本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，特別是涉及一種千金子多糖及低聚糖的制備方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
千金子為大戟科植物續(xù)隨子Euphorbia lathyris L.的干燥成熟種子，具有瀉下逐水，破血消癥的功效，臨床外用療癬蝕疣，還用于二便不通，水腫，痰飲，積滯脹滿，血瘀經(jīng)閉，外治頑癬，贅疣?，F(xiàn)對(duì)其有效成分的研究主要涉及脂肪油、二萜類、揮發(fā)油、香豆素、甾類等成分，對(duì)其中多糖及低聚糖的研究尚未見報(bào)道，尤其是如何解決一體化高效制備千金子多糖及低聚糖也未見有公開報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對(duì)上述情況，為克服現(xiàn)有技術(shù)之缺陷，本發(fā)明的目的就是提供一種千金子多糖及低聚糖的制備方法，可有效解決千金子多糖及低聚糖的制備及千金子多糖在制備增強(qiáng)免疫力的藥物和保健品中的應(yīng)用和千金子低聚糖在制備抗氧化的藥物、保健品及化妝品中的應(yīng)用的問題。
本發(fā)明解決的技術(shù)方案是，一種千金子多糖及低聚糖的制備方法，包括以下步驟：
(1)取千金子藥材，去種皮，所得千金子種皮A備用，種仁61℃機(jī)械壓榨法去油，得千金子霜B；將千金子種皮A和千金子霜B加入千金子藥材重量6.8-7.9倍量的石油醚，靜置4.2h，閃式提取2.2min，室溫條件下超聲提取31min，過濾，得千金子藥渣C，將千金子藥渣C揮發(fā)去石油醚，晾干，加千金子藥材重量7.1-15.6倍的體積濃度為73％-77％的乙醇，浸泡7.3h，35℃-51℃回流提取38min-64min，過濾，得提取液和千金子藥渣D，千金子藥渣D備用，提取液43℃-56℃減壓回收乙醇，59℃減壓濃縮至比重為1.07-1.10的浸膏，依次經(jīng)過硅藻土柱、大孔吸附樹脂柱、活性炭柱、反相硅膠柱，得洗脫液，最后將所得洗脫液減壓濃縮，冷凍干燥即得千金子低聚糖；
(2)在步驟(1)中的千金子藥渣D中加入千金子藥材重量7-12倍量的水，86℃超聲提取67min，過濾，得第一濾液和千金子藥渣E；在千金子藥渣E中加入千金子藥材重量5-9倍量的水，83℃超聲提取56min，過濾，得第二濾液，合并第一濾液和第二濾液，減壓濃縮至比重為1.06-1.15的浸膏，用硅藻土過濾，濾液依次用sevage法脫蛋白，過氧化氫法脫色，得千金子多糖溶液，千金子多糖溶液依次通過纖維素層析柱、凝膠柱，得洗脫流份千金子多糖I和千金子多糖Ⅱ，冷凍干燥，即得千金子多糖I和千金子多糖Ⅱ；實(shí)現(xiàn)以本發(fā)明制備的千金子多糖I和千金子多糖Ⅱ在制備增強(qiáng)免疫力的藥物和保健品中的應(yīng)用，千金子低聚糖在制備抗氧化的藥物、保健品及化妝品中的應(yīng)用。
所述的大孔吸附樹脂為HPD-600型大孔吸附樹脂或SP-825型大孔吸附樹脂，反相硅膠為十八烷基硅烷鍵合硅膠或辛烷基硅烷鍵合硅膠，纖維素為DEAE-52纖維素，凝膠為Sephacry1 S-200凝膠。
本發(fā)明制備方法簡(jiǎn)單，易操作，原料豐富，產(chǎn)品應(yīng)用廣泛，以千金子為原料同時(shí)制備千金子多糖I、千金子多糖Ⅱ及低聚糖，開發(fā)了千金子藥材的應(yīng)用范圍，千金子多糖I和千金子多糖Ⅱ可用于制備增強(qiáng)免疫力的藥物和保健品，千金子低聚糖可用于制備抗氧化的藥物、保健品及化妝品，開拓了千金子多糖及低聚糖的應(yīng)用價(jià)值，具有良好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益，是中藥上的巨大創(chuàng)新。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的具體情況作詳細(xì)說明。
本發(fā)明在具體實(shí)施中，可由以下實(shí)施例給出：
實(shí)施例1
本發(fā)明在具體實(shí)施中，包括以下步驟：
(1)取千金子藥材，去種皮，所得千金子種皮A備用，種仁61℃機(jī)械壓榨法去油，得千金子霜B；將千金子種皮A和千金子霜B加入千金子藥材重量7.9倍量的石油醚，靜置4.2h，閃式提取2.2min，室溫條件下超聲提取31min，過濾，得千金子藥渣C，將千金子藥渣C揮發(fā)去石油醚，晾干，加千金子藥材重量15.6倍的體積濃度為77％的乙醇，浸泡7.3h，51℃回流提取64min，過濾，得提取液和千金子藥渣D，千金子藥渣D備用，提取液56℃減壓回收乙醇，59℃減壓濃縮至比重為1.10的浸膏，依次經(jīng)過硅藻土柱、HPD-600型大孔吸附樹脂柱、活性炭柱、十八烷基硅烷鍵合硅膠柱，得洗脫液，最后將所得洗脫液減壓濃縮，冷凍干燥即得千金子低聚糖；
(2)在步驟(1)中的千金子藥渣D中加入千金子藥材重量12倍量的水，86℃超聲提取67min，過濾，得第一濾液和千金子藥渣E；在千金子藥渣E中加入千金子藥材重量9倍量的水，83℃超聲提取56min，過濾，得第二濾液，合并第一濾液和第二濾液，減壓濃縮至比重為1.15的浸膏，用硅藻土過濾，濾液依次用sevage法脫蛋白，過氧化氫法脫色，得千金子多糖溶液，千金子多糖溶液依次通過DEAE-52纖維素層析柱、Sephacry1 S-200凝膠柱，得洗脫流份千金子多糖I和千金子多糖Ⅱ，冷凍干燥，即得千金子多糖I和千金子多糖Ⅱ。
實(shí)施例2
本發(fā)明在具體實(shí)施中，包括以下步驟：
(1)取千金子藥材，去種皮，所得千金子種皮A備用，種仁61℃機(jī)械壓榨法去油，得千金子霜B；將千金子種皮A和千金子霜B加入千金子藥材重量6.8倍量的石油醚，靜置4.2h，閃式提取2.2min，室溫條件下超聲提取31min，過濾，得千金子藥渣C，將千金子藥渣C揮發(fā)去石油醚，晾干，加千金子藥材重量7.1倍的體積濃度為73％的乙醇，浸泡7.3h，35℃回流提取38min，過濾，得提取液和千金子藥渣D，千金子藥渣D備用，提取液43℃減壓回收乙醇，59℃減壓濃縮至比重為1.07的浸膏，依次經(jīng)過硅藻土柱、SP-825型大孔吸附樹脂柱、活性炭柱、辛烷基硅烷鍵合硅膠柱，得洗脫液，最后將所得洗脫液減壓濃縮，冷凍干燥即得千金子低聚糖；
(2)在步驟(1)中的千金子藥渣D中加入千金子藥材重量7倍量的水，86℃超聲提取67min，過濾，得第一濾液和千金子藥渣E；在千金子藥渣E中加入千金子藥材重量5倍量的水，83℃超聲提取56min，過濾，得第二濾液，合并第一濾液和第二濾液，減壓濃縮至比重為1.06的浸膏，用硅藻土過濾，濾液依次用sevage法脫蛋白，過氧化氫法脫色，得千金子多糖溶液，千金子多糖溶液依次通過DEAE-52纖維素層析柱、Sephacry1 S-200凝膠柱，得洗脫流份千金子多糖I和千金子多糖Ⅱ，冷凍干燥，即得千金子多糖I和千金子多糖Ⅱ。
實(shí)施例3
本發(fā)明在具體實(shí)施中，包括以下步驟：
(1)取千金子藥材，去種皮，所得千金子種皮A備用，種仁61℃機(jī)械壓榨法去油，得千金子霜B；將千金子種皮A和千金子霜B加入千金子藥材重量7.3倍量的石油醚，靜置4.2h，閃式提取2.2min，室溫條件下超聲提取31min，過濾，得千金子藥渣C，將千金子藥渣C揮發(fā)去石油醚，晾干，加千金子藥材重量12.4倍的體積濃度為75％的乙醇，浸泡7.3h，43℃回流提取51min，過濾，得提取液和千金子藥渣D，千金子藥渣D備用，提取液50℃減壓回收乙醇，59℃減壓濃縮至比重為1.09的浸膏，依次經(jīng)過硅藻土柱、SP-825型大孔吸附樹脂柱、活性炭柱、反相硅膠為十八烷基硅烷鍵合硅膠柱，得洗脫液，最后將所得洗脫液減壓濃縮，冷凍干燥即得千金子低聚糖；
(2)在步驟(1)中的千金子藥渣D中加入千金子藥材重量10倍量的水，86℃超聲提取67min，過濾，得第一濾液和千金子藥渣E；在千金子藥渣E中加入千金子藥材重量7倍量的水，83℃超聲提取56min，過濾，得第二濾液，合并第一濾液和第二濾液，減壓濃縮至比重為1.11的浸膏，用硅藻土過濾，濾液依次用sevage法脫蛋白，過氧化氫法脫色，得千金子多糖溶液，千金子多糖溶液依次通過DEAE-52纖維素層析柱、Sephacry1 S-200凝膠柱，得洗脫流份千金子多糖I和千金子多糖Ⅱ，冷凍干燥，即得千金子多糖I和千金子多糖Ⅱ。
實(shí)施例4
本發(fā)明在具體實(shí)施中，包括以下步驟：
(1)取千金子藥材，去種皮，所得千金子種皮A備用，種仁61℃機(jī)械壓榨法去油，得千金子霜B；將千金子種皮A和千金子霜B加入千金子藥材重量6.8倍量的石油醚，靜置4.2h，閃式提取2.2min，室溫條件下超聲提取31min，過濾，得千金子藥渣C，將千金子藥渣C揮發(fā)去石油醚，晾干，加千金子藥材重量15.6倍的體積濃度為75％的乙醇，浸泡7.3h，35℃回流提取51min，過濾，得提取液和千金子藥渣D，千金子藥渣D備用，提取液56℃減壓回收乙醇，59℃減壓濃縮至比重為1.09的浸膏，依次經(jīng)過硅藻土柱、HPD-600型大孔吸附樹脂柱、活性炭柱、辛烷基硅烷鍵合硅膠，得洗脫液，最后將所得洗脫液減壓濃縮，冷凍干燥即得千金子低聚糖；
(2)在步驟(1)中的千金子藥渣D中加入千金子藥材重量7倍量的水，86℃超聲提取67min，過濾，得第一濾液和千金子藥渣E；在千金子藥渣E中加入千金子藥材重量5倍量的水，83℃超聲提取56min，過濾，得第二濾液，合并第一濾液和第二濾液，減壓濃縮至比重為1.15的浸膏，用硅藻土過濾，濾液依次用sevage法脫蛋白，過氧化氫法脫色，得千金子多糖溶液，千金子多糖溶液依次通過DEAE-52纖維素層析柱、Sephacry1 S-200凝膠柱，得洗脫流份千金子多糖I和千金子多糖Ⅱ，冷凍干燥，即得千金子多糖I和千金子多糖Ⅱ。
上述制備的千金子低聚糖、千金子多糖I和千金子多糖Ⅱ經(jīng)蒽酮-硫酸法(常規(guī)測(cè)定方法，是公知技術(shù))測(cè)定，其糖含量均不低于83％。經(jīng)HPGPC法(公知技術(shù))測(cè)定，千金子低聚糖分子量均在300-2000之間。
上述僅是給出的幾個(gè)實(shí)施例，在研制中，發(fā)明人經(jīng)反復(fù)多次實(shí)驗(yàn)，均取得了相同或相近似的結(jié)果，方法科學(xué)有效，具有較好的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
千金子多糖的免疫活性實(shí)驗(yàn)
一.試驗(yàn)材料
1.試驗(yàn)動(dòng)物：18.5～22.5g昆明種清潔劑小鼠，雌雄各半。由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
2.實(shí)驗(yàn)試藥：本發(fā)明方法制備的千金子多糖I和千金子多糖Ⅱ多糖含量分別為89.14％、85.47％，瑞士染液，香菇多糖(湖北廣仁藥業(yè)有限公司)，環(huán)磷酰胺(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)等。
二.試驗(yàn)方法
1.千金子多糖對(duì)正常小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響
取小鼠80只，體重18.5～22.5g，雌雄各半，隨機(jī)均勻分為8組。分別灌服小、中、大劑量的千金子多糖I和千金子多糖Ⅱ水溶液(10mg/ml，20mg/ml，40mg/ml；0.2ml/10g)，香菇多糖混懸液(5mg/ml；0.2ml/10g)及同體積的生理鹽水(0.2ml/10g)。每天給藥1次，連續(xù)給藥7天。于第7天早上各組小鼠均腹腔注射5％雞紅細(xì)胞生理鹽水混懸液0.5ml。于第7天灌胃給藥后2h，注射5％雞紅細(xì)胞4h后，脫頸椎處死小鼠，腹腔注入漢氏液2.5ml，輕揉小鼠腹部；然后剪開小鼠腹部皮膚，在腹膜上剪一小孔，用吸管吸取腹腔液2ml置于試管中，混勻；吸取少許腹腔液滴于載玻片上，液點(diǎn)大小約為1.5cm×2cm。將載玻片放在鋪有濕紗布的糖瓷盤中，37℃孵育30min，生理鹽水沖去附著的細(xì)胞，瑞氏染液染色，自來(lái)水沖洗晾干；顯微鏡下觀察小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬情況，并計(jì)算吞噬百分率和吞噬指數(shù)。
表1 腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能結(jié)果
**表示與空白組比P＜0.01，*表示與空白組比P＜0.05；I組表示千金子多糖I組，Ⅱ組表示千金子多糖Ⅱ組
從表1可以看出，與空白對(duì)照組比，中劑量I組、大劑量I組、中劑量Ⅱ組、大劑量Ⅱ組均可極顯著提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞對(duì)雞紅細(xì)胞的吞噬百分率(P＜0.01)和腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬指數(shù)(P＜0.01)；小劑量I組、小劑量Ⅱ組及香菇多糖組均能顯著提高吞噬百分率及吞噬指數(shù)(P＜0.05)，其中尤以中劑量Ⅱ組作用為最強(qiáng)。
2.千金子多糖對(duì)正常小鼠溶血素形成的影響
取小鼠80只，體重18.5～22.5g，雌雄各半，隨機(jī)均勻分為8組。分別灌服小、中、大劑量的千金子多糖I和千金子多糖Ⅱ水溶液(10mg/ml，20mg/ml，40mg/ml；0.2ml/10g)，香菇多糖混懸液(5mg/ml；0.2ml/10g)及同體積的生理鹽水(0.2ml/10g)。每天給藥1次，連續(xù)給藥7天。同時(shí)，給藥第1天各組小鼠均腹腔注射5％雞紅細(xì)胞生理鹽水混懸液0.2ml/只，進(jìn)行免疫，于最后1次給藥后2h，小鼠眼眶取血，離心，分離血清。用生理鹽水1∶100稀釋后，取1ml稀釋液與5％雞紅細(xì)胞混懸液0.5ml、10％補(bǔ)體0.5ml(豚鼠血清，用雞紅細(xì)胞預(yù)先飽和6h)混勻，37℃孵育30min，冰水中終止反應(yīng)。另設(shè)不加補(bǔ)體的空白管作對(duì)照，吸取各管上清液于UV-T1901型分光光度計(jì)540nm處比色，測(cè)定各組溶血素形成情況。
3.千金子多糖對(duì)正常小鼠溶血空斑形成的影響
取小鼠80只，體重18.5～22.5g，雌雄各半，隨機(jī)均勻分為8組。分別灌服小、中、大劑量的千金子多糖I和千金子多糖Ⅱ水溶液(10mg/ml，20mg/ml，40mg/ml；0.2ml/10g)，香菇多糖混懸液(5mg/ml；0.2ml/10g)及同體積的生理鹽水(0.2ml/10g)。每天給藥1次，連續(xù)給藥7天。同時(shí)，給藥第1天各組小鼠均腹腔注射5％雞紅細(xì)胞生理鹽水混懸液0.2ml/只，進(jìn)行免疫，于最后1次給藥后2h，脫頸椎處死并解剖小鼠，取出脾臟，同組兩個(gè)小鼠脾臟為一例；勻漿，并調(diào)整脾細(xì)胞混懸液中脾細(xì)胞數(shù)為5×106個(gè)/ml。取脾細(xì)胞混懸液1.0ml，與0.2％雞紅細(xì)胞混懸液0.5ml和1∶10的豚鼠血清0.5ml混勻。另設(shè)不加補(bǔ)體的空白管，37℃孵育1h，離心，取上清液于UV-T1901型分光光度計(jì)413nm處比色，測(cè)各組溶血空斑形成情況。
表2 溶血素、溶血空斑形成結(jié)果
**表示與空白組比P＜0.01，*表示與空白組比P＜0.05；I組表示千金子多糖I組，Ⅱ組表示千金子多糖Ⅱ組
從表2可以看出，與空白對(duì)照組比，小劑量I組、大劑量I組、小劑量Ⅱ組、大劑量Ⅱ組溶血空斑均有顯著升高(P＜0.05)，中劑量I組、中劑量Ⅱ組和香菇多糖組溶血素和溶血空斑均顯著提高(P＜0.01)。其中尤以中劑量Ⅱ組作用為最優(yōu)。
4.千金子多糖對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響
取小鼠90只，體重18.5～22.5g，雌雄各半，隨機(jī)均勻分為9組。除空白對(duì)照組外，其余各組均建立環(huán)磷酰胺致免疫抑制模型共8組(劑量為8mg/ml；第1、2、3天連續(xù)腹腔注射)，模型組建立完成后，分別灌服小、中、大劑量的千金子多糖I和千金子多糖Ⅱ水溶液(5mg/ml，10mg/ml，20mg/ml；0.2ml/10g)，香菇多糖混懸液(5mg/ml，0.2ml/10g)及同體積的生理鹽水(0.2ml/10g)。每天給藥1次，連續(xù)給藥7天。于給藥最后一天早上各組小鼠均腹腔注射5％雞紅細(xì)胞生理鹽水混懸液0.5ml，灌胃給藥后2h，給雞紅細(xì)胞后4h，脫頸椎處死小鼠。腹腔注入漢氏液2.5ml，輕揉小鼠腹部，然后剪開小鼠腹部皮膚，在腹膜上剪一小孔，用移液槍吸取腹腔液2ml置于試管中，混勻；吸取少許腹腔液滴于載玻片上，液點(diǎn)大小約為1.5cm×2cm。將載玻片放在鋪有濕紗布的糖瓷盤中，37℃孵育30min，生理鹽水沖去附著的細(xì)胞，瑞氏染液染色，自來(lái)水沖洗晾干，顯微鏡下觀察小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬情況，并計(jì)算吞噬百分率和吞噬指數(shù)。
表3 腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能結(jié)果
**表示與模型組比P＜0.01；I組表示千金子多糖I組，Ⅱ組表示千金子多糖Ⅱ組
從表3可以看出，與空白組相比，模型組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞對(duì)雞紅細(xì)胞的吞噬指數(shù)和吞噬百分率顯著降低(P＜0.01)，說明造模成功。與模型組相比，大、中、小劑量千金子多糖I組及Ⅱ組和香菇多糖組可顯著提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞對(duì)雞紅細(xì)胞的吞噬指數(shù)和吞噬百分率(P＜0.01)。
5.千金子多糖對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠溶血素形成的影響
取小鼠90只，體重18.5～22.5g，雌雄各半，隨機(jī)均勻分為9組。除空白對(duì)照組外，其余各組均建立環(huán)磷酰胺致免疫抑制模型共8組(劑量為8mg/ml；第1、2、3天連續(xù)腹腔注射)；模型組建立完成后，各組小鼠(含空白組)均腹腔注射5％雞紅細(xì)胞生理鹽水混懸液0.2ml/只，進(jìn)行免疫；并開始分別灌服小、中、大劑量的千金子多糖I和千金子多糖Ⅱ水溶液(5mg/ml，10mg/ml，20mg/ml；0.2ml/10g)、香菇多糖混懸液(5mg/ml，0.2ml/10g)及同體積的生理鹽水(0.2ml/10g)，每天給藥1次，連續(xù)給藥7天。最后1次給藥后2h，小鼠眼眶取血，離心，分離血清；以生理鹽水1∶100稀釋后，取1ml稀釋液與5％雞紅細(xì)胞混懸液0.5ml、10％補(bǔ)體0.5ml(豚鼠血清，用雞紅細(xì)胞預(yù)先飽和6h)混勻；37℃孵育30min，冰水中終止反應(yīng)，另設(shè)不加補(bǔ)體的空白管作對(duì)照；吸取各管上清液于UV-T1901型分光光度計(jì)540nm處比色，測(cè)定各組溶血素形成情況，結(jié)果見表4。
6.千金子多糖對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠溶血空斑形成的影響
取小鼠90只，體重18.5～22.5g，雌雄各半，隨機(jī)均勻分為9組。除空白對(duì)照組外，其余各組均建立環(huán)磷酰胺致免疫抑制模型共8組(劑量為8mg/ml；第1、2、3天連續(xù)腹腔注射)；模型組建立完成后，各組小鼠(含空白組)均腹腔注射5％雞紅細(xì)胞生理鹽水混懸液0.2ml/只，進(jìn)行免疫；并開始分別灌服小、中、大劑量的千金子多糖I和千金子多糖Ⅱ水溶液(5mg/ml，10mg/ml，20mg/ml；0.2ml/10g)、香菇多糖混懸液(5mg/ml，0.2ml/10g)及同體積的生理鹽水(0.2ml/10g)，每天給藥1次，連續(xù)給藥7天。于最后1次給藥后2h，脫頸椎處死并解剖小鼠，取出脾臟，同組中兩個(gè)小鼠脾臟為一例，勻漿，并調(diào)整脾細(xì)胞混懸液中脾細(xì)胞數(shù)為5×106個(gè)/ml。取脾細(xì)胞混懸液1.0ml，與0.2％雞紅細(xì)胞混懸液0.5ml和1∶10的豚鼠血清0.5ml混勻。另設(shè)不加補(bǔ)體的空白管，37℃孵育1h，離心，取上清液于UV-T1901型分光光度計(jì)413nm處比色，測(cè)各組溶血空斑形成情況，結(jié)果見表4。
表4 溶血素、溶血空斑形成結(jié)果
**表示與模型組比P＜0.01
從上表可看出，與空白對(duì)照組比，模型組溶血素和溶血空斑均顯著降低(P＜0.01)，說明造免疫抑制模型成功。與模型組比，各個(gè)劑量千金子多糖I組、Ⅱ組及香菇多糖組均可顯著促進(jìn)小鼠溶血素和溶血空斑的形成(P＜0.01)。其中，尤以中劑量Ⅱ組千金子多糖組為佳。
千金子低聚糖抗氧化活性實(shí)驗(yàn)
一、實(shí)驗(yàn)材料
1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用40只普通級(jí)昆明種小鼠，鼠齡2個(gè)月，體重(20±2)g，雌雄各半。由鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(合格證號(hào)：SCXK(豫)2005-0001；使用許可證號(hào)：SCXK(豫)2005-0012)。
2.實(shí)驗(yàn)試藥 丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒，生化試劑，南京建成生物工程研究所；超氧化物岐化酶(SOD)測(cè)試盒，南京建成生物工程研究所；谷胱甘肽酶(GSH-PX)測(cè)試盒，南京建成生物工程研究所；本發(fā)明制備的千金子低聚糖含量為89.92％。
二、實(shí)驗(yàn)方法
1.動(dòng)物的喂養(yǎng)與取樣 取體重(20±2)g的昆明種小鼠40只,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,隨機(jī)分成4組，每組10只。分別為空白組、千金子低聚糖低劑量組(100mg/kg)、千金子低聚糖中劑量組(200mg/kg)、千金子低聚糖高劑量組(400mg/kg)，連續(xù)15天口服給藥(空白對(duì)照組給等量純凈水)，每天小鼠給藥體積為0.2mL/10g。末次給藥后24h，處死動(dòng)物，分別取小鼠血清及制備10％肝組織勻漿，待測(cè)。
制備10％小鼠肝組織勻漿：取肝組織在冰冷的生理鹽水中漂洗，除去血液，稱0.5g，放入5mL-10mL的小燒杯內(nèi)，取總量(總量為4.5mL)2/3的生理鹽水于燒杯中，用眼科剪盡快剪碎組織塊，將剪碎的組織倒入勻漿管中，用剩余1/3的生理鹽水用來(lái)沖洗殘留在燒杯中的碎組織塊，一起倒入勻漿管中，進(jìn)行勻漿，使組織勻漿化，將勻漿液離心(3000r/min，10min)，取適量上清液進(jìn)行以下測(cè)定。
血清制備：摘眼球取出血樣，37℃水浴30min加速血液凝固。血液凝固后用竹簽沿試管四周輕輕剝離血塊使血清盡快自行析出，然后2500r/min離心10min，用吸管吸出上層血清備用。
2.檢測(cè)方法 蛋白質(zhì)含量測(cè)定：采用考馬斯亮蘭法。蛋白質(zhì)分子具有-NH3+基團(tuán)，當(dāng)棕紅色的考馬斯亮蘭顯色劑加入蛋白標(biāo)準(zhǔn)液或樣品中時(shí)，考馬斯亮蘭染料上的陰離子與蛋白-NH3+基團(tuán)結(jié)合，致使溶液變藍(lán)，通過測(cè)定吸收度可計(jì)算出樣品中蛋白質(zhì)的含量；SOD測(cè)定：采用黃嘌呤氧化酶法。血清中SOD活力以每毫升反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50％時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量為一個(gè)亞硝酸鹽單位(NU)，即U/mL；組織中SOD活力以每毫克組織蛋白在1mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50％時(shí)所對(duì)應(yīng)的SOD量為一個(gè)亞硝酸鹽，即U/mgprot；GSH-Px測(cè)定：采用二硫?qū)ο趸郊姿岱y(cè)定，具體操作詳見試劑和說明書，血清單位為U/mL，組織單位為U/mgprot；MDA測(cè)定：采用硫代巴比妥酸法(TBA)測(cè)定，過氧化脂質(zhì)降解產(chǎn)物中MDA可與TBA縮合，形成的紅色產(chǎn)物在523nm處有最大吸收峰，因底物為TBA，所以此法稱TBA法。血清單位為nmol/mL，組織單位為nmol/mgprot。
表5 千金子低聚糖對(duì)小鼠肝組織中SOD、GSH-Px、MDA的影響
*表示與空白組相比P＜0.05，**表示與空白組比P＜0.01
從表5可以看出，與空白組比較，大劑量組小鼠肝組織中SOD和GSH-Px活性提高極顯著(P＜0.01)，MDA水平降低極顯著(P＜0.01)；中劑量組小鼠肝組織中SOD和GSH-Px活性顯著增高(P＜0.05)，MDA水平降低極顯著(P＜0.01)；小劑量組肝組織中SOD活性顯著提高(P＜0.05)，MDA水平降低極顯著(P＜0.01)，但GSH-Px活性與空白組差異不顯著(P＞0.05)。
表6 千金子低聚糖對(duì)小鼠血清中SOD、GSH-Px的影響
**表示與空白組比P＜0.01
從表6可見，與空白組相比，大、中劑量組的小鼠血清中SOD和GSH-Px活性極顯著提高(P＜0.01)，小劑量組小鼠血清中SOD和GSH-Px活性差異無(wú)顯著性(P＞0.05)。
從上述資料可以看出，本發(fā)明提取的千金子多糖I和千金子多糖Ⅱ均具有很好的增強(qiáng)機(jī)體免疫力的作用，完全具備開發(fā)為增強(qiáng)免疫力的藥物和保健品的潛力及實(shí)際推廣應(yīng)用價(jià)值；千金子低聚糖具有良好的抗氧化能力，可作為抗氧化類藥物、保健品及化妝品開發(fā)。本發(fā)明對(duì)千金子藥材多糖及低聚糖的開發(fā)不僅拓展了中藥千金子應(yīng)用的新前景，而且是中醫(yī)藥上的創(chuàng)新，具有較高的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值和巨大的經(jīng)濟(jì)社會(huì)效益。