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一種鵝細小病毒感染性克隆的拯救方法與流程

文檔序號:12712569閱讀:來源:國知局

技術特征:

1.一種鵝細小病毒(GPV)感染性克隆質粒的拯救方法,其特征在于,是將GPV的完整基因組克隆入載體質粒pBSKNB,獲得重組質粒;將重組質粒與轉染試劑混合后,通過絨毛尿囊膜途徑接種非免疫鵝胚,重組質粒在鵝胚中得到拯救;所述pBSKNB載體,是將pBluescript II(SK)質粒上原有的EcoRV和HindIII酶切位點分別用NcoI和BclI位點替換而得到。

2.如權利要求1所述的方法,其特征在于:將重組質粒與轉染試劑Lipofectamine 2000按照1:2.5(μg/μl)比例混合后,通過絨毛尿囊膜途徑接種11日齡非免疫鵝胚;鵝胚在接種后120h~192h之間死亡,胚體具有典型的GPV感染特征,表現(xiàn)為胚體出血、絨毛尿囊膜水腫的典型特征。拯救出的病毒具有與親本病毒相近的生物學特性。

3.如權利要求1所述的方法,其特征在于,所述的重組質粒是pLH,它的構建方法為:超速離心濃縮GPV LH株病毒,提取病毒的基因組單鏈DNA,體外退火后生成雙股DNA;選用BclI和NcoI酶切基因組DNA生成亞基因組片段,分別克隆入pBSKNB載體的相應酶切位點,再通過酶切-連接的分子操作,拼接獲得含有完整基因組的質粒pLH。

4.如權利要求1所述的方法,其特征在于,在所述的重組質粒的克隆基因組內(nèi)部引入兩個同義堿基突變作為遺傳標記,帶有遺傳標記的重組質粒再與轉染試劑混合后,通過絨毛尿囊膜途徑接種11日齡非免疫鵝胚,帶有遺傳標記的重組質粒在鵝胚中得到拯救。

5.如權利要求4所述的方法,其特征在于,所述帶有遺傳標記的重組質粒是pLHΔ,它的構建方法為:超速離心濃縮GPV LH株病毒,提取病毒的基因組單鏈DNA,體外退火后生成雙股DNA;選用BclI和NcoI酶切基因組DNA生成亞基因組片段,分別克隆入pBSKNB載體的相應酶切位點,再通過酶切-連接的分子操作,拼接獲得含有完整基因組的質粒pLH;進一步通過overlap PCR方法,在pLH質粒的VP1基因中引入兩個突變堿基作為遺傳標記,獲得質粒pLHΔ。

6.如權利要求2所述的方法,其特征在于,所述相近的生物學特性是指在鵝胚半數(shù)致死量(ELD50)和感染試驗中的雛鵝死亡率這兩個關鍵指標上,拯救病毒具有與親本病毒相近的數(shù)值。

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