáng)離子聚合物的方法(參見(jiàn)Lynn，etal.J.Am.Chem.Soc.2001，123，8155-8156)，在此將其整體內(nèi)容引入本文作為參考。在一些實(shí)施方案中，水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物可以通過(guò)如下步驟合成將含有乙亞胺重復(fù)單元的第一反應(yīng)物溶解在有機(jī)溶劑中形成溶解或部分溶解的高分子反應(yīng)物；將該溶解或部分溶解的高分子反應(yīng)物與可降解單體反應(yīng)物反應(yīng)以形成可降解交聯(lián)聚合物，其中該可降解單體反應(yīng)物含有脂質(zhì)基團(tuán)；將該可降解交聯(lián)聚合物與第三反應(yīng)物反應(yīng)，其中該第三反應(yīng)物含有重復(fù)的聚乙二醇單元。例如，含有通式(I)的重復(fù)的可降解主鏈單元的水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物可以通過(guò)如下所示的一種方法合成。如方案A所示，通式(II)化合物可以與PEI反應(yīng)以形成可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物，該聚合物包含一個(gè)或多個(gè)通式(III)部分。方案A19<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>在方案中，W、A2、W和R2具有本文所述的關(guān)于通式(I)的相同含義。在方案A中示例性說(shuō)明的反應(yīng)可以通過(guò)將PEI與通式(II)化合物在諸如乙醇、甲醇或三氯甲烷等互溶劑中混合并攪拌；優(yōu)選在室溫下攪拌數(shù)個(gè)小時(shí)。采用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)回收所得聚合物。例如，可以蒸發(fā)溶劑來(lái)回收所得聚合物。本發(fā)明不受理論約束，但是認(rèn)為PEI與通式(II)化合物之間的反應(yīng)涉及PEI的一個(gè)或多個(gè)胺與通式(II)化合物的雙鍵之間的Michael反應(yīng)(參見(jiàn)J.March,AdvancedOrganicChemistry(高等有機(jī)化學(xué))31^Ed.，pp.711-712(1985))。方案A中所示的通式(II)化合物可以以美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)No.2006/0258751中所述的方式制備，將包括所有附圖在內(nèi)的該專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)在此引入本文作為參考。所述PEI可以是線性的或支化的。重復(fù)的PEI主鏈單元可以具有通式(IV)、(V)、(VI)、(VII)和/或(VIII)的結(jié)構(gòu)。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>(V)(vi)<formula>formulaseeoriginaldocumentpage20</formula>(vn)(vni)可以使用不同分子量的PEI。當(dāng)PEI為支化時(shí)，重復(fù)的PEI主鏈單元的分子量?jī)?yōu)選為約200道爾頓-25，000道爾頓，更優(yōu)選為400道爾頓-5，000道爾頓，還更優(yōu)選約600道爾頓-2，000道爾頓。當(dāng)PEI為線性時(shí)，重復(fù)的PEI主鏈單元的分子量?jī)?yōu)選為約200道爾頓-25，000道爾頓。在實(shí)施方案中，線性的重復(fù)的PEI主鏈單元可具有約400道爾頓-約1，200道爾頓的分子量?？梢允褂每山到鈫卧cPEI的多種摩爾比來(lái)制備水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物。在一些實(shí)施方案中，可降解單體反應(yīng)物(如通式(II)化合物)與PEI的摩爾比可以為約O.1:1_約50:1。在實(shí)施方案中，可降解單體反應(yīng)物與PEI的摩爾比可以為約i:1-約30:1。在一些實(shí)施方案中，可降解單體反應(yīng)物與PEi的摩爾比可以為約5:i-約25:i。然后，通式(III)部分可以與PEG或諸如mPEG(甲氧基聚(乙二醇))的其衍生物反應(yīng)，以形成水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物。在一些實(shí)施方案中，反應(yīng)在室溫下進(jìn)行。所述反應(yīng)產(chǎn)物可以通過(guò)包括色譜技術(shù)在內(nèi)的本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何方法分離。在實(shí)施方案中，所述反應(yīng)產(chǎn)物可以通過(guò)沉淀和隨后的離心法來(lái)獲得?？梢允褂貌煌肿恿康腜EG及其衍生物。在一些實(shí)施方案中，重復(fù)的聚乙二醇主鏈單元可具有約50道爾頓-約5，000道爾頓的分子量。在實(shí)施方案中，重復(fù)的聚乙二醇主鏈單元可具有約400道爾頓-約600道爾頓的分子量。PEG與PEI的摩爾比可以變化。在一些實(shí)施方案中，PEG與PEI的摩爾比可以為約o.i:1-約12:i。在一些實(shí)施方案中，PEG與PEi的摩爾比可以為約i:i-約io:i。在一些實(shí)施方案中，PEG與PEi的摩爾比可以為約i:l-約4:i。當(dāng)R1是氫，或者任選取代的取代基時(shí)，所述取代基選自烷基、烯基、炔基、雜烷基、雜烯基、雜炔基、芳基、雜芳基和雜環(huán)基時(shí)，通式(II)化合物能夠通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法制備。一種方法在方案B中表示如下。方案B在方案B中，本文所述的A^A^R1和R2與本文所述的A^A^R1和R2相同，LG是適當(dāng)?shù)碾x去基團(tuán)，如鹵素。水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物的重均分子量可以變化。在一些實(shí)施方案中，重均分子量可以為約500道爾頓_約1，000，000道爾頓。在實(shí)施方案中，重均分子量可以為21約2，000道爾頓-約200，000道爾頓。分子量可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法測(cè)定，例如，通過(guò)采用PEG標(biāo)準(zhǔn)的尺寸排阻色譜法或者瓊脂糖凝膠電泳法。多種的含有本文所述的重復(fù)主鏈單元(如通式(I)、PEI和PEG)的水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物可以通過(guò)改變PEI的分子量和結(jié)構(gòu)、PEG分子量和結(jié)構(gòu)、通式(II)化合物中R1和R2基團(tuán)的大小和類(lèi)型、A1和/或A2基團(tuán)，和/或通式(II)與PEI和PEG的摩爾比來(lái)制備。另外，可以使用不同的二丙烯酸酯和其衍生物的混合物和/或不同的PEI的混合物和/或不同的PEG的混合物。在實(shí)施方案中，本文所述的關(guān)于合成水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物的方法可以用于合成包括本文所示的通式(la)部分的聚合物。水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物優(yōu)選是可生物降解的?？山到鈾C(jī)理的非限制實(shí)例包括但不限于水解、酶裂解、還原、光裂解和/或聲波降解。本發(fā)明并不受理論限制，但是認(rèn)為細(xì)胞內(nèi)通式(I)的可降解單元的降解通過(guò)酶裂解和/或酯鍵的水解進(jìn)行。本文所述的實(shí)施方案涉及應(yīng)用本文所述的水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物來(lái)遞送RNA至細(xì)胞內(nèi)的方法。優(yōu)選地，所述RNA為短干擾RNA(siRNA)。RNA，以及更具體地，siRNA，包括具有5-50個(gè)堿基對(duì)的RNA，優(yōu)選地具有10-35個(gè)堿基對(duì)且更優(yōu)選地具有19-27個(gè)堿基對(duì)。RNA也可以包括混合的RNA/DNA分子或者混合的蛋白/RNA分子。核酸的遞送可以在水溶液或者固相支持體上進(jìn)行。優(yōu)選的實(shí)施方案涉及與常規(guī)的轉(zhuǎn)染檢測(cè)相比，更簡(jiǎn)單、方便、以及有效的轉(zhuǎn)染裝置和方法。根據(jù)本文描述的方法，通過(guò)將諸如水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物的轉(zhuǎn)染試劑固定到細(xì)胞培養(yǎng)裝置的固體表面上來(lái)制造轉(zhuǎn)染裝置。在這個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，無(wú)需將核酸與轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行預(yù)混合。這除去了常規(guī)的轉(zhuǎn)染方法所要求的關(guān)鍵的耗時(shí)步驟。與常規(guī)方法所需要的2至5個(gè)小時(shí)或更長(zhǎng)的時(shí)間相比，研究者僅需要約40分鐘就可以完成對(duì)10個(gè)樣品的全部轉(zhuǎn)染過(guò)程。這對(duì)于一次測(cè)試數(shù)百個(gè)樣品的高通量轉(zhuǎn)染檢測(cè)尤為有利。在優(yōu)選實(shí)施方案中，用于涂布本文所述的轉(zhuǎn)染裝置的轉(zhuǎn)染試劑包括但不限于水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物、陽(yáng)離子聚合物、脂質(zhì)聚合物、陽(yáng)離子聚乙二醇化聚合物、聚乙二醇化脂質(zhì)聚合物、陽(yáng)離子脂質(zhì)和聚乙二醇化陽(yáng)離子脂質(zhì)。陽(yáng)離子聚合物的實(shí)例包括但不限于CytoPUreTM(Qbi0基因)、聚賴(lài)氨酸和聚精氨酸。脂質(zhì)聚合物試劑的實(shí)例包括但不限于jetPEITM(Qbio基因)。聚乙二醇化陽(yáng)離子聚合物的實(shí)例包括但不限于PEI-PEG共聚物(Zhong，etal.(2005)Biomacromoleculesvol.6:3440-3448，在此弓|入本文作為參考)、PEG-接枝的陽(yáng)離子聚合物(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利No.6，586，254，在此引入本文作為參考)以及本文所述的水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物。陽(yáng)離子脂質(zhì)試劑的實(shí)例包括但不限于D0TAP(1，2-二油酰-3-三甲基銨-丙烷)、Lipofectamine(Invitrogen)和siP0RTTM(AmbiOn)。聚乙二醇化陽(yáng)離子脂質(zhì)的實(shí)例包括但不限于PEG-脂質(zhì)復(fù)合物(Martin-Herranz，etal.(February2004)BiophysicalJournalvol.86:1160-1168，在此引入本文作為參考)。在表i中描述了用于涂布轉(zhuǎn)染裝置的其它陽(yáng)離子聚合物。在一些實(shí)施方案中，所述的轉(zhuǎn)染試劑是陽(yáng)離子聚乙二醇化聚合物。在實(shí)施方案中，所述的陽(yáng)離子聚乙二醇化聚合物可以是如本文所述的水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物。表1優(yōu)選實(shí)施方案中陽(yáng)離子化合物和低聚物的結(jié)構(gòu)<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>優(yōu)選的實(shí)施方案涉及將陽(yáng)離子聚乙二醇化聚合物轉(zhuǎn)染試劑，例如本文所述的水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物，涂布至轉(zhuǎn)染裝置上，該轉(zhuǎn)染裝置非常易于貯存，這提供了用于siRNA遞送的簡(jiǎn)單方法，該方法不需要將siRNA/轉(zhuǎn)染試劑混合的步驟。本文描述的轉(zhuǎn)染方法可在短時(shí)間內(nèi)完成，例如約40分鐘，并且提供了用于轉(zhuǎn)染的高通量方法，其中可一次轉(zhuǎn)染大量的樣品。本文所述的用于基因抑制的方法和裝置的實(shí)施方案克服了在上文所述的常規(guī)轉(zhuǎn)染檢測(cè)中遇到的常見(jiàn)問(wèn)題。所述的陽(yáng)離子聚乙二醇化聚合物轉(zhuǎn)染試劑可以被簡(jiǎn)單地涂布在細(xì)胞培養(yǎng)裝置的表面上，這易于商品化并大量生產(chǎn)。消費(fèi)者，例如研究人員，僅需要在轉(zhuǎn)染前將諸如所關(guān)注的siRNA等核酸直接加入到細(xì)胞培養(yǎng)裝置的表面。然后無(wú)需更換培養(yǎng)基，將細(xì)胞接種在該細(xì)胞培養(yǎng)裝置的表面上并孵育，以及分析該細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染操作期間不必更換培養(yǎng)基。本文所述的方法通過(guò)減少所涉及的步驟數(shù)目，極大地減少了出錯(cuò)的風(fēng)險(xiǎn)，因而提供了該系統(tǒng)的一致性和準(zhǔn)確性。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將轉(zhuǎn)染試劑固定在載玻片或多孔板的表面上。然而，也可以使用任何形狀的固相支持體或半固相支持體，包括但不限于板、過(guò)濾器和柱填充材料，如任何形狀和大小的珠、纖維和小球等?？梢允褂萌魏魏线m的表面，該表面能夠用于將含有siRNA的混合物固定在其表面上。在一些實(shí)施方案中，可以使用半固相支持體，如膜(如硝酸纖維素、甲基纖維素、PTFE或纖維素)以及尼龍膜和紙支持體。用于支持體的固體或半固體材料可以是金屬、非金屬、聚合物或塑料、彈性體或生物衍生材料。優(yōu)選的金屬為金、不銹鋼、鋁、鎳鈦合金、鈷鉻合金(cobaltchrome)或鈦。優(yōu)選的非金屬材料包括但不限于玻璃、硅、二氧化硅或陶瓷。優(yōu)選的塑料聚合物和彈性體材料包括但不限于聚苯乙烯、聚縮醛、聚氨酯、聚酯、聚四氟乙烯、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸羥乙酯、聚乙烯醇、聚丙烯、聚甲基戊烯、聚醚酮、聚苯醚、聚氯乙烯、聚碳酸酯、聚砜、丙烯腈一丁二烯一苯乙烯、聚醚酰亞胺、聚偏l，l-二氟乙烯及其共聚物和組合。所述材料可以選自聚硅氧烷、氟化聚硅氧烷、乙丙橡膠、含氟彈性體以及其組合。所述材料可選自聚乳酸、聚羥基乙酸、聚已內(nèi)酯、聚對(duì)二氧環(huán)己酮、聚碳酸亞丙基酯及其共聚物。在一些實(shí)施方案中，可以使用生物衍生材料，如蛋白質(zhì)、凝膠、瓊脂、膠原蛋白、彈性蛋白、甲殼質(zhì)、珊瑚、透明質(zhì)酸、骨及其組合。在一些實(shí)施方案中，固相或半固相支持體可包括組織(如皮膚、內(nèi)皮組織、骨頭、軟骨)或者礦物質(zhì)(如羥磷灰石、石墨)。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，所述表面可以是載玻片(玻璃或聚-L-賴(lài)氨酸涂布的載玻片)或者多孔板的孔。在一些實(shí)施方案中，固體或半固體表面可以是可植入的裝置，如支架。通過(guò)使用這裝置，僅需要將siRNA加入到所述表面并使轉(zhuǎn)染試劑與siRNA形成復(fù)合物。該反應(yīng)在大約30分鐘內(nèi)發(fā)生。然后將細(xì)胞接種到所述表面，并在合適的用于將siRNA引入細(xì)胞內(nèi)的條件下進(jìn)行孵育。這些步驟可以手動(dòng)進(jìn)行、通過(guò)自動(dòng)化系統(tǒng)進(jìn)行、或者通過(guò)一些步驟由手動(dòng)執(zhí)行，其它步驟自動(dòng)執(zhí)行的聯(lián)合方式進(jìn)行。對(duì)于載玻片，如涂有聚-L-賴(lài)氨酸的載玻片(如Sigma，Inc.)，將轉(zhuǎn)染試劑固定在表面上并干燥，然后引入所關(guān)注的核酸，如雙鏈siRNA。將該載玻片在室溫下孵育30分鐘，以在轉(zhuǎn)染裝置的表面上形成siRNA/轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物。該siRNA/轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物形成用于高通量微陣列的基質(zhì)，該微陣列可用于同時(shí)研究成百上千種核酸。在可選擇的實(shí)施方案中，該轉(zhuǎn)染試劑或者藥物遞送試劑能夠被固定到轉(zhuǎn)染裝置表面上離散的、限定的區(qū)域內(nèi)，以形成轉(zhuǎn)染試劑或藥物遞送試劑的微陣列。在這個(gè)實(shí)施方案中，待被引入到細(xì)胞內(nèi)的諸如核酸的分子連同轉(zhuǎn)染試劑或遞送試劑一起被分散在轉(zhuǎn)染裝置的表面上。這種方法用于從數(shù)千種化合物中篩選轉(zhuǎn)染試劑或其它遞送試劑。這種篩選方法的結(jié)果能夠通過(guò)計(jì)算機(jī)分析來(lái)檢驗(yàn)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，多孔板的一個(gè)或多個(gè)孔可以涂有陽(yáng)離子聚乙二醇化聚合物轉(zhuǎn)染試劑。通常用于轉(zhuǎn)染和藥物篩選的板為96孔板和384孔板。陽(yáng)離子聚乙二醇化聚合物轉(zhuǎn)染劑可以被均勻地涂在板的底部。然后通過(guò)例如多道移液器或者自動(dòng)化儀器，將數(shù)百種諸如siRNA的生物分子加入到孔內(nèi)。然后使用酶標(biāo)儀來(lái)測(cè)定轉(zhuǎn)染的結(jié)果。這是非常方便的分析轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法，因?yàn)樵诖蠖鄶?shù)生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室中普遍使用酶標(biāo)儀。涂有陽(yáng)離子聚乙二醇化聚合物轉(zhuǎn)染試劑的多孔板可以廣泛用于大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室中以研究基因調(diào)節(jié)、基因功能、分子療法和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、以及藥物篩選。另外，如果將不同種類(lèi)的陽(yáng)離子聚乙二醇化聚合物轉(zhuǎn)染試劑涂布多孔板的不同孔，該板可用于相對(duì)有效地篩選許多陽(yáng)離子聚乙二醇化聚合物轉(zhuǎn)染試劑。最近，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了1536和3456孔板，它們也可以根據(jù)本文所述的方法使用。所述的轉(zhuǎn)染試劑或遞送試劑優(yōu)選為能夠?qū)⒅T如核酸的生物分子，優(yōu)選siRNA，引入細(xì)胞內(nèi)的陽(yáng)離子聚乙二醇化聚合物轉(zhuǎn)染試劑。優(yōu)選的實(shí)施方案使用可降解陽(yáng)離子聚乙二醇化聚合物，如本文所述的水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物。在合適的條件下，將siRNA加入到轉(zhuǎn)染裝置中以形成生物分子/遞送試劑復(fù)合物，該轉(zhuǎn)染裝置涂有轉(zhuǎn)染試劑或遞送試劑，如水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物。所述的生物分子優(yōu)選地溶于不含有胎牛血清和抗生素的細(xì)胞培養(yǎng)基中，例如Dulbecco'sModifiedEaglesMedium(DMEM)。如果所述的轉(zhuǎn)染試或遞送試劑被均勻地固定在載玻片上，則所述的生物分子能夠被點(diǎn)樣至該載玻片上的不連續(xù)區(qū)域上?；蛘?，可以將轉(zhuǎn)染試劑或遞送試劑點(diǎn)樣到載玻片上的不連續(xù)區(qū)域上，簡(jiǎn)單地加入siRNA以覆蓋轉(zhuǎn)染裝置的整個(gè)表面。如果所述的轉(zhuǎn)染試劑或者遞送試劑被固定在多孔板的底部，則通過(guò)多道移液器、自動(dòng)化裝置或者其它方法將siRNA簡(jiǎn)單地加入至不同孔內(nèi)。將所得產(chǎn)物(涂有轉(zhuǎn)染試劑或者遞送試劑和siRNA的轉(zhuǎn)染裝置)在室溫下孵育5分鐘-3小時(shí)，優(yōu)選10-90分鐘，更優(yōu)選20-30分鐘以形成所述的siRNA/轉(zhuǎn)染試劑(或遞送試劑)復(fù)合物。在某些情況下，例如，將不同種類(lèi)的生物分子點(diǎn)樣到載玻片的不連續(xù)區(qū)域上，除去siRNA溶液以產(chǎn)生帶有siRNA的表面，該siRNA存在于與轉(zhuǎn)染試劑的復(fù)合物中。在其它情況下，將siRNA溶液保留在表面上。隨后，將在合適的培養(yǎng)基中的細(xì)胞以適當(dāng)?shù)拿芏冉臃N至所述表面上。將所得產(chǎn)物(帶有siRNA和接種的細(xì)胞的表面)維持在導(dǎo)致生物分子進(jìn)入接種的細(xì)胞的條件下。根據(jù)本文所述的方法，適用的細(xì)胞包括原核生物、酵母或高等真核細(xì)胞，包括植物和動(dòng)物細(xì)胞，特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述細(xì)胞為癌細(xì)胞。在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用為癌癥的模型體系的細(xì)胞系，包括但不限于乳腺癌(MCF-7，MDA-MB-438細(xì)胞系)、U87成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系、B16F0細(xì)胞(黑素瘤)、HeLa細(xì)胞(子宮頸癌)、A549細(xì)胞(肺癌)以及大鼠腫瘤細(xì)胞系GH3和9L。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，B16F0細(xì)胞(黑素瘤)或HeLa細(xì)胞(子宮頸癌)用作測(cè)試系統(tǒng)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，siRNA遞送試劑用來(lái)測(cè)試作為治療方法的siRNA對(duì)癌癥的有效性。26將真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如，人、猴、犬、貓、?；蚴箢?lèi)細(xì)胞)、細(xì)菌、昆蟲(chóng)或植物細(xì)胞等以充足的密度和在適當(dāng)條件下接種到涂有轉(zhuǎn)染試劑或遞送試劑和生物分子的轉(zhuǎn)染裝置上，所述條件適合該生物分子向真核細(xì)胞內(nèi)的引入/進(jìn)入以及該生物分子與細(xì)胞組分的相互作用。在具體實(shí)施方案中，所述細(xì)胞可以選自造血細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、胰腺細(xì)胞、肝細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞或肌細(xì)胞。所述細(xì)胞可以是完全分化的細(xì)胞或祖細(xì)胞/干細(xì)胞。在優(yōu)選實(shí)施方案中，將真核細(xì)胞在含有10%熱滅活的胎牛血清(FBS)和L谷氨酰胺禾口青霉素/鏈霉素(pen/str印)的Dulbecco'sModifiedEaglesMedi咖(DMEM)中培養(yǎng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到某些細(xì)胞應(yīng)該在特定培養(yǎng)基中培養(yǎng)，因?yàn)槟承┘?xì)胞需要特定的營(yíng)養(yǎng)，例如生長(zhǎng)因子和氨基酸。細(xì)胞的最佳密度取決于細(xì)胞類(lèi)型和實(shí)驗(yàn)?zāi)康?。例如?0-80%融合的細(xì)胞群優(yōu)選用于基因轉(zhuǎn)染，但是用于寡核苷酸遞送的最佳條件是30-50%融合的細(xì)胞。例如，如果將5X104個(gè)293細(xì)胞/孔接種到96孔板上，那么在細(xì)胞接種后18-24小時(shí)細(xì)胞可達(dá)到90%的融合。對(duì)于HeLa705細(xì)胞，在96孔板上僅需要1X104個(gè)細(xì)胞/孔就可以達(dá)到相似的融合百分比。在將細(xì)胞接種到含有siRNA/遞送試劑的表面后，就在用于該細(xì)胞類(lèi)型的最佳條件下孵育該細(xì)胞(例如37"，5-10%0)2)。培養(yǎng)時(shí)間取決于實(shí)驗(yàn)?zāi)康?。通常，就基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)而言，將細(xì)胞孵育24至48小時(shí)以使細(xì)胞表達(dá)靶基因。在對(duì)細(xì)胞內(nèi)siRNA的胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)姆治鲋?，可能需要?shù)分鐘至數(shù)小時(shí)的孵育并且可以在確定的時(shí)間點(diǎn)觀察細(xì)胞?？梢酝ㄟ^(guò)不同的方法分析siRNA遞送的結(jié)果。就基因轉(zhuǎn)染和反義核酸遞送而言，可以通過(guò)諸如綠色螢光蛋白(GFP)基因、熒光素酶基因或P-半乳糖苷酶基因等報(bào)道基因的表達(dá)來(lái)檢測(cè)靶基因表達(dá)水平。例如，GFP信號(hào)可以在顯微鏡下直接觀察，熒光素酶的活性可以通過(guò)照度計(jì)來(lái)檢測(cè)，以及由13_半乳糖苷酶催化的藍(lán)色產(chǎn)物可以在顯微鏡下觀察或通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定。本發(fā)明的實(shí)施不限于這些實(shí)例。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知這些報(bào)道基因如何起作用以及如何將它們引入基因遞送系統(tǒng)。可以通過(guò)不同方法確定根據(jù)本文所述方法遞送的核酸及其產(chǎn)物、蛋白、肽或其它生物分子以及由這些生物分子調(diào)節(jié)的靶標(biāo)，所述方法例如檢測(cè)免疫熒光或酶免疫細(xì)胞化學(xué)、放射自顯影或原位雜交。如果使用免疫熒光來(lái)檢測(cè)編碼蛋白的表達(dá)，則使用結(jié)合靶蛋白的熒光標(biāo)記的抗體(例如在適合抗體與蛋白結(jié)合的條件下加入到載玻片上)。然后通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)來(lái)鑒別含有該蛋白的細(xì)胞。如果所遞送的分子可以調(diào)節(jié)基因表達(dá)，那么耙基因的表達(dá)水平還可以通過(guò)諸如放射自顯影、原位雜交和原位PCR等方法測(cè)定。然而，鑒定方法取決于遞送的生物分子的性質(zhì)、它們的表達(dá)產(chǎn)物、由其調(diào)節(jié)的靶標(biāo)和/或由生物分子的遞送產(chǎn)生的終產(chǎn)物。遞送方法可以包括將聚合物分散至諸如培養(yǎng)皿、載玻片或多孔板的表面上。然后可以將細(xì)胞和siRNA以任意順序加入并孵育一段時(shí)間，該時(shí)間有效地將siRNA遞送至細(xì)胞內(nèi)。遞送增強(qiáng)劑在一些實(shí)施方案中，組合物可包含遞送增強(qiáng)劑。一般認(rèn)為RNAi或siRNA生物分子轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)時(shí)存在三種屏障。它們是細(xì)胞膜、內(nèi)體膜以及所述生物分子從屏障中的釋放。就DNA和RNA而言，核酸-載體復(fù)合物必須先通過(guò)細(xì)胞膜。當(dāng)這一過(guò)程通過(guò)胞吞作用完成時(shí)，所述核酸_載體復(fù)合物隨后被內(nèi)化。該載體連同核酸_負(fù)載物通過(guò)形成口袋來(lái)被細(xì)胞膜包裹，該口袋隨后脫落。結(jié)果得到細(xì)胞內(nèi)體，該細(xì)胞內(nèi)體為包裹核酸負(fù)載物和載體的大型膜結(jié)合結(jié)構(gòu)。然后該核酸_載體復(fù)合物必須自?xún)?nèi)體膜逃逸至細(xì)胞質(zhì)中，并在細(xì)胞質(zhì)中避免酶降解。所述的核酸負(fù)載物必須與載體分離。通常，被設(shè)計(jì)用來(lái)克服上述的一個(gè)或多個(gè)屏障的任何物質(zhì)均可認(rèn)為是遞送增強(qiáng)劑。通常，遞送增強(qiáng)劑分成兩類(lèi)病毒載體系統(tǒng)和非病毒載體系統(tǒng)。如上所述由于人類(lèi)病毒已進(jìn)化出克服屏障以轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核內(nèi)的方法，所以病毒或病毒成分可被用于將核酸轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)。用作遞送增強(qiáng)劑的病毒成分的另一個(gè)實(shí)例是血凝素肽(HA肽)。該病毒肽通過(guò)破壞內(nèi)體促進(jìn)生物分子向細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)移。在內(nèi)體的酸性PH值下，該蛋白引起生物分子和載體向細(xì)胞液中的釋放。非病毒遞送增強(qiáng)劑可以是基于聚合物的或基于脂質(zhì)的。通常它們是用于平衡核酸的負(fù)電荷的聚陽(yáng)離子。諸如PEI等支鏈形式的聚陽(yáng)離子和星型樹(shù)枝狀聚合物可以介導(dǎo)內(nèi)體釋放(Boussif等人，(1995)Proc.Natl.Acas.Sci.USAvol.92:7297-7301)。PEI是含末端胺和內(nèi)胺的高支化聚合物，在pH值為6.9時(shí)末端胺可電離，在pH值為3.9時(shí)內(nèi)胺可電離。由于該結(jié)構(gòu)，PEI可以產(chǎn)生小泡pH值的變化，該變化導(dǎo)致小泡膨脹，最終從內(nèi)體的俘獲中釋放。增強(qiáng)遞送的另一種方法是在載體上設(shè)計(jì)配體。該配體必須在所靶向的用于遞送負(fù)載物的細(xì)胞上具有受體。然后通過(guò)受體識(shí)別引發(fā)生物分子向細(xì)胞內(nèi)的遞送。當(dāng)該配體與其特異性細(xì)胞受體結(jié)合時(shí)，激發(fā)胞吞作用。用于不同細(xì)胞類(lèi)型以增強(qiáng)生物分子轉(zhuǎn)運(yùn)的配體的實(shí)例是半乳糖、轉(zhuǎn)鐵蛋白、糖蛋白脫唾液酸血清類(lèi)粘蛋白、腺病毒纖維、瘧原蟲(chóng)環(huán)子孢子蛋白、表皮生長(zhǎng)因子、人乳頭瘤病毒衣殼、成纖細(xì)胞生長(zhǎng)因子以及葉酸。在葉酸受體的情況下，通過(guò)稱(chēng)為攝液作用的過(guò)程來(lái)內(nèi)化結(jié)合的配體，其中受體與配體結(jié)合，周?chē)哪募?xì)胞表面伸出將其包圍，然后該內(nèi)化的物質(zhì)穿過(guò)液胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)(Gottschalk等(1994)GeneTherl:185-191)。多種試劑可用來(lái)破壞內(nèi)體。除了上述的HA-蛋白外，缺陷病毒顆粒也可用作水解內(nèi)體的試劑(Cotten等(July1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USAvol.89:6094-6098頁(yè))。非病毒試劑是兩親的或基于脂質(zhì)的。介導(dǎo)內(nèi)體破裂、減少降解或同時(shí)繞過(guò)該過(guò)程的試劑可增強(qiáng)諸如DNA等生物分子釋放至細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。增高內(nèi)體PH值的氯喹被用于通過(guò)抑制溶酶體的水解酶來(lái)減少細(xì)胞內(nèi)吞物質(zhì)的降解(Wagner等(1990)ProcNatlAcadSciUSAvol.87:3410-3414)。諸如PEI等支鏈聚陽(yáng)離子和星型樹(shù)枝狀聚合物也促進(jìn)上述內(nèi)體的釋放。為了完全繞過(guò)內(nèi)體降解，使用諸如白喉毒素和假單胞菌外毒素等毒素的亞基作為嵌合蛋白的成分，該嵌合蛋白可被并入基因/基因載體復(fù)合物中(Uherek等人(1998)JBiol.Chem.Vol.273:8835-8841)。這些成分促進(jìn)核酸通過(guò)內(nèi)體膜穿梭并通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)返回。使用方法本文所公開(kāi)的一個(gè)實(shí)施方案涉及治療癌癥的方法，該方法包括使用本文所述的水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物來(lái)將siRNA遞送至哺乳動(dòng)物的癌細(xì)胞內(nèi)以用于治療癌癥。示例性的癌癥包括子宮頸癌、黑色素瘤、前列腺癌、肺癌、結(jié)腸直腸癌、白血病、胰腺癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌或非霍奇金淋巴瘤。在實(shí)施方案中，siRNA作為疾病治療被給藥。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，將與在疾病狀態(tài)下表達(dá)或過(guò)度表達(dá)的基因的編碼區(qū)的全部或部分相對(duì)應(yīng)的siRNA對(duì)需要治療的病人28給藥。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，與編碼在心血管疾病或糖尿病中升高的蛋白質(zhì)的基因的全部或部分相對(duì)應(yīng)的siRNA對(duì)個(gè)體給藥，以使基因產(chǎn)物的水平達(dá)到或接近于正常和/或健康范圍。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，以與本文所述的轉(zhuǎn)染試劑形成的復(fù)合物的形式，將對(duì)應(yīng)于載脂蛋白-B(Apo-B)的siRNA給藥。與載脂蛋白_B(Apo-B)的編碼區(qū)相對(duì)應(yīng)的siRNA的給藥可以降低患心血管疾病、心肌梗死和/或卒中等疾病的風(fēng)險(xiǎn)。本文中所用的"個(gè)體"是指動(dòng)物，其為治療、觀察或?qū)嶒?yàn)的對(duì)象。"動(dòng)物"包括冷血、溫血脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物，例如魚(yú)類(lèi)、貝類(lèi)和爬行動(dòng)物等，特別是哺乳動(dòng)物。"哺乳動(dòng)物"包括但不限于小鼠、大鼠、家兔、豚鼠、犬、貓、綿羊、山羊、牛、馬、諸如猴子、黑猩猩和大猩猩等靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物，尤其是人。本文中所用的術(shù)語(yǔ)"治療(treating)"、"治療(treatment)"、"治療的(therapeutic)"或"治療(therapy)"并不一定意味著疾病或疾病狀態(tài)的完全治愈或者根除。疾病或疾病狀態(tài)的任何不期望的跡象或癥狀在任何程度上的任何緩解均可被認(rèn)為是治療(treatment)和/或治療(therapy)。另外，治療(treatment)可以包括可使患者的整體健康感覺(jué)或外表惡化的行為。所述術(shù)語(yǔ)"治療有效量"用于表示引起所示的生物或醫(yī)學(xué)反應(yīng)的活性化合物或藥物試劑的量。這種反應(yīng)發(fā)生在組織、系統(tǒng)、動(dòng)物或人中并包括所治療的疾病癥狀的減輕。本文所述的組合物和藥物組合物的確切的制劑、給藥途徑和劑量能夠由個(gè)體醫(yī)師根據(jù)患者情況進(jìn)行選擇。(參見(jiàn)例如，F(xiàn)ingletal.1975，"ThePharmacologicalBasisofTherapeutics(治療學(xué)的藥理學(xué)基礎(chǔ))"中，其整體內(nèi)容在此引入作為參考)。通常，向患者給予的組合物的劑量范圍能夠是約0.5至1000mg/kg患者體重，或l-500mg/kg患者體重，或10-500mg/kg患者體重，或50-100mg/kg患者體重。根據(jù)患者的需要，劑量可以是單一劑量或者是一天或更多天的過(guò)程中給予的一系列的二次劑量或多次劑量。當(dāng)人體劑量未被確立時(shí)，合適的人體劑量能夠由ED5。值或ID5。值推測(cè)，或由得自于體外或體內(nèi)研究的其它合適的值來(lái)推測(cè)，由動(dòng)物的毒性研究和有效性研究來(lái)限定。雖然確切的劑量將基于各個(gè)藥物(drug-by-drugbasis)來(lái)確定，但在大多數(shù)情況下，能夠?qū)┝窟M(jìn)行某些概括。用于成人患者的日劑量方案可以是，例如，每種成分的0.lmg至2000mg、優(yōu)選lmg至500mg、例如5mg至200mg的口服劑量，或者每種成分的靜脈內(nèi)劑量、皮下劑量或肌內(nèi)劑量為0.Olmg至100mg、優(yōu)選0.lmg至60mg、例如lmg至40mg的藥物組合物中的每種成分或按照其游離堿計(jì)算的藥物可接受的鹽，組合物每天給藥1至4次。或者，本文公開(kāi)的組合物可優(yōu)選地以每種成分高達(dá)400mg每天的劑量通過(guò)持續(xù)靜脈內(nèi)輸注給藥。因此，通常每種成分口服給藥的總的日劑量為l-2000mg以及通常腸胃外給藥的總的日劑量為0.l-400mg。在某些實(shí)施方案中，給予化合物一段持續(xù)治療期，例如一周或更多，或者數(shù)月或數(shù)年?？蓚€(gè)別地調(diào)整劑量和間隔以提供足以維持調(diào)節(jié)作用的活性部分的血漿水平，或提供最低有效濃度(MEC)。MEC對(duì)于每種化合物是不同的，但能夠由體外數(shù)據(jù)估計(jì)。達(dá)到MEC所必需的劑量將取決于個(gè)體特征和給藥途徑。然而，HPLC測(cè)定或生物測(cè)定能夠用于確定血漿濃度。還能夠使用MEC值確定給藥間隔。應(yīng)當(dāng)使用以下方案給予組合物該方案在10%-90%的時(shí)間，優(yōu)選在30%-90%的時(shí)間且最優(yōu)選在50%-90%的時(shí)間內(nèi)將血漿水平保持在MEC以上。給予的組合物的量可取決于被治療的個(gè)體、個(gè)體的體重、痛苦的嚴(yán)重性、給藥方式和處方醫(yī)師的判斷。實(shí)施例所有的化學(xué)藥品，甲醇、二氯甲烷(DCM)、聚乙二醇單甲醚丙烯酸酯(PEG)和其它試劑均購(gòu)自Sigma-Aldrich化學(xué)公司。聚乙烯亞胺購(gòu)自PolyScience，Inc.。通式(II)的可降解單體反應(yīng)物根據(jù)美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)No.11/216，986(美國(guó)公開(kāi)No.2006/0258751)中報(bào)道的通用方法合成，在此將其引入本文作為參考。HeLa人宮頸腺癌細(xì)胞和B16F0小鼠皮膚黑素瘤細(xì)胞購(gòu)自ATCC并在具有10%FBS的匿EM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。通過(guò)將GFP表達(dá)載體轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞內(nèi)生成GFP-表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞系并利用潮霉素B(用于HeLa-GFP)或新霉素(用于B16F0-GFP)進(jìn)行挑選。實(shí)施例1雄性胃隨,柳瞎賴(lài)，白始成':合成的示意略圖如圖l所示。將PEI(30mg)溶于甲醇(3ml)中。將通式(II)的可降解單體反應(yīng)物(36mg)的DCM(二氯甲烷)(6ml)溶液加入到PEI溶液中。攪拌該混合物4小時(shí)。將mPEG(23mg)的DCM(2ml)溶液添加到該混合物中。添加后，再攪拌混合物4小時(shí)。通過(guò)加入2M的在乙醚中的鹽酸，將反應(yīng)混合物淬滅。形成白色的沉淀物，通過(guò)離心法分離，并且用乙醚洗滌。在高真空中干燥后獲得水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物產(chǎn)物(65mg，74%產(chǎn)率)。該產(chǎn)物用^-NMR確認(rèn)。實(shí)施例2水溶件可降解的奪聯(lián)陽(yáng)離子聚合物的合成:合成的示意略圖如圖l所示。將PEI(15mg)溶于甲醇(3ml)中。將通式(II)的可降解單體反應(yīng)物(71mg)的DCM(6ml)溶液加入到PEI溶液中。攪拌該混合物4小時(shí)。將mPEG(llmg)的DCM(2ml)溶液加入到該混合物中。添加后，再攪拌混合物4小時(shí)。通過(guò)加入2M的在乙醚中的鹽酸，將反應(yīng)混合物淬滅。形成白色的沉淀物，通過(guò)離心法分離，并且用乙醚洗滌。在高真空中干燥后獲得水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物產(chǎn)物(65mg，74X產(chǎn)率)。該產(chǎn)物用力-NMR確認(rèn)。實(shí)施例3水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物的合成聚合物1將支化的PEI(Mw二1200道爾頓，O.960g，0.80mmo1)在二氯甲烷甲醇(1:2，8ml)混合物中的溶液加入到通式(II)的可降解單體反應(yīng)物(1.91g，4.0mmo1)在二氯甲烷甲醇(1:2，40ml)中的溶液。添加前，用二氯甲烷甲醇(l:2，0.5mlX4次)洗滌裝有通式(II)的可降解單體反應(yīng)物的燒瓶。添加結(jié)束后，反應(yīng)混合物在室溫下攪拌2小時(shí)。然后加入mPEG(Mw二454道爾頓，0.726g，1.6mmo1)在二氯甲烷甲醇(1:2，3ml)中的溶液。在添加之前，用二氯甲烷甲醇(1:2，0.5mlX4次)洗滌裝有mPEG的燒瓶。然后再將反應(yīng)混合物攪拌一小時(shí)。然后將反應(yīng)在冰水中冷卻IO分鐘，隨后在攪拌的同時(shí)，將反應(yīng)用2M鹽酸乙醚溶液淬滅。將懸浮液置于八個(gè)50ml的圓錐形的離心管中并用另外的冰乙醚(-2(TC)稀釋。將離心管中的懸浮液離心。輕輕倒出液體，并且用更多的乙醚洗滌白色固體產(chǎn)物并離心兩次。真空干燥產(chǎn)物，獲得3.97克(90%)。該產(chǎn)物，聚合物l(可降解脂質(zhì)單元pei:peg(5:i:2)用^-nmr表征。實(shí)施例4siRNA轉(zhuǎn)染在轉(zhuǎn)染前一天，將表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的細(xì)胞以1乂104個(gè)細(xì)胞每孔的密度接種到96孔板。將siRNA(l.Oiig)溶液溶解在蒸餾水中，并用OptiMEM(Invitrogen)進(jìn)一步稀釋到30ii1。這些實(shí)驗(yàn)中所用的siRNA是抗GFP(CGAGAAGCGCGAUCACAUGUU(SEQ31IDNO:1)。選定的水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物[聚合物2(可降解單元pei:peg(12:i:2))、聚合物3(可降解單元pei:peg(16:i:2))、聚合物4(可降解單元pei:peg(17:i:2))、聚合物5(可降解單元pei:peg(20:1:2))和對(duì)照[PEI1200、CytopureTM、Lipofectamine2000"*、可降解單元PEI(5:l)，均為摩爾比]通過(guò)將遞送試劑溶解在適量的dH20中而制成濃度為5mg/ml。在實(shí)驗(yàn)期間，根據(jù)該實(shí)驗(yàn)確定的化合物與siRNA的比例，將遞送試劑溶液用OptiMEM進(jìn)一步稀釋至終容積為30yl。將稀釋的siRNA溶液和遞送試劑溶液混合并在室溫下孵育15min。將siRNA和遞送試劑的混合物(15iU)加入到預(yù)接種的細(xì)胞的每個(gè)孔中，混合，并在具有5%C02的37t:培養(yǎng)箱中孵育。48小時(shí)以后，評(píng)估轉(zhuǎn)染率和細(xì)胞存活力。實(shí)施例5轉(zhuǎn)染率的評(píng)估大約48小時(shí)以后，通過(guò)在熒光顯微鏡下測(cè)量GFP的表達(dá)來(lái)評(píng)估轉(zhuǎn)染。使用紫外可見(jiàn)酶標(biāo)儀在485-528nm檢測(cè)GFP的吸收。在HeLa細(xì)胞中綠色熒光蛋白的活性百分率的結(jié)果如圖2所示。在B16F0細(xì)胞中綠色熒光蛋白的活性百分率的結(jié)果如圖3所示。結(jié)果顯示與對(duì)照[PEI1200、CytopureTM、可降解單元PEI(5:1)]相比，水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物更有效地抑制(或沉默)綠色熒光蛋白的表達(dá)。實(shí)施例6細(xì)胞存活力測(cè)定通過(guò)將250mg固體3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑(鎗)溴化物(MTT)溶解在50ml的DubeccoPBS中來(lái)制備MTT溶液并在4。C下貯存。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，在細(xì)胞的每個(gè)孔中加入MTT溶液(10iil，濃度為5mg/ml)并在37。C下孵育2_4小時(shí)直至可以觀察到紫色晶體生長(zhǎng)。然后加入增溶溶液(lOOiU)并在37t:下孵育一整夜。用在690nm的吸光度作參照，在波長(zhǎng)570nm檢測(cè)吸光度。細(xì)胞存活力測(cè)定的結(jié)果如圖4所示。實(shí)施例7[OWO]平板涂布將PEI-l.2K、Cyt0pureTM、L2K和聚合物1分別溶解在H20中，形成5mg/ml的儲(chǔ)備溶液。將不同的化合物以30ii1終容積中0.625iig、1.25iig、2.50iig和5.0iig每孔的量涂布至96孔板上。將干燥的平板密封在鋁箔中待用。實(shí)施例8轉(zhuǎn)染:將1.0iigsiRNA(抗GFP)用OptiMEM(Invitrogen)稀釋至30y1并加入到涂布的孔中，在室溫下孵育25分鐘。然后以100iU培養(yǎng)基中1.5乂104個(gè)細(xì)胞每孔的量將細(xì)胞(表達(dá)GFP)接種到相應(yīng)的孔中，并在具有5%C02的37t:培養(yǎng)箱中孵育。實(shí)施例9檢測(cè)轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，在顯微鏡下觀察GFP的表達(dá)。采用紫外可見(jiàn)酶標(biāo)儀在485-528nm檢測(cè)GFP的吸光度。結(jié)果如圖5、7、9、11和13所示，對(duì)于HeLa細(xì)胞而言，聚合物siRNA的比例為5:I和IO:1，對(duì)于B16F0細(xì)胞而言聚合物siRNA的比例為2.5:1、5:1和10:1。在所有情況下，與陽(yáng)性對(duì)照(LipofectamineTM)相比，使用聚合物l的轉(zhuǎn)染更好(HeLa細(xì)胞5:1;B16F0，所有測(cè)試比例)或者相當(dāng)(HeLa細(xì)胞，10:1)。實(shí)施例10細(xì)胞存活力測(cè)定轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，將10iil的3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四氮唑(鎗)溴化物(MTT，在PBS中濃度為5mg/ml)溶液加入到細(xì)胞的每個(gè)孔中，并將細(xì)胞在37"C下孵育2-4小時(shí)直至可以觀察到紫色晶體生長(zhǎng)。然后在每個(gè)孔中加入100ii1增溶溶液并且將每個(gè)孔在37t:下孵育一整夜。用690nm的吸光度作參照，在波長(zhǎng)570nm檢測(cè)吸光度。結(jié)果如圖6、8、10、12和14所示，對(duì)于HeLa細(xì)胞而言，聚合物siRNA的比例為5:1禾P10:1，對(duì)于B16F0細(xì)胞而言，聚合物siRNA的比例為2.5:1、5:1禾P10:1。在用于兩種細(xì)胞類(lèi)型的所有測(cè)試比例下，聚合物1沒(méi)有顯示出細(xì)胞毒性。實(shí)施例11在H印G2細(xì)胞中siRNA對(duì)載脂蛋白_B蛋白的抑制載脂蛋白-B(Apo-B)為低密度脂蛋白的主要載脂蛋白，是患心臟病風(fēng)險(xiǎn)的標(biāo)志物。Apo-B表達(dá)的抑制可以降低患心臟病的風(fēng)險(xiǎn)。如實(shí)施例l-3所述合成聚合物6。聚合物6是水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物，其中可降解單元pei:peg的摩爾比是i6.5:i:2。可降解単元和pei與實(shí)施例3中所述的相同。在圖15和圖17-20的實(shí)驗(yàn)中，聚合物6用作轉(zhuǎn)染試劑。如上文的實(shí)施例4所述，將1iig、2.5iig或5iig的siRNA(抗Apo-B，Dharmacon合成，具有有義序列5'-GUCAUCACACUGAAUACCAAUUU-3'(SEQIDNO:2)和反義序列5'-AUUGGUAUUCAGUGUGAUGACUU-3')(SEQIDNO:3))(抗Apo-B)用與用作轉(zhuǎn)染試劑的聚乙二醇化聚合物6復(fù)合的0ptiMEM(Invitrogen)稀釋至30yl。轉(zhuǎn)染試劑siRNA的比例為2:1。將混合物加入到含有H印G2細(xì)胞的96孔板內(nèi)，該H印G2細(xì)胞以在100iil培養(yǎng)基中1.5X104個(gè)細(xì)胞每孔的量接種到孔中并在具有5%C02的37t:培養(yǎng)箱中孵育。對(duì)照處理為(1)沒(méi)有siRNA和聚合物(空白)、(2)僅有抗Apo-B(只有si即oB:5yg)、和(3)僅有轉(zhuǎn)染試劑(只有聚合物6)。孵育48小時(shí)后，通過(guò)定量RT-PCR，采用用于Apo-BmRNA的引物來(lái)測(cè)定mRNA表達(dá)，正向是5'-TTTGCCCTCAACCTACCAAC-3'(SEQIDNO:4)以及反向?yàn)?'-TGCGATCTTGTTGGCTACTG-3'(SEQIDNO:5)。圖15顯示在H印G2細(xì)胞培養(yǎng)中，siRNA對(duì)Apo-BmRNA表達(dá)的影響。相對(duì)于空白來(lái)表示表達(dá)。正如預(yù)期的，僅有siApo-B和僅有轉(zhuǎn)染試劑(聚合物6)在H印G2細(xì)胞中對(duì)Apo-B的表達(dá)沒(méi)有任何影響。當(dāng)轉(zhuǎn)染試劑/siRNA復(fù)合物的量增加時(shí)，在H印G2細(xì)胞中Apo-BmRNA水平的抑制降低，這表明陽(yáng)離子聚乙二醇化聚合物轉(zhuǎn)染試劑在將抗Apo-B遞送至哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)以體外抑制Apo-B方面是有效的。實(shí)施例12在5%葡萄糖中轉(zhuǎn)染試劑/siRNA復(fù)合物的穩(wěn)定性圖16表示與RiboGreenTM(Invitrogen)結(jié)合后，通過(guò)熒光來(lái)顯示的轉(zhuǎn)染試劑/siRNA復(fù)合物的穩(wěn)定性。結(jié)果表明隨著轉(zhuǎn)染試劑(聚合物2)與siRNA的比例增加，熒光減少。實(shí)施例13在皿/皿小鼠中抗siRNA的作用33在轉(zhuǎn)染試劑聚合物6和siRNA(抗Apo-B)之間以5:1的比例形成復(fù)合物，制備按照上文的實(shí)施例11中所述。將該復(fù)合物皮下注射至小鼠的尾靜脈。結(jié)果如圖17所示。參見(jiàn)圖17，操作后48小時(shí)給予1.0mg/kg抗Apo-BsiRNA和操作后2周給予2.5mg/kg抗Apo-BsiRNA均有效地抑制了在皿/皿小鼠中Apo-BmRNA的表達(dá)。在單獨(dú)實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染試劑(聚合物6)與抗Apo-BsiRNA的比例從5:1變化到10:1。注射量保持在1.0mg/kg。盡管所有的比例均抑制Apo-BmRNA的表達(dá)，但在5:1和7.5:1的比例時(shí)觀察到最強(qiáng)的抑制作用(圖18)。如圖19所示，注射量為2.5mg/kg時(shí)，陽(yáng)離子聚乙二醇化聚合物注射到小鼠中的抑制作用可持續(xù)至少兩周。實(shí)施例14在C57BL/6小鼠中抗siRNA的作用圖20顯示將1.0mg/kg的與轉(zhuǎn)染試劑聚合物6復(fù)合的抗Apo_BsiRNA注射至一般用途的小鼠品系(C57BL/6)中。相對(duì)于實(shí)施例13中的皿/皿小鼠，當(dāng)注射量增加至1.0mg/kg，觀察到了更強(qiáng)的Apo-BmRNA表達(dá)的抑制作用。觀察到抑制作用持續(xù)了2周。在三周時(shí)，Apo-B表達(dá)水平回復(fù)到對(duì)照水平(圖20)。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)理解，能夠進(jìn)行多種不同的修改而不偏離本發(fā)明的精神。因此，應(yīng)當(dāng)清楚地理解，本發(fā)明的形式僅是示例性的而非旨在限制本發(fā)明的范圍。權(quán)利要求用于siRNA遞送的組合物，所述組合物包含水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物，所述水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物包含(a)重復(fù)的聚乙二醇(PEG)主鏈單元，(b)重復(fù)的陽(yáng)離子聚乙烯亞胺(PEI)主鏈單元，和(c)重復(fù)的含有側(cè)鏈脂質(zhì)基團(tuán)的可降解主鏈單元。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述重復(fù)的聚乙二醇主鏈單元具有約50道爾頓_約5，000道爾頓的分子量。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述重復(fù)的聚乙二醇主鏈單元具有約400道爾頓-約600道爾頓的分子量。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述重復(fù)的陽(yáng)離子聚乙烯亞胺主鏈單元具有約200-約25，000道爾頓的分子量。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述重復(fù)的陽(yáng)離子聚乙烯亞胺主鏈單元具有約600道爾頓-約2，000道爾頓的分子量。6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中所述重復(fù)的可降解主鏈單元為通式(I)重復(fù)單元<formula>formulaseeoriginaldocumentpage2</formula>a)其中A1不存在或者為任選取代的選自烷基、烯基、炔基、雜烷基、雜烯基、雜炔基和-(CH》n「D-(CH》^-的取代基；其中nl和n2各自獨(dú)立地為0或1-10的整數(shù)；以及D為任選取代的選自環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、雜芳基和雜環(huán)基的取代基；A2為不存在、氧原子或_N(RN)，其中RN為H或(V6烷基；W為電子對(duì)、氫或任選取代的選自烷基、烯基、炔基、雜烷基、雜烯基、雜炔基、芳基、雜芳基和雜環(huán)基的取代基，其中如果W為氫或?yàn)槿芜x取代的選自烷基、烯基、炔基、雜烷基、雜烯基、雜炔基、芳基、雜芳基和雜環(huán)基的取代基，則與R1連接的氮原子具有正電荷；以及R2選自c2-c5。烷基、c2-c5。雜烷基、c2-c5。烯基、c2-c5。雜烯基、c2-c5。炔基、c2-c5。雜炔基、C5-C5。芳基、C5-C5。雜芳基、_(CH2)pl-E-(CH2)p2-和甾醇；其中pi和p2各自獨(dú)立地為0或1-40的整數(shù)；以及E為任選取代的選自環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、雜芳基和雜環(huán)基的取代基。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的組合物，其中R2選自油基、月桂基、肉豆蔻基、棕櫚基、十七烷基、十八烷基、二十烷基、二十二烷基、二十四烷基和甾醇。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的組合物，其中R2為油基。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述重復(fù)的可降解主鏈單元為10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的組合物，其中所述重復(fù)的PEI主鏈單元具有約1200道爾頓的分子量。11.根據(jù)權(quán)利要求9-10中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中所述重復(fù)的PEI主鏈單元為支化的PEI單元。12.根據(jù)權(quán)利要求9-11中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中所述重復(fù)的PEG主鏈單元具有約454道爾頓的分子量。13.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中基于在所述水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物中重復(fù)單元的總摩爾數(shù)，所述水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物包含約lmole%-約95mole^的所述重復(fù)的可降解主鏈單元。14.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中基于在所述水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物中重復(fù)單元的總摩爾數(shù)，所述水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物包含約30mole%-約90mole%的重復(fù)的可降解主鏈單元。15.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中基于在所述水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物中重復(fù)單元的總摩爾數(shù)，所述水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物包含約50mole%-約86mole%的重復(fù)的可降解主鏈單元。16.根據(jù)權(quán)利要求1-15中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中基于在所述水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物中重復(fù)單元的總摩爾數(shù)，所述水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物包含約lmole%-約35mole^的所述重復(fù)的陽(yáng)離子聚乙烯亞胺主鏈單元。17.根據(jù)權(quán)利要求1-15中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中基于在所述水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物中重復(fù)單元的總摩爾數(shù)，所述水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物包含約lmole%-約20mole^的所述重復(fù)的陽(yáng)離子聚乙烯亞胺主鏈單元。18.根據(jù)權(quán)利要求1-15中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中基于在所述水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物中重復(fù)單元的總摩爾數(shù)，所述水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物包含約5mole%-約15mole^的所述重復(fù)的陽(yáng)離子聚乙烯亞胺主鏈單元。19.根據(jù)權(quán)利要求1-18中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中基于在所述水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物中重復(fù)單元的總摩爾數(shù)，所述水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物包含約lmole%-約80mole^的所述重復(fù)的聚乙二醇主鏈單元。20.根據(jù)權(quán)利要求1-18中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中基于在所述水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物中重復(fù)單元的總摩爾數(shù)，所述水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物包含約lmole%-約50mole^的所述重復(fù)的聚乙二醇主鏈單元。21.根據(jù)權(quán)利要求1-18中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中基于在所述水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物中重復(fù)單元的總摩爾數(shù)，所述水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物包含約5mole%-約30mole^的所述重復(fù)的聚乙二醇主鏈單元。22.根據(jù)權(quán)利要求1-18中任一權(quán)利要求所述的組合物，其中基于在所述水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物中重復(fù)單元的總摩爾數(shù)，所述水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物包含約8mole%-約30mole^的所述重復(fù)的聚乙二醇主鏈單元。23.制備權(quán)利要求1所述的水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物的方法，所述方法包括將包含乙烯亞胺重復(fù)單元的第一反應(yīng)物溶解在有機(jī)溶劑中以形成溶解的或部分溶解的高分子反應(yīng)物；將所述溶解的或部分溶解的高分子反應(yīng)物與可降解單體反應(yīng)物反應(yīng)以形成可降解交聯(lián)聚合物，其中所述可降解單體反應(yīng)物包含脂質(zhì)基團(tuán)；以及將所述可降解交聯(lián)聚合物與第三反應(yīng)物反應(yīng)，其中所述第三反應(yīng)物包含重復(fù)的聚乙二醇單元。24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述第一反應(yīng)物為聚乙烯亞胺。25.根據(jù)權(quán)利要求23-24中的任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述可降解單體反應(yīng)物為通式(II)化合物W不存在或?yàn)槿芜x取代的選自烷基、烯基、炔基、雜烷基、雜烯基、雜炔基和-(CH》<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>(II)其中m-D-(CH2)ri2-的取代基；其中nl和n2各自獨(dú)立地為0或1-10的整數(shù)；D為任選取代的選自環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、雜芳基和雜環(huán)基的取代基；A2為不存在、氧原子或_N(RN)，其中RN為H或(V6烷基；W為電子對(duì)、氫或任選取代的選自烷基、烯基、炔基、雜烷基、雜烯基、雜炔基、芳基、雜芳基和雜環(huán)基的取代基，其中如果W為氫或?yàn)槿芜x取代的選自烷基、烯基、炔基、雜烷基、雜烯基、雜炔基、芳基、雜芳基和雜環(huán)基的取代基，則與R1連接的氮原子具有正電荷；以及R2選自c2-c5。烷基、c2-c5。雜烷基、c2-c5。烯基、c2-c5。雜烯基、c2-c5。炔基、c2-c5。雜炔基、C5-C5。芳基、C5-C5。雜芳基、_(CH2)pl-E-(CH2)p2-和甾醇；其中pi和p2各自獨(dú)立地為0或1-40的整數(shù)；以及E為任選取代的選自環(huán)烷基、環(huán)烯基、環(huán)炔基、芳基、雜芳基和雜環(huán)基的取代基。26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中R2選自油基、月桂基、肉豆蔻基、棕櫚基、十七烷基、十八烷基、二十烷基、二十二烷基、二十四烷基和甾醇。27.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中R2為油基。28.根據(jù)權(quán)利要求23-27中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述第三反應(yīng)物為聚乙二醇或甲氧基聚乙二醇。29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述通式(II)化合物和所述PEI分別以約o.i:i-約50:i的摩爾比存在。30.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述通式(II)化合物和所述PEI分別以約i:i-約30:i的摩爾比存在。31.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述通式(II)化合物和所述PEI分別以約5:i-約25:i的摩爾比存在。32.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述PEG和所述PEI分別以約0.1:1-約12:i的摩爾比存在。33.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述PEG和所述PEI分別以約1:I-約IO:1的摩爾比存在。34.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述PEG和所述PEI分別以約1:1-約4:1的摩爾比存在。35.遞送短干擾RNA(siRNA)至細(xì)胞內(nèi)的方法，所述方法包括將權(quán)利要求1-22中任一權(quán)利要求所述的水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物與所述siRNA混合以形成混合物；禾口將一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞與所述混合物接觸。36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述siRNA具有19-27個(gè)堿基對(duì)。37.根據(jù)權(quán)利要求35-36中任一權(quán)利要求所述的方法，其中所述細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。38.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞為癌細(xì)胞。39.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中所述siRNA為與脂蛋白基因片段的編碼區(qū)的至少一部分相對(duì)應(yīng)的siRNA。40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述脂蛋白為載脂蛋白-B。41.治療或降低心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的方法，所述方法包括將治療有效量的、與權(quán)利要求1-22中任一權(quán)利要求所述的水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物復(fù)合的siRNA對(duì)需要所述方法的個(gè)體給藥，所述siRNA與脂蛋白基因片段的編碼區(qū)域的至少一部分相對(duì)應(yīng)。42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的方法，其中所述脂蛋白為載脂蛋白-B。43.用siRNA轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞的方法，所述裝置包含至少部分地固定有含轉(zhuǎn)染試劑的組合物的固體表面，其中所述轉(zhuǎn)染試劑選自水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物、陽(yáng)離子聚合物、脂質(zhì)聚合物、聚乙二醇化陽(yáng)離子聚合物、聚乙二醇化脂質(zhì)聚合物、陽(yáng)離子脂質(zhì)、聚乙二醇化陽(yáng)離子脂質(zhì)和陽(yáng)離子可降解聚乙二醇化脂質(zhì)聚合物。44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的裝置，其中所述固體表面為培養(yǎng)皿底部、多孔板、連續(xù)表面、珠、纖維或小球。45.根據(jù)權(quán)利要求43所述的裝置，其中所述固體表面為聚苯乙烯樹(shù)脂、環(huán)氧樹(shù)脂、天然樹(shù)脂、玻璃或金屬。46.根據(jù)權(quán)利要求43所述的裝置，其中通過(guò)將所述轉(zhuǎn)染試劑均勻地分散在所述固體表面上或者通過(guò)手工或自動(dòng)化機(jī)械裝置將所述轉(zhuǎn)染試劑點(diǎn)樣在所述固體表面上，將所述轉(zhuǎn)染試劑固定在表面上。47.根據(jù)權(quán)利要求43所述的裝置，其中所述轉(zhuǎn)染試劑為水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物。48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的裝置，其中所述水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物包含(a)重復(fù)的聚乙二醇(PEG)主鏈單元，(b)重復(fù)的陽(yáng)離子聚乙烯亞胺(PEI)主鏈單元，禾口(c)重復(fù)的含有側(cè)鏈脂質(zhì)基團(tuán)的可降解主鏈單元。49.根據(jù)權(quán)利要求48所述的裝置，其中所述水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物包含具有約1200道爾頓分子量的重復(fù)的PEI主鏈單元、具有約454道爾頓分子量的重復(fù)的PEG主鏈單元以及重復(fù)的可降解主鏈單元，所述重復(fù)的可降解主鏈單元為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>50.根據(jù)權(quán)利要求48-49中任一權(quán)利要求所述的裝置，其中所述水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物的分子量為約500道爾頓-約1，000，000道爾頓。51.根據(jù)權(quán)利要求48-49中任一權(quán)利要求所述的裝置，其中所述水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物的分子量為約2，000道爾頓-約200，000道爾頓。52.測(cè)定siRNA是否能夠進(jìn)入真核細(xì)胞內(nèi)的方法，所述方法包括(a)提供權(quán)利要求43所述的裝置；(b)將所述siRNA加入所述裝置中以使所述siRNA與所述轉(zhuǎn)染試劑相互作用；(c)將所述真核細(xì)菌以充足的密度和在適當(dāng)條件下接種到所述裝置上，所述條件適于將所述siRNA引入所述細(xì)胞中；以及(d)檢測(cè)所述siRNA是否已經(jīng)進(jìn)入所述細(xì)胞中。53.根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法，其中所述真核細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。54.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞為分裂細(xì)胞或未分裂細(xì)胞。55.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞為轉(zhuǎn)化細(xì)胞或原代細(xì)胞。56.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞為體細(xì)胞或干細(xì)胞。57.根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法，其中所述真核細(xì)胞為植物細(xì)胞或昆蟲(chóng)細(xì)胞。58.用于將siRNA引入真核細(xì)胞的方法，所述方法包括(a)提供至少部分地涂有權(quán)利要求1-22中任一權(quán)利要求所述的水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物的固體表面；(b)將待被引入至所述真核細(xì)胞內(nèi)的所述siRNA加入至所述細(xì)胞表面上；以及(c)將細(xì)胞以充足的密度和在適當(dāng)條件下接種到所述固體表面上，所述條件適于將siRNA引入所述真核細(xì)胞內(nèi)。59.根據(jù)權(quán)利要求58所述的方法，其中所述固體表面選自燒瓶、培養(yǎng)皿、多孔板、載玻片和植入式裝置。60.根據(jù)權(quán)利要求58所述的裝置，其中通過(guò)將所述轉(zhuǎn)染試劑均勻地分散在所述固體表面上或者通過(guò)手工或自動(dòng)化機(jī)械裝置將所述轉(zhuǎn)染試劑點(diǎn)樣在所述固體表面上，將所述水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物固定在所述表面上。61.根據(jù)權(quán)利要求58所述的方法，其中所述真核細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞。62.根據(jù)權(quán)利要求61所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞為分裂細(xì)胞或未分裂細(xì)胞。63.根據(jù)權(quán)利要求61所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞為轉(zhuǎn)化細(xì)胞或原代細(xì)胞。64.根據(jù)權(quán)利要求61所述的方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞為體細(xì)胞或干細(xì)胞。65.根據(jù)權(quán)利要求58所述的方法，其中所述真核細(xì)胞為植物細(xì)胞或昆蟲(chóng)細(xì)胞。全文摘要描述了用于siRNA遞送的組合物，其包含水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物，該水溶性可降解的交聯(lián)陽(yáng)離子聚合物含有水溶性聚乙二醇組分、陽(yáng)離子聚乙烯亞胺組分和可降解單元組分。該組合物可用于遞送siRNA至細(xì)胞內(nèi)，特別是癌細(xì)胞內(nèi)。該組合物可以應(yīng)用于諸如多孔板的固體表面以使siRNA的遞送可以在固體表面上進(jìn)行。文檔編號(hào)A61K47/48GK101755048SQ200880023048公開(kāi)日2010年6月23日申請(qǐng)日期2008年6月2日優(yōu)先權(quán)日2007年6月5日發(fā)明者俞磊,劉健,田中康進(jìn),趙剛,趙昕,馬念春申請(qǐng)人:日東電工株式會(huì)社