本發(fā)明屬分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及大豆木葡聚糖轉(zhuǎn)移酶水解酶基因GmXTH1及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖苷酶/水解酶(xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase, XTH) 是植物細(xì)胞壁重構(gòu)過(guò)程中的關(guān)鍵酶，是一種細(xì)胞壁松弛酶(van Sandt et al., 2007)，它能夠內(nèi)切木葡聚糖聚合體，將產(chǎn)生的還原性末端連接到另外一個(gè)木葡聚糖鏈或水分子上，在細(xì)胞壁重構(gòu)、影響植物生長(zhǎng)發(fā)育方面有重要作用。

XTH 通過(guò)切割和重新“移植”木葡聚糖的作用，在不降低細(xì)胞壁機(jī)械性質(zhì)的前提下提供細(xì)胞壁的延展性，從而支持由膨壓驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞體積增長(zhǎng)。已有的研究顯示 XTH 基因的轉(zhuǎn)錄活性與植物根和莖的伸長(zhǎng)具有顯著的相關(guān)性，暗示XTH 活性對(duì)植物生長(zhǎng)具有重要意義，同時(shí)有研究表明XTH 基因可響應(yīng)赤霉素、生長(zhǎng)素、油菜內(nèi)脂等植物激素，以及其它環(huán)境信號(hào)，可能在植物生長(zhǎng)調(diào)控的生理過(guò)程中扮演著重要的角色。對(duì)擬南芥的大量基因表達(dá)分析表明，XTH 基因具有器官和組織特異性，例如：AtXTH1 在長(zhǎng)角果中表達(dá)，AtXTH9 則在莖尖分生組織中，花芽和花枝中表達(dá)，其生理作用與莖和花枝的伸長(zhǎng)有關(guān)(Hyodo et al., 2003)，而 AtXTH17、AtXTH18、AtXTH19 和 AtXTH20 在根中表達(dá)(Yokoya-maand Nishitani, 2001)。雖然這4個(gè)根特異表達(dá)的基因在系統(tǒng)發(fā)生上緊密相關(guān)，但是它們?cè)诟芯哂胁煌慕M織特異性：AtXTH17，AtXTH18 在根的伸長(zhǎng)區(qū)和分化區(qū)的所有細(xì)胞類(lèi)型中表達(dá)，AtXTH19 在根的分生區(qū)、伸長(zhǎng)區(qū)和分化區(qū)表達(dá)，AtXTH20 僅在根成熟區(qū)維管束中表達(dá) (Vissenberg et al., 2005)。

XTHs 為多基因家族編碼的一類(lèi)蛋白質(zhì)，屬于糖苷水解酶家族 GH16 (vanSandtetal,et. 2006;2007)。模式植物基因組數(shù)據(jù)顯示，XTHs 在擬南芥、水稻和毛果楊基因組中分別有 33、29 和 41 個(gè)成員。XTH 家族的蛋白含有一個(gè)特征基序 DEIDFEFLG，包含介導(dǎo)催化活性的氨基酸殘基。近期關(guān)于 XTH 基因家族的研究主要集中在對(duì)家族成員生理作用和表達(dá)譜的研究與探討方面，一系列研究的結(jié)果表明：(1) XTH 家族成員可能在植物生長(zhǎng)、發(fā)育及對(duì)環(huán)境脅迫的響應(yīng)等諸多方面發(fā)揮重要的生理作用。XTH 基因家族在功能上具有多樣性。(2)XTH家族成員在表達(dá)特性上明顯不同，這種差異與家族成員在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中所起的作用密切相關(guān)。(3)XTH 基因響應(yīng)多種信號(hào)，不同家族成員對(duì)信號(hào)的響應(yīng)明顯不同。基因的生理作用和基因表達(dá)部位及對(duì)各種信號(hào)的響應(yīng)密切相關(guān)。

目前對(duì) XTH 基因的研究多集中在擬南芥等模式植物，有關(guān) XTH 基因的應(yīng)用基礎(chǔ)研究也相對(duì)薄弱，雖然已從一些物種中分離得到了 XTH 的同源基因，但仍缺乏以改良植物性狀為目標(biāo)的基因轉(zhuǎn)化研究報(bào)道，對(duì)大豆中XTH基因的功能的了解則更為有限。本研究通過(guò)基因工程技術(shù)克隆大豆來(lái)源的XTH新基因GmXTH1，通過(guò)在大豆中過(guò)量表達(dá)和干擾表達(dá)GmXTH1基因，來(lái)鑒定目的基因的功能，探討GmXTH1基因?qū)Υ蠖姑缙诟瞪L(zhǎng)發(fā)育的影響及對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)，為利用分子生物學(xué)手段調(diào)控大豆根系生長(zhǎng)發(fā)育奠定理論基礎(chǔ)、為培育根系發(fā)達(dá)的抗旱大豆新品種提供基因資源和基礎(chǔ)材料。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了增強(qiáng)植物的根系發(fā)育，提高植物的耐旱能力，而提供一種大豆木葡聚糖轉(zhuǎn)移酶水解酶基因GmXTH1及應(yīng)用。

大豆木葡聚糖轉(zhuǎn)移酶水解酶基因GmXTH1，其堿基序列如序列表SEQ ID NO.1所示；

大豆木葡聚糖轉(zhuǎn)移酶水解酶基因GmXTH1，它是下述方法制備的：

1）提取大豆根系突變體材料M18苗期根系組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并以其為模板；

2）用引物：

XTHCDS-s：ATCAATCCATGGTGGTTCAT

XTHCDS-as：CCTATATGATGCTGTGAATG

擴(kuò)增；

所述的GmXTH1為人工合成。

GmXTH1蛋白，它是序列表SEQ ID NO.1所示基因表達(dá)的蛋白。

pCAMBIA3301- GmXTH1植物過(guò)表達(dá)載體，它是在pCAMBIA3301中插入了如序列表SEQ ID NO.1所示基因。

大豆木葡聚糖轉(zhuǎn)移酶水解酶基因GmXTH1在培育抗旱植轉(zhuǎn)基因植物品種的應(yīng)用；

所述的植物為大豆。

本發(fā)明提供了大豆木葡聚糖轉(zhuǎn)移酶水解酶基因GmXTH1，它是來(lái)自于大豆根系突變體材料M18，所述的的大豆根系突變體材料M18是大豆（Glycine max）品種吉農(nóng)18的突變體，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，GmXTH1是一種抗旱基因，過(guò)量表達(dá)GmXTH1基因的轉(zhuǎn)基因株系具有更強(qiáng)大的根系，干旱脅迫處理下， SOD活性、POD活性、CAT活性有顯著升高，有較高的光能吸收和轉(zhuǎn)化作用，抗旱性強(qiáng)。

過(guò)量表達(dá)GmXTH1基因的轉(zhuǎn)基因株系比對(duì)照M18具有更強(qiáng)大的根系，根系主要表型性狀的參數(shù)平均值都得到了顯著的增加，說(shuō)明GmXTH1基因的過(guò)量表達(dá)明顯促進(jìn)了苗期大豆植株根系的生長(zhǎng)發(fā)育；相反的，GmXTH1基因的干擾表達(dá)使苗期的大豆根系發(fā)達(dá)程度受到了抑制，各指標(biāo)要明顯低于對(duì)照，暗示GmXTH1基因的表達(dá)對(duì)苗期大豆根系的生長(zhǎng)發(fā)育有重要影響。

干旱脅迫處理下，各株系的SOD活性、POD活性、CAT活性均有顯著升高，平均值表現(xiàn)為GmXTH1基因過(guò)表達(dá)株系＞對(duì)照M18＞GmXTH1基因干擾表達(dá)株系，且差異達(dá)到極顯著水平(P ＜ 0.01)，表明過(guò)表達(dá)株系的抵御活性氧和自由基傷害的能力較對(duì)照M18和干擾表達(dá)株系有明顯增強(qiáng)，其抗旱能力較強(qiáng)。

GmXTH1基因的表達(dá)明顯影響了大豆苗期的根系活力，過(guò)表達(dá)株系有著較高的根系活力，有較強(qiáng)的抗旱性。

干旱脅迫處理下，各株系的葉片含水量都有顯著下降，無(wú)論是正常條件下還是干旱處理?xiàng)l件下，過(guò)表達(dá)株系的葉片含水量都相對(duì)較高，說(shuō)明過(guò)表達(dá)GmXTH1基因可以使大豆幼苗的葉片含水量維持在較高的水平，有利于保持其葉綠體結(jié)構(gòu)和 PSⅡ功能的完整，從而使其保持較高的光合作用水平，可見(jiàn)過(guò)表達(dá)株系的抗旱性強(qiáng)于對(duì)照M18和干擾表達(dá)株系。

干旱脅迫下大豆幼苗葉片的葉綠素含量較正常處理有顯著降低，表明干旱處理可以抑制葉綠素合成，并加速其分解，可能與干旱脅迫使葉綠體發(fā)生膜脂過(guò)氧化而產(chǎn)生的活性氧、丙二醛對(duì)葉綠素的破壞有關(guān)。但無(wú)論是干旱處理還是正常水分處理，葉綠素含量均表現(xiàn)為GmXTH1基因過(guò)表達(dá)株系＞對(duì)照M18＞GmXTH1基因干擾表達(dá)株系，表明過(guò)表達(dá)株系的葉片在光合作用中有較高的光能吸收和轉(zhuǎn)化作用，說(shuō)明過(guò)表達(dá)株系較對(duì)照M18和干擾表達(dá)株系具有較強(qiáng)的抗旱性。

過(guò)表達(dá)GmXTH1基因的轉(zhuǎn)基因株系的抗旱能力要顯著高于對(duì)照M18，相反的，GmXTH1基因受到干擾的轉(zhuǎn)基因株系抗旱能力要弱于對(duì)照。而且過(guò)表達(dá)株系苗期根系的生長(zhǎng)狀況明顯優(yōu)于對(duì)照M18，其農(nóng)藝性狀較對(duì)照并未有明顯改變。過(guò)量表達(dá)GmXTH1基因的轉(zhuǎn)基因株系OEA1、OEA3農(nóng)藝性狀較好，抗旱性強(qiáng)，可以作為大豆抗旱育種的基礎(chǔ)材料加以利用。

附圖說(shuō)明

圖 1 GmXTH1基因核心片段的 PCR 擴(kuò)增電泳圖，M: DNA 標(biāo)準(zhǔn)分子量； 1-4：PCR 產(chǎn)物；

圖 2 GmXTH1基因3′端片段的 PCR 擴(kuò)增電泳圖，M: DNA 標(biāo)準(zhǔn)分子量； 1-4：PCR 產(chǎn)物；

圖 3 GmXTH1基因 5′端片段 PCR 擴(kuò)增電泳圖，M: DNA 標(biāo)準(zhǔn)分子量； 1-4：PCR 產(chǎn)物；

圖 4 GmXTH1 基因全長(zhǎng)片段的 PCR 擴(kuò)增電泳圖，M: DNA 標(biāo)準(zhǔn)分子量； 1-4：PCR 產(chǎn)物；

圖5 植物過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建及驗(yàn)證，A. 過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建；B. 過(guò)表達(dá)載體的驗(yàn)證；C. 表達(dá)載體的T-DNA結(jié)構(gòu)區(qū)；

圖6 植物干擾表達(dá)載體的構(gòu)建及驗(yàn)證，A. 正義片段連入表達(dá)載體；B. 內(nèi)含子片段連入表達(dá)載體；C. 反義片段連入表達(dá)載體；D.干擾表達(dá)載體的T-DNA結(jié)構(gòu)區(qū)；E.干擾表達(dá)載體的驗(yàn)證；

圖7 T0代過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)化植株的PCR檢測(cè)，A. 目標(biāo)基因GmXTH1；B. 篩選標(biāo)記基因bar，M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；P：質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照；N：水陰性對(duì)照；CK：未轉(zhuǎn)基因植株(陰性對(duì)照）；1-5：轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株OEA1-OEA5；

圖8 T1代過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)化植株的PCR檢測(cè)，A. 目標(biāo)基因GmXTH1；B. 篩選標(biāo)記基因bar，M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；P：質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照；N：水陰性對(duì)照；CK：未轉(zhuǎn)基因植株(陰性對(duì)照）；1-5：轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株OEA1-OEA5；

圖9 T2代過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)化植株的PCR檢測(cè)，A. 目標(biāo)基因GmXTH1；B. 篩選標(biāo)記基因bar，M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；P：質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照；N：水陰性對(duì)照；CK：未轉(zhuǎn)基因植株(陰性對(duì)照）；1-5：轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株OEA1-OEA5；

圖10 T2代過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)化植株的Southern blot檢測(cè)， M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；P:陽(yáng)性對(duì)照;C:陰性對(duì)照(未經(jīng)轉(zhuǎn)化的大豆植株);1-5:轉(zhuǎn)基因植株OEA1-OEA5；

圖11 T0代干擾表達(dá)轉(zhuǎn)化植株的PCR檢測(cè)A. 篩選標(biāo)記基因bar；B.啟動(dòng)子35S；M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；P：質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照；N：水陰性對(duì)照；CK：未轉(zhuǎn)基因植株(陰性對(duì)照）；1-5：轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株IEA1-IEA6；

圖12 T1代干擾表達(dá)轉(zhuǎn)化植株的PCR檢測(cè)，A. 篩選標(biāo)記基因bar；B.啟動(dòng)子35S，M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；P：質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照；N：水陰性對(duì)照；CK：未轉(zhuǎn)基因植株(陰性對(duì)照）；1-5：轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株IEA1、IEA3-IEA6；

圖13 T2代干擾表達(dá)轉(zhuǎn)化植株的PCR檢測(cè)，A. 篩選標(biāo)記基因bar；B.啟動(dòng)子35S，M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；P：質(zhì)粒陽(yáng)性對(duì)照；N：水陰性對(duì)照；CK：未轉(zhuǎn)基因植株(陰性對(duì)照）；1-5：轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株IEA1、IEA3-IEA6；

圖14 T2代干擾表達(dá)Southern blot檢測(cè) ，M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；P:陽(yáng)性對(duì)照;C:陰性對(duì)照(未經(jīng)轉(zhuǎn)化的大豆植株);1-5:轉(zhuǎn)基因植株OEA1-OEA5；

圖15 目標(biāo)基因GmXTH1的相對(duì)表達(dá)量；

圖16干旱脅迫對(duì)不同轉(zhuǎn)基因株系生理生化指標(biāo)的影響。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1基因 GmXTH1的 cDNA 序列的克隆

大豆（Glycine max）根系突變體材料M18（大豆吉農(nóng)18的突變體），由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)植物生物技術(shù)中心提供。

使用TAKARA公司生產(chǎn)的RNAiso試劑盒從大豆根系突變體材料M18苗期根系組織提取總RNA，根據(jù)RNA-seq測(cè)序結(jié)果序列，設(shè)計(jì)嵌套引物XTHgsp，擴(kuò)增目的片段并測(cè)序，驗(yàn)證擴(kuò)增得到正確的目的片段。

采用TAKARA公司的RACE試劑盒克隆3′端片段。以大豆苗期根系的cDNA為模板，使用引物XTHgsp-s和試劑盒中3′ RACE Outer Primer進(jìn)行Outer PCR擴(kuò)增反應(yīng)，再以反應(yīng)產(chǎn)物為模板使用引物XTHgsp-as和試劑盒中的3′RACE Inner Primer進(jìn)行Inner PCR反應(yīng)。擴(kuò)增得到目的基因3′端片段。

采用TAKARA公司的RACE試劑盒克隆5′端片段。以大豆苗期根系總RNA為模板，使用引物XTHgsp-s和試劑盒中5′ RACE Outer Primer進(jìn)行Outer PCR反應(yīng)，以反應(yīng)產(chǎn)物為模板再使用引物XTHgsp-as和試劑盒中的5′ RACE Inner Primer進(jìn)行Inner PCR反應(yīng)。擴(kuò)增得到目的基因5′端片段。

將3′RACE與5′RACE反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行拼接，設(shè)計(jì)擴(kuò)增全長(zhǎng)基因片段的特異性引物XTHCDS。以大豆根系總RNA對(duì)應(yīng)的cDNA為模板，通過(guò)RT-PCR方法擴(kuò)增其對(duì)應(yīng)片段。

表1 PCR引物序列

GmXTH1基因全長(zhǎng) cDNA 序列的克隆

根據(jù)前期篩選得到的GmXTH1核心片段設(shè)計(jì)特異引物 XTHgsp，經(jīng)RT-PCR 擴(kuò)增后，得到一條約 303bp的核酸條帶（圖1），將 PCR 產(chǎn)物克隆至 PMD18-T 載體后進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與 NCBI中序列號(hào)為 XM_003542112.3 的序列相比同源性達(dá)到 100%，證明克隆得到了目的基因的部分核心片段，可以作為 5`RACE、3`RACE 的核心片段。

基因 GmXTH1 的 3′端片段的克隆使用特異性引物XTHgsp-s和試劑盒中 3′ RACE Outer Primer 進(jìn)行第一次 PCR 反應(yīng)，結(jié)果未得到目的產(chǎn)物；使用上游特異性引物 XTHgsp-as 和試劑盒中 3′RACE Inner Primer 進(jìn)行第二次 PCR 反應(yīng)，擴(kuò)增得到一條約 422bp 的片段（圖2）。測(cè)序結(jié)果表明，得到大豆木葡聚糖轉(zhuǎn)移酶/水解酶基因GmXTH1 的 3′端片段的基因序列，共包括 422bp，其中新擴(kuò)增的核酸片段為142bp，其中編碼區(qū) 45bp，3`非編碼區(qū) 97bp。

通過(guò) TAKARA 公司的 5′RACE 試劑盒克隆目的基因的 5′端片段。使用特異性引物 XTHgsp-s 和試劑盒中的 5′RACE Inner Primer 進(jìn)行 Inner PCR 反應(yīng)，擴(kuò)增得到一條約632bp 的片段（圖3），測(cè)序結(jié)果表明獲得了大豆GmXTH1基因的 5′端片段序列，其中包括編碼區(qū) 570bp，5`非編碼區(qū) 62bp，新擴(kuò)增的片段區(qū)域?yàn)?632bp。

基因 GmXTH1全長(zhǎng)克隆。將目的基因 3′端片段的克隆測(cè)序結(jié)果和 5′端片段的克隆測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，去掉冗余部分，設(shè)計(jì)擴(kuò)增全長(zhǎng)序列的特異性引物XTHCDS。PCR 反應(yīng)擴(kuò)增全長(zhǎng) cDNA 序列，測(cè)序結(jié)果證明得到基因全長(zhǎng) 1015bp（圖4）。通過(guò) NCBI 的BLAST 程序在 Genbank 中搜索相似序列，結(jié)果沒(méi)有搜索到完全相似的序列的基因序列，證明了分離得到一個(gè)新基因的核酸序列。

將GmXTH1基因全序列連入克隆載體pMD18-T Vector，對(duì)重組載體進(jìn)行測(cè)序后進(jìn)行生物信息學(xué)分析，測(cè)序由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司完成。

實(shí)施例2 植物表達(dá)載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化

利用限制性內(nèi)切酶BglII和BstEII對(duì)植物表達(dá)載體pCAMBIA3301進(jìn)行雙酶切，T4連接酶作用下將克隆得到的GmXTH1全長(zhǎng)基因替換3301上原有的GUS基因。構(gòu)建以Bar為篩選標(biāo)記，CaMV35S啟動(dòng)子啟動(dòng)目標(biāo)基因GmXTH1的pCAMBIA3301- GmXTH1植物過(guò)表達(dá)載體。

采用同樣方法，將3301上原有的GUS基因替換為GmXTH1核心正義+內(nèi)含子+ GmXTH1核心反義片段，構(gòu)建pCAMBIA3301- GmXTH1-RNAi植物干擾表達(dá)載體。

將構(gòu)建好的植物過(guò)表達(dá)載體pCAMBIA3301- GmXTH1和植物干擾表達(dá)載體pCAMBIA3301- GmXTH1-RNAi，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化大豆突變體材料M18。

植物表達(dá)載體的驗(yàn)證及遺傳轉(zhuǎn)化

利用BglII和BstEII限制性內(nèi)切酶對(duì)植物表達(dá)載體pCAMBIA3301進(jìn)行雙酶切，得到大小為10kb的3301載體大片段和2042bp的GUS基因片段；利用引物XTHover對(duì)克隆載體Pmd18-T-GmXTH1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到大小840bp的GmXTH1基因ORF全長(zhǎng)片段（圖5A），利用T4連接酶將GmXTH1基因ORF全長(zhǎng)片段連入植物表達(dá)載體pCAMBIA3301。

對(duì)構(gòu)建成功的植物過(guò)表達(dá)載體pCAMBIA3301- GmXTH1-over進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定，均得到與預(yù)期大小相符的GmXTH1基因ORF全長(zhǎng)片段840bp（圖5B），對(duì)其進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果正確，說(shuō)明植物過(guò)表達(dá)載體pCAMBIA3301- GmXTH1構(gòu)建成功（圖5C）。

利用BglII和MfeI限制性內(nèi)切酶對(duì)植物表達(dá)載體pCAMBIA3301進(jìn)行雙酶切，得到大小為10kb的3301載體大片段和2042bp的GUS基因片段；利用引物XTHZ對(duì)克隆載體Pmd18-T- GmXTH1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到大小為303bp的目的基因正義片段（圖6A），利用T4連接酶將GmXTH1正義片段連入植物表達(dá)載體pCAMBIA3301，得到中間載體A pCAMBIA3301-XTHZ。

利用MfeI和VspI限制性內(nèi)切酶對(duì)植物表達(dá)載體A pCAMBIA3301-XTHZ進(jìn)行雙酶切，得到大小為10kb的3301載體大片段和818bp的GUS基因部分片段；利用引物SSR對(duì)克隆載體Pmd18-T-SSR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到大小為205bp的SSR內(nèi)含子片段（圖6B），利用T4連接酶將SSR內(nèi)含子連入植物表達(dá)載體pCAMBIA3301-XTHZ，得到中間載體B pCAMBIA3301-XTHZ-SSR。

利用VspI和BstEII限制性內(nèi)切酶對(duì)植物表達(dá)載體pCAMBIA3301-XTHZ-SSR進(jìn)行雙酶切，得到大小為10kb的3301載體大片段和894bp的GUS基因部分片段；利用引物XTHF對(duì)克隆載體Pmd18-T-GmXTH1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到大小為303bp的目的基因反義片段（圖6C），利用T4連接酶將GmXTH1反義片段連入植物表達(dá)載體pCAMBIA3301-XTHZ-SSR，得到植物干擾表達(dá)載體pCAMBIA3301- GmXTH1-RNAi（圖6D）。

對(duì)構(gòu)建成功的植物干擾表達(dá)載體pCAMBIA3301- GmXTH1-RNAi進(jìn)行PCR和酶切鑒定。分別對(duì)GmXTH1正義片段、SSR內(nèi)含子、GmXTH1反義片段進(jìn)行特異性擴(kuò)增，得到的擴(kuò)增條帶都與預(yù)期大小相符。用BglII和BstEII雙酶切該質(zhì)粒，得到一條大小約為811bp的XTHZ-SSR-XTHF干擾片段；用BglII、MfeI雙酶切該質(zhì)粒，得到一條大小約為303bp 的GmXTH1正義片段；用MfeI和VspI雙酶切得到一條大小約為205bp的SSR內(nèi)含子片段；用VspI和BstEII雙酶切該質(zhì)粒，得到一條大小約為303bp 的GmXTH1反義片段（圖6E）。

以大豆突變體材料M18做為受體，將構(gòu)建好的植物過(guò)表達(dá)載體pCAMBIA3301-GmXTH1和植物干擾表達(dá)載體pCAMBIA3301- GmXTH1-RNAi采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化大豆子葉節(jié)，經(jīng)萌發(fā)培養(yǎng)、恢復(fù)培養(yǎng)、共培養(yǎng)、選擇培養(yǎng)、伸長(zhǎng)培養(yǎng)、生根和煉苗移栽，獲得抗性轉(zhuǎn)化植株，并在溫室內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)和加代。

實(shí)施例3轉(zhuǎn)化植株的分子檢測(cè)

采用改良的CTAB法，從大豆葉片中提取基因組DNA，將其作為模板，以載體質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，以未轉(zhuǎn)化植株為陰性對(duì)照，分別以GmXTH1基因、篩選標(biāo)記基因bar和35S啟動(dòng)子的特異性引物（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

對(duì)PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)基因植株，進(jìn)行Southern雜交檢測(cè)。以純化的篩選標(biāo)記基因bar為模板制備探針，采用隨機(jī)引物標(biāo)記法進(jìn)行標(biāo)記，雜交及檢測(cè)的其他步驟均按照DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitII試劑盒的說(shuō)明書(shū)操作。

利用 Total RNA Extraction Kit 提取試劑盒提取轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株和未轉(zhuǎn)化植株的根系總 RNA，反轉(zhuǎn)錄成 cDNA，利用 Mx3000P 熒光定量 PCR 儀對(duì)目標(biāo)基因GmXTH1進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)。

轉(zhuǎn)化植株的分子檢測(cè)

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法獲得了轉(zhuǎn)植物過(guò)表達(dá)載體pCAMBIA3301- GmXTH1的T0代抗性植株8株，對(duì)目標(biāo)基因GmXTH1和篩選標(biāo)記基因bar分別進(jìn)行PCR檢測(cè)（圖7），兩個(gè)基因均檢測(cè)到的植株有5株，標(biāo)號(hào)OEA1-OEA5（OEA，over expression- agrobacterium-mediated method）。

將檢測(cè)為陽(yáng)性的植株在人工氣候室內(nèi)培養(yǎng)至成熟，收獲籽粒，在溫室內(nèi)進(jìn)行加代，對(duì)T1代植株進(jìn)行PCR檢測(cè)，OEA1-OEA5的T1代植株均檢測(cè)到了目標(biāo)基因GmXTH1和篩選標(biāo)記基因bar（圖8）。

收獲檢測(cè)為陽(yáng)性的OEA1-OEA5的T1代植株籽粒，種植于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)種植基地，在T2代植株長(zhǎng)至R1期時(shí)，每個(gè)株系隨機(jī)選擇20株進(jìn)行PCR檢測(cè)，圖9是部分陽(yáng)性材料的檢測(cè)結(jié)果。

對(duì)T2代過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株進(jìn)行southern雜交檢測(cè)，選用Hind Ⅲ限制性內(nèi)切酶，對(duì)外源篩選標(biāo)記基因bar進(jìn)行Southern雜交分析，檢測(cè)外源基因在大豆M18的整合情況，進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)化事件的準(zhǔn)確性。雜交結(jié)果顯示PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的5株轉(zhuǎn)基因植株均有明顯的雜交信號(hào)，且雜交帶的大小、位置互不相同，說(shuō)明外源基因bar已經(jīng)整合到大豆的基因組中，且整合形式均為單拷貝（圖10）。

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法獲得了轉(zhuǎn)干擾表達(dá)載體pCAMBIA3301- GmXTH1-RNAi的T0代抗性植株11株，對(duì)篩選標(biāo)記基因bar和啟動(dòng)子35s分別進(jìn)行PCR檢測(cè)（圖11），兩個(gè)基因均檢測(cè)到的植株有6株，標(biāo)號(hào)IEA1-IEA6（IEA，interference expression- agrobacterium-mediated method）。

將檢測(cè)為陽(yáng)性的植株在人工氣候室內(nèi)培養(yǎng)至成熟，收獲籽粒，在溫室內(nèi)進(jìn)行加代，對(duì)T1代植株進(jìn)行PCR檢測(cè)（圖12），IEA1-IEA6的T1代植株均檢測(cè)到了篩選標(biāo)記基因bar和啟動(dòng)子35s，但I(xiàn)EA2植株的T1代植株中僅檢測(cè)到了2株陽(yáng)性，故沒(méi)有進(jìn)行后續(xù)的加代培養(yǎng)和試驗(yàn)。

收獲檢測(cè)為陽(yáng)性的IEA1、IEA3-IEA6的T1代植株籽粒，種植于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)種植基地，在T2代植株長(zhǎng)至R1期時(shí)，每個(gè)株系隨機(jī)選擇20株進(jìn)行PCR檢測(cè)，圖13是部分陽(yáng)性材料的檢測(cè)結(jié)果。

對(duì)T2代干擾表達(dá)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株進(jìn)行southern雜交檢測(cè)，選用Hind Ⅲ限制性內(nèi)切酶，對(duì)外源篩選標(biāo)記基因bar進(jìn)行Southern雜交分析，檢測(cè)外源基因在大豆M18的整合情況，進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)化事件的準(zhǔn)確性。雜交結(jié)果顯示PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的5株轉(zhuǎn)基因植株均有明顯的雜交信號(hào)，且雜交帶的大小、位置互不相同，說(shuō)明外源基因bar已經(jīng)整合到大豆的基因組中，且整合形式均為單拷貝（圖14）。

實(shí)施例4 GmXTH1基因的功能分析

采用砂培法，將轉(zhuǎn)化植株和受體材料種植于直徑7cm高22cm的圓柱形塑料筒，于人工培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。植株長(zhǎng)至三節(jié)期(V3期)時(shí)，用流水沖洗凈根系上的砂粒，用 EPSON掃描儀(Seiko Epson Corp, Tokyo, Japan) 對(duì)根系進(jìn)行掃描，觀察根系形態(tài)（每份轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性品系取5株，每株材料3次重復(fù)）。掃描后保存圖像，采用WinRHIZO (version 4.0b, Regent Instruments Inc., Quebec ,Canada 2000) 分析程序?qū)D像進(jìn)行分析。分析主根長(zhǎng)(RL)、側(cè)根總長(zhǎng)度、根表面積(SA)和根體積(RV)，測(cè)定根干重和根鮮重。用DPS數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行相關(guān)分析和方差分析，對(duì)參數(shù)的平均值進(jìn)行LSR多重比較，進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)(α=0.05)。

采用反復(fù)干旱法對(duì)三節(jié)期(V3期)的轉(zhuǎn)化植株和對(duì)照植株同時(shí)進(jìn)行水分脅迫，干旱處理 10d 后復(fù)水，使土壤水分達(dá)田間持水量的 80% ±5%，3 次干旱處理后，采用氮藍(lán)四唑(NBT)光化還原比色法測(cè)定超氧化物歧化酶(SOD)活性；愈創(chuàng)木酚法測(cè)定過(guò)氧化物酶(POD)活性；紫外吸收法測(cè)定過(guò)氧化氫酶（CAT）的活性；稱重法測(cè)定葉片相對(duì)含水量(RWC)；丙酮比色法測(cè)定葉綠素含量。用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和作圖。

田間試驗(yàn)在吉林省吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)基地進(jìn)行，采取隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，三行區(qū)，行長(zhǎng) 4.5m，每行播種 60 粒，每個(gè)品系重復(fù) 3次，待秋季大豆成熟后，每小區(qū)隨機(jī)采取 10 株大豆進(jìn)行考種，其余收獲測(cè)產(chǎn)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 Excel2003 及DPS軟件進(jìn)行分析，檢驗(yàn)各處理平均值之間的差異顯著性。

轉(zhuǎn)化植株目標(biāo)基因GmXTH1的表達(dá)量分析

大豆苗期（V3期）提取T2代陽(yáng)性轉(zhuǎn)化植株的根部組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄成相對(duì)應(yīng)的cDNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。GmXTH1基因的表達(dá)量分析根據(jù)公式2^-ΔΔCt法計(jì)算，實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果如圖15所示。與對(duì)照受體植株相比，過(guò)量表達(dá)GmXTH1基因的轉(zhuǎn)基因株系中，GmXTH1基因在根中的相對(duì)表達(dá)量顯著增加，其中OEA3株系的相對(duì)表達(dá)量平均值最高，是對(duì)照株系的4.3327倍，其次是OEA1株系，是對(duì)照株系的3.66403倍。干擾表達(dá)GmXTH1基因的轉(zhuǎn)基因株系中，GmXTH1基因在根中的相對(duì)表達(dá)量顯著降低，其中IEA4降低幅度最大，降低了56.3163%，其次是IEA5，比對(duì)照株系降低了47.303%。

轉(zhuǎn)化植株根系形態(tài)指標(biāo)鑒定

對(duì)過(guò)表達(dá)GmXTH1基因的轉(zhuǎn)化株系OEA1、OEA3，干擾表達(dá)GmXTH1基因的轉(zhuǎn)化株系IEA4、IEA5，以及受體對(duì)照M18的苗期（V3期）的根系表觀形態(tài)進(jìn)行掃描測(cè)定，結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)株系OEA1、OEA3的主根長(zhǎng)、一級(jí)側(cè)根數(shù)、側(cè)根總長(zhǎng)度、根表面積、根體積、根干重、根鮮重等指標(biāo)的平均值均高于對(duì)照，而干擾表達(dá)株系IEA4、IEA5的這七項(xiàng)指標(biāo)的平均值均低于對(duì)照，且都達(dá)到了顯著水平。說(shuō)明GmXTH1基因的過(guò)量表達(dá)明顯促進(jìn)了苗期大豆植株根系的生長(zhǎng)發(fā)育，根系主要表型性狀的參數(shù)平均值都得到了顯著的增加；相反的，GmXTH1基因的干擾表達(dá)使苗期的大豆根系發(fā)達(dá)程度受到了抑制，各指標(biāo)要明顯低于對(duì)照。暗示GmXTH1基因的表達(dá)對(duì)苗期大豆根系的生長(zhǎng)發(fā)育有重要影響。

表2 不同轉(zhuǎn)基因株系的根系表型性狀

干旱脅迫對(duì)不同轉(zhuǎn)基因株系生理生化指標(biāo)的影響

對(duì) SOD 活性的影響

超氧化物歧化酶(SOD)是植物體內(nèi)的一種保護(hù)酶，逆境中 SOD 保護(hù)酶活性升高可控制膜脂質(zhì)過(guò)氧化作用, 減少干旱對(duì)膜結(jié)構(gòu)的傷害, 增強(qiáng)植物自身保護(hù)的調(diào)節(jié)能力。正常條件下，過(guò)表達(dá)株系OEA1、OEA3的SOD活性要顯著高于對(duì)照M18，相反干擾表達(dá)株系IEA4、IEA5的SOD活性顯著低于對(duì)照。干旱脅迫條件下，對(duì)照株系、過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系、干擾表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系的SOD活性都有顯著上升，SOD活性平均值表現(xiàn)為GmXTH1基因過(guò)表達(dá)株系＞對(duì)照M18＞GmXTH1基因干擾表達(dá)株系，且差異達(dá)到極顯著水平(P ＜ 0.01)，GmXTH1基因過(guò)表達(dá)株系OEA3的葉片SOD活性最高，表明其抵御活性氧和自由基傷害的能力較強(qiáng)。

對(duì)POD活性的影響

正常條件下，過(guò)表達(dá)株系、干擾表達(dá)株系和對(duì)照株系間進(jìn)行比較表明，其葉片POD活性差異不顯著。干旱脅迫條件下，對(duì)照株系、過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系、干擾表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系的POD活性都有顯著上升，其中，OEA1、OEA3株系的POD活性平均值比對(duì)照株系分別高18.39%、17.08%，差異達(dá)到顯著水平；IEA4、IEA5株系的POD活性平均值比對(duì)照株系略有降低，分別降低了2.8%、1.19%，差異并未達(dá)到顯著水平。

對(duì)CAT活性的影響

正常條件下，CAT活性平均值表現(xiàn)為GmXTH1基因過(guò)表達(dá)株系＞對(duì)照M18＞GmXTH1基因干擾表達(dá)株系，干擾表達(dá)株系的CAT活性下降顯著。干旱脅迫條件下，對(duì)照株系、過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系、干擾表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系的CAT活性都有顯著上升，不同株系間的變化趨勢(shì)差異較大，其中，OEA1、OEA3株系的CAT活性平均值比對(duì)照株系分別高26.19%、28.36%， IEA4、IEA5株系的POD活性平均值比對(duì)照株系分別降低了29.93%、31.77%，差異達(dá)到顯著水平。

對(duì)根系活力的影響

正常水分處理下，根系活力平均值表現(xiàn)為：OEA3＞OEA1＞CK＞IE5＞IE4，且過(guò)表達(dá)株系、對(duì)照株系、干擾表達(dá)株系間差異顯著，說(shuō)明GmXTH1基因的表達(dá)明顯影響了大豆苗期的根系活力。在干旱處理?xiàng)l件下不同株系間的根系活力均呈下降趨勢(shì)，根系活力平均值OEA3＞OEA1＞CK＞IE4＞IE5。無(wú)論是正常水分條件下，還是干旱脅迫處理?xiàng)l件下，根系活力平均值都表現(xiàn)為：過(guò)表達(dá)株系＞對(duì)照株系＞干擾表達(dá)株系，說(shuō)明過(guò)表達(dá)株系有著較高的根系活力，有較強(qiáng)的抗旱性。

對(duì)葉片相對(duì)含水量的影響

正常條件下，葉片含水量表現(xiàn)為GmXTH1基因過(guò)表達(dá)株系＞對(duì)照M18＞GmXTH1基因干擾表達(dá)株系，干擾表達(dá)株系的葉片含水量顯著低于對(duì)照和過(guò)表達(dá)株系。干旱脅迫處理下，各株系的葉片含水量都有顯著下降，葉片含水量平均值表現(xiàn)為GmXTH1基因過(guò)表達(dá)株系＞對(duì)照M18＞GmXTH1基因干擾表達(dá)株系，且差異顯著。說(shuō)明無(wú)論是正常條件下還是干旱處理?xiàng)l件下，過(guò)表達(dá)株系的葉片含水量都相對(duì)較高，說(shuō)明過(guò)表達(dá)GmXTH1基因可以使大豆幼苗的保水力較其他材料有所提高。葉片含水量高的材料比較抗（耐）旱，葉片含水量是抗旱性鑒定的可靠指標(biāo)。

對(duì)葉綠素含量的影響

葉綠素是光合作用中重要的色素，在光合作用中占重要地位。無(wú)論是干旱處理還是正常水分處理，葉綠素含量均表現(xiàn)為GmXTH1基因過(guò)表達(dá)株系＞對(duì)照M18＞GmXTH1基因干擾表達(dá)株系。干旱脅迫下大豆幼苗葉片的葉綠素含量較正常處理有顯著降低，其中過(guò)表達(dá)株系的下降幅度（18.708-18.687%）小于干擾表達(dá)株系的下降幅度（24.512-26.728%）。

轉(zhuǎn)化材料的農(nóng)藝性狀分析

由調(diào)查結(jié)果可知，在正常田間管理?xiàng)l件下，轉(zhuǎn)基因株系與對(duì)照株系M18在葉形、花色、毛色、生育期和結(jié)莢習(xí)性等方面無(wú)明顯差異，均表現(xiàn)為圓葉，紫花，棕色茸毛，結(jié)莢習(xí)性為無(wú)限型。轉(zhuǎn)基因大豆在株高、節(jié)數(shù)、莢數(shù)、百粒重、單株粒重等方面與非轉(zhuǎn)基因大豆沒(méi)有顯著差異。產(chǎn)量表現(xiàn)為OEA3＞OEA1＞CK＞IEA5＞IEA4，其中OEA3株系增產(chǎn)明顯，增產(chǎn)幅度為8.19%，其余材料間差異未達(dá)到顯著水平(表3)。

表3 轉(zhuǎn)基因大豆產(chǎn)量性狀調(diào)查結(jié)果

<110> 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120> 大豆木葡聚糖轉(zhuǎn)移酶水解酶基因GmXTH1及應(yīng)用

<160> 1

<210> 1

<211> 1014

<212> DNA

<213> 人工

<400> 1

tattaatcaa tccatggtgg ttcatatgta tctttcagct tctcagtgga tgggacccca 60

ataagagaat tcaagaacat ggggttcggc tcgagccaga tgcccagcgc gctcgtggcg 120

ctggtgctcg gcctctgctg cgtcggcggc gcacgcccga cggggaggat cgacgagggg 180

caggaggtca tgtggggcga cggccggggg agcgtctcgc cggacggcca ggtgatggcg 240

ctgtcgctcc accacacctc cggctccggg tggtgctcca agaacacgta cctgttcgcg 300

cgcgtcacca cctgctactt catgacggaa ggggagtcgg atatccacga tgaggtggac 360

ctggagttcc tcggcaacgt caccgggcag ccgtacacgc tgcacaccat cgtcttcgcc 420

aatggcaccc gcggcaaaga gcagcagttc cacctctggt tcgaccccac caccgacttc 480

caccacgtcg tcttctacgt gcacggcgtc cggatccggg agttccgccg ccgcggcgac 540

cggaccgtgc cgttccggac gtcgcagccg atggaatcga aaagagtttc attcccaaag 600

gagcagccaa tgcggatata ctcaagccta tggaatgctg atgactgggc aacaagaggt 660

ggcattgtga agactgattg gagccaagct ccattcacag catcatatag gaacttcaat 720

gccaatgcct gtgtccattc tggaccatca tcttgcactt ccaactctgc ctcctccaat 780

gcctggttca accaacagtt ggattcaaca agccaagaca gactgtgttg ggtgcagaag 840

aattacatgt ttaacaatta ctgcactgtc accaatagat ttccacaagg ccttccccca 900

gagtgccaag catcatgagg atatactcaa gcctatggaa tgctgactgg gcaacaagag 960

gtggcattgt gaaactgatt ggagccaagc tccattcaca gcatcatata ggaa 1014