本發(fā)明涉及二元或多元環(huán)糊精聚合物類手性拆分劑的合成及其在毛細(xì)管電泳手性分析中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

毛細(xì)管電泳技術(shù)(CE)與高效液相色譜、氣相色譜等技術(shù)相比，具有高效、快速、樣品量少、選擇性高、分離模式多樣及易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等優(yōu)勢(shì)，被廣泛應(yīng)用于手性分離領(lǐng)域。

對(duì)于CE手性分離，利用手性拆分劑來構(gòu)建立體選擇性環(huán)境是實(shí)現(xiàn)對(duì)映體區(qū)分的關(guān)鍵。手性拆分劑的種類很多，其中，環(huán)糊精及其衍生物是應(yīng)用最為廣泛的一類手性拆分劑。天然環(huán)糊精及其中性衍生物，雖已成功分離了一些手性化合物，但是其溶解度低和難以拆分中性對(duì)映體等缺點(diǎn)限制了其實(shí)際應(yīng)用。帶電環(huán)糊精衍生物因具有自身電泳淌度而能將中性對(duì)映體分離，同時(shí)因其還能帶相反電荷的分析物產(chǎn)生靜電作用，往往表現(xiàn)出卓越的手性拆分能力。因此，對(duì)環(huán)糊精進(jìn)行衍生化不僅可以提高選擇性，還可以擴(kuò)大手性分離范圍。在目前已經(jīng)合成并使用過的環(huán)糊精衍生物中，磺酸化環(huán)糊精以其優(yōu)異的對(duì)映體拆分能力及普適性而倍受青睞。

磺酸化環(huán)糊精與其它衍生化環(huán)糊精一樣，結(jié)構(gòu)上羥基的取代度和取代位置對(duì)其手性識(shí)別能力影響較大。對(duì)磺酸化環(huán)糊精而言，取代度不同會(huì)造成荷質(zhì)比的不同，進(jìn)而影響其在電泳中的遷移速率，對(duì)手性藥物的分離產(chǎn)生不利的影響，如重現(xiàn)性差、柱效和分離度低等。陳福泰等人(Chen F A,Evangelista R A.Applications of highly sulfated cyclodextrins for enantiomeric separation by capillary electrophoresis.J Chin Chem Soc 46,847-860(1999).)(Chen F A,Shen G,Evangelista R A.Characterization of highly sulfated cyclodextrins.J Chromatogr A 924,523-532(2001).)合成高取代度的磺酸化環(huán)糊精，但是從其取代度測(cè)試中還是可以看出，有一些取代度低的環(huán)糊精分子混在最終產(chǎn)物中。Gyula Vigh團(tuán)隊(duì)(Zhu W,Vigh G.A family of single-Isomer,sulfatedγ-cyclodextrin chiral resolving agents for capillary electrophoresis.1.Octakis(2,3-diacetyl-6-sulfato)-γ-cyclodextrin.Anal Chem 72,310-317(2000).)(Busby M B,Lim P,Vigh G.Synthesis,analytical characterization and use of octakis(2,3-di-O-methyl-6-O-sulfo)-γ-cyclodextrin,a novel,single-isomer,chiral resolving agent in low-pH background electrolytes,Electrophoresis 24,351-362(2003).)在制備單取代環(huán)糊精上做出了巨大的貢獻(xiàn)，但是整個(gè)制備過程包括了羥基的保護(hù)、選擇性衍生化、脫保護(hù)等過程，每一步的中間產(chǎn)物和最終產(chǎn)物都需要經(jīng)過純化過程，耗時(shí)耗力。同時(shí)，帶電環(huán)糊精衍生物在電泳時(shí)會(huì)產(chǎn)生較高的運(yùn)行電流，也不利于電泳分離。環(huán)糊精具有無紫外吸收、易衍生化修飾、較高的手性識(shí)別能力等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于手性拆分領(lǐng)域。環(huán)糊精通過分別與手性藥物對(duì)映體形成可逆的主客體包合復(fù)合物來區(qū)分手性藥物。環(huán)糊精是由D-吡喃葡萄糖單元通過α-1,4-糖苷鍵結(jié)合形成的一類環(huán)狀化合物。整個(gè)環(huán)糊精分子呈中空的截錐形結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)具有一定的孔徑和深度，結(jié)構(gòu)內(nèi)部疏水而外部親水。許多水溶性或不溶的化合物可包合在此錐形內(nèi)部，與環(huán)糊精形成復(fù)合物。目前研究較多的環(huán)糊精有α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精和γ-環(huán)糊精，分別含有6、7、8個(gè)葡萄糖單元分子。環(huán)糊精中最常用的是β-環(huán)糊精，但是其較低的水溶性限制了其廣泛的應(yīng)用。為了改善β-環(huán)糊精及其它環(huán)糊精的水溶性，一種有效的方法就是將環(huán)糊精上的羥基進(jìn)行衍生化。

在環(huán)糊精中，每個(gè)葡萄糖分子上都有3個(gè)自由的羥基，分別位于2、3、6位，其反應(yīng)活性差別較大。以β-環(huán)糊精為例，其結(jié)構(gòu)上的21個(gè)羥基均可被衍生化，常見的衍生化基團(tuán)包括：磺酸化、烷基化、氨基化、羥乙基化、羥丙基化等。這些衍生化的主要目的是：(1)提高環(huán)糊精的溶解性；(2)改變手性藥物與環(huán)糊精空穴的包合程度，增加包合物的穩(wěn)定性；(3)形成不溶于水的環(huán)糊精固定相，以應(yīng)用在色譜中。在這些衍生化環(huán)糊精中，因?yàn)檠苌鶊F(tuán)的不同，環(huán)糊精的性質(zhì)發(fā)生了不同的改變，如二甲基環(huán)糊精在冷水中溶解，但是卻不溶于熱水；如3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯環(huán)糊精等是非常好的高效液相色譜固定相。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供一種合成二元-γ-環(huán)糊精聚合物磺丙基醚-γ-環(huán)糊精聚合物、羧甲基-γ-環(huán)糊精聚合物和磺丙基醚-α,β,γ-環(huán)糊精聚合物和羧甲基-α,β,γ-環(huán)糊精聚合物，并將磺丙基醚-γ-環(huán)糊精聚合物、羧甲基-γ-環(huán)糊精聚合物和磺丙基醚-α,β,γ-環(huán)糊精聚合物和羧甲基-α,β,γ-環(huán)糊精聚合物應(yīng)用于電泳中分離手性藥物的方法。

本發(fā)明的目的是克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，合成了磺丙基醚-γ-環(huán)糊精聚合物、羧甲基-γ-環(huán)糊精聚合物和磺丙基醚-α,β,γ-環(huán)糊精聚合物和羧甲基-α,β,γ-環(huán)糊精聚合物，將不同的衍生化環(huán)糊精聚合在一起，構(gòu)建二元或多元手性拆分劑體系，將這些環(huán)糊精聚合物作為手性拆分劑添加入電泳緩沖液中分離手性藥物，期望獲得更廣泛的分離應(yīng)用。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提出了一種多元環(huán)糊精聚合物的制備方法，所述多元環(huán)糊精聚合物包括二元-γ-環(huán)糊精聚合物磺丙基醚-γ-環(huán)糊精聚合物、羧甲基-γ-環(huán)糊精聚合物或磺丙基醚-α,β,γ-環(huán)糊精聚合物或羧甲基-α,β,γ-環(huán)糊精聚合物，步驟如下：

(1)磺丙基醚-α-環(huán)糊精、磺丙基醚-β-環(huán)糊精和磺丙基醚-γ-環(huán)糊精和的合成：將α-環(huán)糊精加入到質(zhì)量體積濃度為10-30％的氫氧化鈉溶液的燒瓶中，其中，所述α-環(huán)糊精與氫氧化鈉溶液的質(zhì)量體積比為1:2，常溫?cái)嚢枞芙?.5-2h，在攪拌下向燒瓶中加入1,3-丙磺酸內(nèi)酯，其中，α-環(huán)糊精與1,3-丙磺酸內(nèi)酯的質(zhì)量體積比為4:5，加熱至60-90℃反應(yīng)3-7h。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液冷卻至室溫，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至中性，濃縮后加入到甲醇中，沉降出磺丙基醚-α-環(huán)糊精固體；重復(fù)上述過程，并將其中的α-環(huán)糊精替換為β-環(huán)糊精或γ-環(huán)糊精分別得到磺丙基醚-β-環(huán)糊精固體和磺丙基醚-γ-環(huán)糊精固體；

(2)羧甲基-α-環(huán)糊精、羧甲基-β-環(huán)糊精和羧甲基-γ-環(huán)糊精的合成：將α-環(huán)糊精加入到質(zhì)量體積濃度為10-30％氫氧化鈉溶液的燒瓶中，其中，所述α-環(huán)糊精與氫氧化鈉溶液的質(zhì)量體積比為為1:2，常溫?cái)嚢?.5-2h，加熱到60-90℃，攪拌下加入氯乙酸鈉，其中，α-環(huán)糊精與氯乙酸鈉的質(zhì)量比為5:16，反應(yīng)3-7h。反應(yīng)結(jié)束后，溶液冷卻至室溫，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至中性，濃縮后加入到甲醇中，沉降出羧甲基-α-環(huán)糊精固體；重復(fù)上述過程，并將其中的α-環(huán)糊精替換為β-環(huán)糊精或γ-環(huán)糊精分別得到羧甲基-β-環(huán)糊精和羧甲基-γ-環(huán)糊精固體；

(3)二元-γ-環(huán)糊精聚合物的合成：按照0.25-4的比例混合磺丙基醚-γ-環(huán)糊精和羧甲基-γ-環(huán)糊精，加入到質(zhì)量體積濃度為10-30％氫氧化鈉溶液中攪拌0.5-2h。加入環(huán)氧氯丙烷，其中，磺丙基醚-γ-環(huán)糊精和羧甲基-γ-環(huán)糊精的混合物與環(huán)氧氯丙烷的質(zhì)量體積比為10:9，加熱至60-90℃，反應(yīng)3-7h。待反應(yīng)液冷卻至室溫后，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至中性，倒入截留分子量為7000的透析袋中透析0.5-4d，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥，得到二元-γ-環(huán)糊精聚合物。

(4)按照質(zhì)量比為6：7：8的磺丙基醚-α-環(huán)糊精、磺丙基醚-β-環(huán)糊精和磺丙基醚-γ-環(huán)糊精的粉末加入到質(zhì)量體積濃度為10-30％的氫氧化鈉溶液中，常溫?cái)嚢枞芙?.5-2h，加入環(huán)氧氯丙烷，其中，環(huán)氧氯丙烷與粉末的體積質(zhì)量比為5:84，加熱至60-90℃，反應(yīng)3-7h。待反應(yīng)液冷卻至室溫后，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至中性，倒入截留分子量為7000的透析袋中透析0.5-4d，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥，得到磺丙基醚-α,β,γ-環(huán)糊精聚合物；

(5)按照質(zhì)量比為6：7：8的羧甲基-α-環(huán)糊精、羧甲基-β-環(huán)糊精、羧甲基-γ-環(huán)糊精的粉末加入到質(zhì)量體積濃度為10-30％的氫氧化鈉溶液中，常溫?cái)嚢枞芙?.5-2h，加入環(huán)氧氯丙烷，其中，環(huán)氧氯丙烷與粉末的體積質(zhì)量比為63:79，加熱至60-90℃，反應(yīng)3-7h；待反應(yīng)液冷卻至室溫后，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至中性，倒入截留分子量為7000的透析袋中透析0.5-4d，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥，得到羧甲基-α,β,γ-環(huán)糊精聚合物。

將上述制備得到的多元環(huán)糊精聚合物應(yīng)用于CE手性分析中，將所述多元環(huán)糊精聚合物作為手性拆分劑用于電泳，分離手性藥物的方法，步驟如下：

(1)電泳緩沖液的配制：用三羥甲基氨基甲烷和磷酸配制成pH為2.5-6.5的基準(zhǔn)緩沖液，用0.45μm的濾膜過濾，備用。稱取一定量的手性拆分劑加入到緩沖液中，配制成質(zhì)量體積濃度為1％-3％濃度的運(yùn)行緩沖液，備用；

(2)毛細(xì)管預(yù)處理：在使用新的毛細(xì)管之前，要用1mol/L的氫氧化鈉溶液沖洗毛細(xì)管內(nèi)壁60min，再用去離子水沖洗60min，以活化毛細(xì)管內(nèi)壁。每次進(jìn)樣之前，還需用0.1mol/L的氫氧化鈉沖洗3min，去離子水沖洗2min，緩沖液沖洗2min；

(3)電泳分離條件：毛細(xì)管內(nèi)徑為50μm，總長度為37cm，有效長度為30cm，未涂層。進(jìn)樣方式為壓力進(jìn)樣，進(jìn)樣壓力為0.5psi，分離電壓為-11kV，檢測(cè)波長為214nm。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

(1)本發(fā)明將首次制備的二元-γ-環(huán)糊精聚合物磺丙基醚-γ-環(huán)糊精聚合物、羧甲基-γ-環(huán)糊精聚合物和磺丙基醚-α,β,γ-環(huán)糊精聚合物和羧甲基-α,β,γ-環(huán)糊精聚合物作為手性拆分劑添加入電泳緩沖液中分離手性藥物。

(2)本發(fā)明對(duì)多元環(huán)糊精聚合物手性拆分劑的制備和使用有利于在將來工業(yè)生產(chǎn)中經(jīng)過簡單的嘗試確定未知化合物的分離分析方法，為實(shí)際生產(chǎn)節(jié)省時(shí)間和精力，降低成本。

(3)本發(fā)明制備的多元環(huán)糊精聚合物手性拆分劑都是聚合物大分子，同樣可以用透析的方法回收再利用，進(jìn)一步降低了成本。

附圖說明

圖1-1為手性藥物華法林在SPE-α-CD、SPE-β-CD、SPE-γ-CD和SPE-α,β,γ-CDP作用下的電泳分離圖譜。

圖1-2為手性藥物氧氟沙星在SPE-α-CD、SPE-β-CD、SPE-γ-CD和SPE-α,β,γ-CDP作用下的電泳分離圖譜。

圖1-3為手性藥物氨氯地平在SPE-α-CD、SPE-β-CD、SPE-γ-CD和SPE-α,β,γ-CDP作用下的電泳分離圖譜。

圖1-4為手性藥物異丙嗪在SPE-α-CD、SPE-β-CD、SPE-γ-CD和SPE-α,β,γ-CDP作用下的電泳分離圖譜。

圖2-1為手性藥物華法林在CM-α-CD，CM-β-CD，CM-γ-CD和CM-α,β,γ-CDP作用下的電泳分離圖譜。

圖2-2為手性藥物維拉帕米在CM-α-CD，CM-β-CD，CM-γ-CD和CM-α,β,γ-CDP作用下的電泳分離圖譜。

圖2-3為手性藥物普萘洛爾在CM-α-CD，CM-β-CD，CM-γ-CD和CM-α,β,γ-CDP作用下的電泳分離圖譜。

圖2-4為手性藥物氧氟沙在CM-α-CD，CM-β-CD，CM-γ-CD和CM-α,β,γ-CDP作用下的電泳分離圖譜。

圖3-1為緩沖液pH分別為2.5、3.5、4.5、5.5對(duì)手性藥物氨氯地平遷移時(shí)間和分離度的影響。

圖3-2為緩沖液pH分別為2.5、4.5、5.5、6.5對(duì)手性藥物華法林遷移時(shí)間和分離度的影響。

圖4-1不同濃度的SPE-α,β,γ-CDP被作為手性拆分劑分離手性藥物氨氯地平，其分離結(jié)果。

圖4-2不同濃度的SPE-α,β,γ-CDP被作為手性拆分劑分離手性藥物華法林，其分離結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)描述，所描述的具體實(shí)施例僅對(duì)本發(fā)明進(jìn)行解釋說明，并不用以限制本發(fā)明。

本發(fā)明提出的一種多元環(huán)糊精聚合物的制備方法，所述多元環(huán)糊精聚合物包括二元-γ-環(huán)糊精聚合物或磺丙基醚-α,β,γ-環(huán)糊精聚合物(SPE-α,β,γ-CDP)或羧甲基-α,β,γ-環(huán)糊精聚合物(CM-α,β,γ-CDP)。

二元-γ-環(huán)糊精聚合物磺丙基醚-γ-環(huán)糊精聚合物、羧甲基-γ-環(huán)糊精聚合物的制備，步驟如下：

(1)磺丙基醚-γ-環(huán)糊精聚合物的合成：稱取5gγ-環(huán)糊精，緩慢加入到含有10mL質(zhì)量體積濃度為20％氫氧化鈉溶液的燒瓶中，常溫?cái)嚢枞芙?.5h，在劇烈攪拌下向燒瓶中緩慢加入4mL1,3-丙磺酸內(nèi)酯。將燒瓶放置在油浴中加熱至75℃反應(yīng)3h。反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液冷卻至室溫，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至中性，濃縮后加入到大量甲醇中，沉降出磺丙基醚-γ-環(huán)糊精聚合物固體；

(2)羧甲基-γ-環(huán)糊精聚合物的合成：稱取5gγ-CD，緩慢加入到含有30mL質(zhì)量體積濃度30％氫氧化鈉溶液的燒瓶中，常溫?cái)嚢?.5h，放入90℃油浴鍋中，攪拌下加入16g氯乙酸鈉，反應(yīng)3.5h，溶液逐漸變?yōu)闇\黃色。反應(yīng)結(jié)束后，溶液冷卻至室溫，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至中性，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后加入到大量甲醇中，沉降出羧甲基-γ-環(huán)糊精聚合物固體；

(3)二元-γ-環(huán)糊精聚合物磺丙基醚-γ-環(huán)糊精聚合物、羧甲基-γ-環(huán)糊精聚合物的合成：在30mL水中加入9g氫氧化鈉，攪拌溶解降至室溫，按1：4的比混合磺丙基醚-γ-環(huán)糊精聚合物和羧甲基-γ-環(huán)糊精聚合物共15g，加入到氫氧化鈉溶液中攪拌0.5h。加入13.5mL的環(huán)氧氯丙烷，加熱至75℃，反應(yīng)3h。待反應(yīng)液冷卻至室溫后，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至中性，倒入截留分子量為7000的透析袋中透析2d，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥，得到二元-γ-環(huán)糊精聚合物磺丙基醚-γ-環(huán)糊精聚合物、羧甲基-γ-環(huán)糊精聚合物。

磺丙基醚-α,β,γ-環(huán)糊精聚合物的制備，步驟如下：

(1)磺丙基醚-α-環(huán)糊精的合成：稱取10gα-環(huán)糊精，緩慢加入到含有20mL質(zhì)量體積濃度20％氫氧化鈉溶液的圓底燒瓶中，常溫?cái)嚢?.5h，在劇烈攪拌下緩慢加入15.4mL1,3-PS，將圓底燒瓶放入油浴鍋中加熱至75℃反應(yīng)3h。反應(yīng)結(jié)束后，將溶液冷卻至室溫，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至中性，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后倒入到大量甲醇中，沉降出SPE-α-CD固體。抽濾，用甲醇洗，放入60℃鼓風(fēng)干燥中干燥。

(2)磺丙基醚-β-環(huán)糊精和磺丙基醚-γ-環(huán)糊精聚合物的合成：同上述同樣的方法，將其中的α-環(huán)糊精相應(yīng)的換成β-環(huán)糊精或γ-環(huán)糊精，合成磺丙基醚-β-環(huán)糊精和磺丙基醚-γ-環(huán)糊精；

(3)SPE-α,β,γ-CDP的制備：在17mL水中加入5.1g氫氧化鈉，攪拌溶解降至室溫，加入2.4g SPE-α-CD、2.8g SPE-β-CD和3.2g磺丙基醚-γ-環(huán)糊精聚合物粉末，在室溫下攪拌0.5h，加入5mL的ECH，加熱至75℃，反應(yīng)3h。待反應(yīng)液冷卻至室溫后，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至中性，倒入截留分子量為7000的透析袋中透析2d，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥，得到SPE-α,β,γ-CDP固體產(chǎn)品。

羧甲基-α,β,γ-環(huán)糊精聚合物的制備，步驟如下：

(1)羧甲基-α-環(huán)糊精的合成：稱取5gα-CD，緩慢加入到含30mL質(zhì)量體積濃度為30％氫氧化鈉溶液的圓底燒瓶中，攪拌溶解0.5h，稱取16g氯乙酸鈉加入到溶液中，攪拌至全部溶解。將混合溶液加熱至90℃反應(yīng)3.5h。后處理過程與之前類似，將反應(yīng)液冷卻至室溫后，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至中性，倒入大量甲醇中沉淀出羧甲基-α-環(huán)糊精固體。抽濾，用甲醇洗CM-α-CD，放入60℃鼓風(fēng)干燥箱中干燥。

(2)羧甲基-β-環(huán)糊精(CM-β-CD)和羧甲基-γ-環(huán)糊精(羧甲基-γ-環(huán)糊精聚合物)的合成：用上述同樣的方法和試劑，將其中的α-CD相應(yīng)的換成β-CD或γ-CD，合成羧甲基-β-環(huán)糊精和羧甲基-γ-環(huán)糊精；

(3)CM-α,β,γ-CDP的制備：在42mL水中加入12.6g氫氧化鈉，攪拌溶解降至室溫，加入6g CM-α-CD、7g CM-β-CD和8g羧甲基-γ-環(huán)糊精聚合物粉末，在室溫下攪拌0.5h，加入18.9mLECH，加熱至75℃，反應(yīng)3h。待反應(yīng)液冷卻至室溫后，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH至中性，倒入截留分子量為7000的透析袋中透析2d，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥，得到最終產(chǎn)品CM-α,β,γ-CDP聚合物。

多元環(huán)糊精聚合物的表征，包括如下步驟：

(1)顯色劑的配制：稱取100mg四氮唑藍(lán)放入燒杯中，加入50mL 0.1mol/L的氫氧化鈉溶液，超聲30s溶解，攪拌下在60℃水浴中加熱直至溶液黃色透明。稍冷后用0.45μm的濾膜過濾，得到澄清的黃色溶液，備用。稱取28g酒石酸鉀鈉固體，加水溶解，定容至100mL，得到1mol/L的酒石酸鉀鈉溶液，用0.45μm的濾膜過濾，備用。量取等量的兩種溶液混合，放入冰箱中4℃避光保存，備用；

(2)標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：取適量葡萄糖固體烘干至恒重，從中稱取0.1g，加水溶解后定容至100mL，即得1mg/mL葡萄糖水溶液。分別取2mL、4mL、6mL、8mL和10mL葡萄糖水溶液置于100mL容量瓶中，定容，過濾，4℃保存；

(3)樣品溶液的配制：分別稱取0.05g不同種類的多元環(huán)糊精聚合物固體放入100mL的圓底燒瓶中，加入30mL的0.5mol/L硫酸溶液，加熱回流12h。冷卻后調(diào)節(jié)pH至中性，稀釋定容至100mL，得到樣品溶液，過濾，備用；

(4)分別取各樣品溶液500μL加入到試管中，再分別加入4mL顯色劑。將各混合液加熱煮沸3min，冷卻3min，在紫外中掃描其最大吸收波長為670nm，在此波長下測(cè)定樣品溶液的吸光度。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，y＝0.0783x+0.0435，可以計(jì)算出各多元環(huán)糊精聚合物中的環(huán)糊精含量。SPE-α,β,γ-CDP、CM-α,β,γ-CDP、二元-γ-環(huán)糊精聚合物的環(huán)糊精含量分別為68.509、59.630、38.234以及40.948μmol/g。其中Bi-γ-CDP(1)為SPE-γ-CD與CM-γ-CD的質(zhì)量比為1:2，Bi-γ-CDP(2)為SPE-γ-CD與CM-γ-CD的質(zhì)量比為2:1

多元環(huán)糊精聚合物在毛細(xì)管電泳手性分離中的應(yīng)用，包括如下步驟：

(1)電泳緩沖液的配制：用三羥甲基氨基甲烷和磷酸配制不同pH的基準(zhǔn)緩沖液，用0.45μm的濾膜過濾，備用。稱取一定量的手性拆分劑加入到緩沖液中，配制成所需濃度的運(yùn)行緩沖液，備用；

(2)毛細(xì)管預(yù)處理：在使用新的毛細(xì)管之前，要用1mol/L的氫氧化鈉溶液沖洗毛細(xì)管內(nèi)壁60min，再用去離子水沖洗60min，以活化毛細(xì)管內(nèi)壁。每次進(jìn)樣之前，還需用0.1mol/L的氫氧化鈉沖洗3min，去離子水沖洗2min，緩沖液沖洗2min；

(3)電泳分離條件：毛細(xì)管內(nèi)徑為50μm，總長度為37cm，有效長度為30cm，未涂層。進(jìn)樣方式為壓力進(jìn)樣，進(jìn)樣壓力為0.5psi，分離電壓為-11kV，檢測(cè)波長為214nm。

實(shí)施例1

SPE-α,β,γ-CDP在CE手性分離中的應(yīng)用，包括如下步驟：

用三羥甲基氨基甲烷(Tris)和磷酸配制不同pH的基準(zhǔn)緩沖液，用0.45μm的濾膜過濾，備用。稱取一定量的SPE-α,β,γ-CDP加入到緩沖液中，配制成質(zhì)量體積濃度比為2％的運(yùn)行緩沖液，備用。毛細(xì)管經(jīng)活化后，以SPE-α,β,γ-CDP為拆分劑分離華法林、氧氟沙星、氨氯地平和異丙嗪。分離條件：未涂層的毛細(xì)管，有效長度/總長度為30cm/37cm，內(nèi)徑為50μm，檢測(cè)波長為214nm，溫度為37℃，緩沖液為pH 2.5，20mmol/L Tris-H₃PO₄緩沖液，分離電壓為-11kV，手性拆分劑質(zhì)量體積濃度比為2％。(如圖1-1,圖1-2,圖1-3和圖1-4)。

實(shí)施例2

CM-α,β,γ-CDP在CE手性分離中的應(yīng)用，包括如下步驟：

用Tris和磷酸配制不同pH的基準(zhǔn)緩沖液，用0.45μm的濾膜過濾，備用。稱取一定量的CM-α,β,γ-CDP加入到緩沖液中，配制成質(zhì)量體積濃度比為2％的運(yùn)行緩沖液，備用。毛細(xì)管經(jīng)活化后，以CM-α,β,γ-CDP為拆分劑分離華法林、維拉帕米、普萘洛爾和氧氟沙星。分離條件：未涂層的毛細(xì)管，有效長度/總長度為30cm/37cm，內(nèi)徑為50μm，檢測(cè)波長為214nm，溫度為37℃，緩沖液為pH 2.5，20mmol/L Tris-H₃PO₄緩沖液，分離電壓為+11kV，手性拆分劑質(zhì)量體積濃度比為2％(圖2-1,圖2-2,圖2-3和圖2-4)

實(shí)施例3

緩沖液pH對(duì)手性分離的影響,包括如下步驟：

考察了緩沖液pH從2.5增加到6.5時(shí)對(duì)手性藥物分離的影響，以堿性藥物氨氯地平和酸性藥物華法林為例(圖3-1,3-2)。分離條件：緩沖液的pH分別為2.5，3.5，4.5，5.5或6.5。氨氯地平的分離度隨著pH的增加而增加，且手性分離是在-15kV進(jìn)行的，當(dāng)pH增加到6.5的時(shí)候，由于電泳中的電滲流可能已經(jīng)大于了電泳流，造成樣品出峰模式不穩(wěn)定，即有時(shí)候樣品順著電滲流方向出峰，有時(shí)候與電滲流方向相反出峰。華法林的分離度在低pH時(shí)分離度最好，pH3.5的時(shí)候出現(xiàn)出峰模式不穩(wěn)定的情況。當(dāng)緩沖液pH大于4.5時(shí)，華法林是在+15kV下進(jìn)行分離，且分離度逐漸降低。

實(shí)施例4

手性拆分劑濃度對(duì)手性分離的影響,包括如下步驟：

手性拆分劑的最適濃度對(duì)于不同藥物來說也不盡相同。不同濃度的SPE-α,β,γ-CDP被作為手性拆分劑分離手性藥物，其分離結(jié)果(圖4-1，圖4-2)。在分離氨氯地平時(shí)，緩沖液的pH為5.5，當(dāng)SPE-α,β,γ-CDP的質(zhì)量體積濃度從1％增加到3％時(shí)，分離度逐漸增加至2.541，遷移時(shí)間也在逐漸縮短，而當(dāng)SPE-α,β,γ-CDP的濃度進(jìn)一步增加時(shí)，氨氯地平的分離度略微下降。華法林是在pH 2.5的緩沖液中進(jìn)行的分離考察，其最高分離度出現(xiàn)在SPE-α,β,γ-CDP質(zhì)量體積濃度為2％的時(shí)候。

由以上方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果可以看出，本發(fā)明建立的以多元環(huán)糊精聚合物應(yīng)用于電泳中手性藥物的分離方法具有可行性，且結(jié)果較為穩(wěn)定。

通過上述結(jié)合實(shí)驗(yàn)附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了描述，但以上具體實(shí)施案例僅僅是部分實(shí)驗(yàn)，并不是用來限制本發(fā)明的實(shí)施范圍。本領(lǐng)域的相關(guān)技術(shù)人員依據(jù)本發(fā)明或不脫離本發(fā)明宗旨的情況下，所進(jìn)行的等效變形和相關(guān)修飾，這些都在本發(fā)明的保護(hù)之內(nèi)。