本發(fā)明屬于花椒的精深加工與利用領(lǐng)域，具體涉及一種從花椒油樹脂中提取制備高純度花椒麻味物質(zhì)的方法。

背景技術(shù)：

花椒作為我國重要的藥食兩用材料，已具有兩千多年的歷史，其以獨(dú)特的辛麻味，廣泛用于川菜及火鍋等烹調(diào)中，被譽(yù)為“八大調(diào)味品”之一。花椒麻味物質(zhì)是一類以山椒素及其同系物為代表的不飽和脂肪酸酰胺類物質(zhì)，具有強(qiáng)烈的刺激性，是花椒產(chǎn)生麻味的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是衡量花椒品質(zhì)的重要指標(biāo)之一。此外，花椒麻味物質(zhì)還具有麻醉、鎮(zhèn)痛、抗癌、抗自由基、降低血清膽固醇等生理活性，因此具有廣闊市場前景。

但是，由于花椒麻味物質(zhì)成分復(fù)雜，且其具有的不飽和雙鍵結(jié)構(gòu)極不穩(wěn)定，暴露于空氣中幾分鐘內(nèi)即氧化成黃色粘稠狀物質(zhì)，成為了制約大規(guī)模制備高純度花椒麻味物質(zhì)的技術(shù)瓶頸。因此未見有市售的花椒麻味物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，給花椒及其制品中麻味物質(zhì)的定量評價(jià)帶來了一定困難，同時(shí)也限制了其在保健食品級(jí)醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用。

花椒麻味物質(zhì)提取制備的方法較多，主要有水提法、柱層析法、超臨界二氧化碳法、分子印跡技術(shù)等，但他們在工業(yè)應(yīng)用中均存在一定的局限性。例如CN1305742A提供了一種采用高溫高壓水煮發(fā)提取制備花椒麻味物質(zhì)的方法，但該法所提取得到山椒素等麻味物質(zhì)，還含有茵芋堿、青椒堿等生物堿類雜質(zhì)，純度低，無法作為花椒麻味物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品。CN102690208A提供了一種從花椒油中提取羥基山椒素的方法，該法獲得的花椒麻味物質(zhì)雖純度高，但其對設(shè)備要求高、規(guī)模小，僅限于實(shí)驗(yàn)性研究，難以實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。CN1488289A公布了一種采用超臨界二氧化碳技術(shù)分離純化花椒麻味物質(zhì)的方法，該法對設(shè)備要求高，且操作繁瑣，所獲得的花椒麻味物質(zhì)仍然無法作為標(biāo)準(zhǔn)品。

采用硅膠吸附結(jié)合溶劑提取法分離純化花椒麻味物質(zhì)，與文獻(xiàn)報(bào)道及公開的專利相比，直接采用硅膠吸附樣品后，并根據(jù)花椒麻味物質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)，采用不同極性的溶劑進(jìn)行洗脫、除雜，避免了傳統(tǒng)方法的成本高、規(guī)模小、分離時(shí)間長等限制。此種方法提取制備花椒麻味物質(zhì)具有操作簡便，無需專門的設(shè)備、上樣量不受限制，且純度高，非常適合工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一種大規(guī)模高純度花椒麻味物質(zhì)的制備方法，用于解決現(xiàn)有技術(shù)中的問題。所述大規(guī)模高純度花椒麻味物質(zhì)的制備方法以花椒油樹脂為原料，采用硅膠吸附后，再依次加入無水乙醚去雜、甲醇洗脫、石油醚純化，冷凍結(jié)晶、氮?dú)飧稍?，獲得高純度花椒麻味物質(zhì)，可為花椒麻味物質(zhì)生理功效評價(jià)及品質(zhì)評價(jià)提供標(biāo)準(zhǔn)品，并可適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

為實(shí)現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明提供一種高純度花椒麻味物質(zhì)的制備方法，包括如下步驟：

1)以花椒油樹脂為原料，加入硅膠，充分?jǐn)嚢?，混合均勻?/p>

本發(fā)明中的花椒油樹脂可使用各種市售的花椒油樹脂，一般是采用萃取法從花椒屬植物(拉丁名：Zanthoxylum L.)果實(shí)中提取的含有全部風(fēng)味特征的油狀制品。

優(yōu)選的，所述步驟1中，花椒油樹脂中花椒麻味物質(zhì)的含量為20～30wt％。

花椒麻味物質(zhì)是花椒屬植物中呈現(xiàn)麻味的所有物質(zhì)的總稱，主要是由一類不飽和脂肪族酰胺組成，是花椒屬植物呈現(xiàn)麻味的物質(zhì)基礎(chǔ)，其含量的檢測方法可參照DB50/T321-2009。

優(yōu)選的，所述步驟1中，硅膠為薄層層析用硅膠。

本發(fā)明中的薄層層析用硅膠可使用市售的薄層層析用硅膠。薄層層析用硅膠一般是白色粒狀粗孔硅膠，不溶于水和有機(jī)溶劑，在空氣中吸潮，現(xiàn)有技術(shù)中一般是將粗孔硅膠粉碎至40～200目，經(jīng)篩選，鹽酸浸泡，水洗，烘干(含水量≤5％)制得。

優(yōu)選的，所述步驟1中，花椒油樹脂與硅膠的質(zhì)量之比為1：1～3。

優(yōu)選的，所述步驟1中，所述硅膠為經(jīng)活化的硅膠，活化硅膠的具體方法為：100～120℃活化0.5～1.5h。

2)在步驟1所得混合物中加入乙醚提取，然后固液分離；

優(yōu)選的，所述步驟2中，乙醚為無水乙醚。

優(yōu)選的，所述步驟2中，乙醚與步驟1所得混合物的比例為每4～8ml乙醚對應(yīng)1g混合物。

優(yōu)選的，所述步驟2中，提取的具體條件為：密閉環(huán)境靜置1.5～2.5h，靜置過程中間歇攪拌，在本發(fā)明一實(shí)施例中，每隔20～40min攪拌一次。

優(yōu)選的，所述步驟2中，固液分離后固相物進(jìn)一步干燥除去殘留的乙醚。

本領(lǐng)域技術(shù)人員可選擇合適的條件對所得固相物進(jìn)行干燥以除去殘留的乙醚，在本發(fā)明一實(shí)施例中，將固相物置于通風(fēng)處以揮干殘留的乙醚。

3)將步驟2分離所得固相物中加入甲醇浸提，然后固液分離，所得液相物脫溶，獲得花椒麻味物質(zhì)粗提物；

優(yōu)選的，所述步驟3中，甲醇與固相物的比例為每2～6ml甲醇對應(yīng)1g固相物。

優(yōu)選的，所述步驟3中，浸提的具體條件為：浸提溫度為45～55℃，浸提時(shí)間為6～12h。

本領(lǐng)域技術(shù)人員可選擇合適的方法和條件對步驟3中的液相物脫溶，在本發(fā)明一實(shí)施例中，使用真空條件下蒸發(fā)回收溶劑(減壓蒸餾)的方式進(jìn)行脫溶，具體條件為：溫度：40～50℃；真空度：0.03～0.08MPa。脫溶過程中回收的溶劑可循環(huán)再使用。

4)在步驟3所得粗提物中加入石油醚浸提，回流浸提20～40min，然后固液分離，所得固相物再加入一定量石油醚繼續(xù)回流浸提12～18h，然后固液分離；

所述步驟4中，在步驟3所得粗提物中加入石油醚浸提，回流浸提0.5h左右的目的是去除生物堿、多酚等雜質(zhì)。

優(yōu)選的，所述步驟4中，石油醚為30～60℃沸程的石油醚。

優(yōu)選的，所述步驟4中，在步驟3所得粗提物中加入石油醚浸提時(shí)，石油醚與固相物的比例為每1～3ml石油醚對應(yīng)1g固相物。

優(yōu)選的，所述步驟4中，所得固相物再加入一定量石油醚繼續(xù)回流浸提時(shí)，石油醚與固相物的比例為每1～3ml石油醚對應(yīng)1g固相物。

5)將步驟4所得液相物置于低溫環(huán)境冷凍結(jié)晶，分離出結(jié)晶物并干燥即得所述花椒麻味物質(zhì)。

優(yōu)選的，所述低溫環(huán)境冷凍結(jié)晶時(shí)的溫度為-80℃～-18℃。

本領(lǐng)域技術(shù)人員可選擇合適的條件對所得結(jié)晶物進(jìn)行干燥，在本發(fā)明一實(shí)施例中，將結(jié)晶物通入低溫高純氮?dú)飧稍镆垣@得最終的晶體產(chǎn)物。

通過本發(fā)明所提供的高純度花椒麻味物質(zhì)的制備方法制備獲得的花椒麻味物質(zhì)其HPLC-MS鑒定其分子量為263及289，鑒定為山椒素類成分(圖1)，其純度大于97％(圖2)。

目前發(fā)現(xiàn)的花椒麻味物質(zhì)至少有25種以上，來源于于國內(nèi)外不同花椒品種和產(chǎn)地，本發(fā)明主要以我國大量栽培和種植的紅花椒(紅椒，Zanthoxylum bungeanum Maxim.)和青花椒(Zanthoxylum schinifolium Sieb.et Zucc)為原料的，其中,(2E,4E,6Z,10E)-2’-羥基-N-異丁基-2,4,6,10-十二烷四烯酰胺、(2E,4E,6E,10E)-2’-羥基-N-異丁基-2,4,6,10-十二烷四烯酰胺、(2E,4E,6Z,10E,12E)-2’-羥基-N-異丁基-2,4,6,10,12-十四烷五烯酰胺根據(jù)這三種成分是最大量的麻味成分，是主體成分，因此，用本方法能簡單快速獲得高純度的花椒麻味成分，且制備獲得的這三種物質(zhì)對花椒麻味物質(zhì)具有很強(qiáng)的代表性，可以用于花椒屬植物的品質(zhì)評定。

如上所述，本發(fā)明的一種高純度花椒麻味物質(zhì)的制備方法，該方法包括花椒麻味物質(zhì)的吸附、無水乙醚脫油、脫色、甲醇洗脫、石油醚純化、冷凍結(jié)晶以及氮?dú)飧稍锕ざ?。具有? 下有益效果：

(1)本發(fā)明提供的一種高純度花椒麻味物質(zhì)的提取制備方法，采用硅膠吸附、無水乙醚去雜，避免了傳統(tǒng)層析柱過程復(fù)雜、制備量小，而且能有效去除油脂、色素等雜質(zhì)，簡化了花椒麻味物質(zhì)的提取、去雜工藝，制備量不受限制，便于實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。

(2)本發(fā)明提供的一種高純度花椒麻味物質(zhì)的提取制備方法，在硅膠吸附、無水乙醚除雜的基礎(chǔ)上，采用甲醇洗脫，結(jié)合石油醚繼續(xù)去除生物堿、多酚等雜質(zhì)，避免了傳統(tǒng)制備型色譜設(shè)備昂貴、操作要求高等缺點(diǎn)，降低了生存成本，可快速提取和分離獲得高純度的花椒麻味物質(zhì)。通過鑒定花椒麻味物質(zhì)的純度大于97％，可應(yīng)用花椒麻味物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品、保健食品以及醫(yī)藥等領(lǐng)域。

附圖說明

圖1A-圖1C分別為本發(fā)明所得花椒麻味物質(zhì)質(zhì)譜圖及結(jié)構(gòu)圖

圖2為本發(fā)明所得花椒麻味物質(zhì)高效液相色譜圖

具體實(shí)施方式

以下通過特定的具體實(shí)例說明本發(fā)明的實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說明書所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)與功效。本發(fā)明還可以通過另外不同的具體實(shí)施方式加以實(shí)施或應(yīng)用，本說明書中的各項(xiàng)細(xì)節(jié)也可以基于不同觀點(diǎn)與應(yīng)用，在沒有背離本發(fā)明的精神下進(jìn)行各種修飾或改變。

須知，下列實(shí)施例中未具體注明的工藝設(shè)備或裝置均采用本領(lǐng)域內(nèi)的常規(guī)設(shè)備或裝置。

此外應(yīng)理解，本發(fā)明中提到的一個(gè)或多個(gè)方法步驟并不排斥在所述組合步驟前后還可以存在其他方法步驟或在這些明確提到的步驟之間還可以插入其他方法步驟，除非另有說明；還應(yīng)理解，本發(fā)明中提到的一個(gè)或多個(gè)設(shè)備/裝置之間的組合連接關(guān)系并不排斥在所述組合設(shè)備/裝置前后還可以存在其他設(shè)備/裝置或在這些明確提到的兩個(gè)設(shè)備/裝置之間還可以插入其他設(shè)備/裝置，除非另有說明。而且，除非另有說明，各方法步驟的編號(hào)僅為鑒別各方法步驟的便利工具，而非為限制各方法步驟的排列次序或限定本發(fā)明可實(shí)施的范圍，其相對關(guān)系的改變或調(diào)整，在無實(shí)質(zhì)變更技術(shù)內(nèi)容的情況下，當(dāng)亦視為本發(fā)明可實(shí)施的范疇。

實(shí)施例1

稱取20g花椒麻味物質(zhì)含量為27.4％的經(jīng)超臨界二氧化碳萃取的花椒油樹脂，加入20g薄層層析用硅膠(110℃活化1h)，充分?jǐn)嚢杌靹蚝螅尤?60mL無水乙醚，攪拌混勻后， 靜置2h，靜置過程中間歇攪拌，靜置后抽濾，濾餅在室溫的條件下置于通風(fēng)處，揮干乙醚，加入80mL甲醇，在45℃的環(huán)境下攪拌浸提6h，抽濾，得濾液，真空條件下脫除溶劑，在所得粗提物中加入40mL石油醚，在50℃條件下回流浸提0.5h，棄浸提液，再加加入40mL石油醚，在50℃條件下回流浸提12h，固液分離，浸提液-18℃冷凍結(jié)晶12h，過濾后，通入5℃低溫氮?dú)飧稍锖?，得到花椒麻味物質(zhì)其質(zhì)譜圖和HPLC-MS鑒定結(jié)果如圖1和圖2所示，其分子量為263及289，鑒定為山椒素類成分，純度為97.4％。

實(shí)施例2

稱取20g花椒麻味物質(zhì)含量為22.4％的經(jīng)95％乙醇萃取的花椒油樹脂，加入40g薄層層析用硅膠(110℃活化1h)，充分?jǐn)嚢杌靹蚝?，加?60mL無水乙醚，攪拌混勻后，靜置2h，靜置過程中間歇攪拌，靜置后抽濾，濾餅在室溫的條件下置于通風(fēng)處，揮干乙醚，加入240mL甲醇，在50℃的環(huán)境下攪拌浸提9h，抽濾，得濾液，真空條件下脫除溶劑，在所得粗提物中加入120mL石油醚，在50℃條件下回流浸提0.5h，棄浸提液，再加加入120mL石油醚，在50℃條件下回流浸提15h，固液分離，浸提液-38℃冷凍結(jié)晶18h，過濾后，通入5℃低溫氮?dú)飧稍锖螅玫交ń仿槲段镔|(zhì)其質(zhì)譜圖和HPLC-MS鑒定結(jié)果與實(shí)施例1相近，純度為98.4％。

實(shí)施例3

稱取20g花椒麻味物質(zhì)含量為28.2％的經(jīng)超臨界二氧化碳萃取的花椒油樹脂，加入60g薄層層析用硅膠(110℃活化1h)，充分?jǐn)嚢杌靹蚝?，加?40mL無水乙醚，攪拌混勻后，靜置2h，靜置過程中間歇攪拌，靜置后抽濾，濾餅在室溫的條件下置于通風(fēng)處，揮干乙醚，加入480mL甲醇，在55℃的環(huán)境下攪拌浸提12h，抽濾，得濾液，真空條件下脫除溶劑，在所得粗提物中加入240mL石油醚，在50℃條件下回流浸提0.5h，棄浸提液，再加加入240mL石油醚，在50℃條件下回流浸提24h，固液分離，浸提液-80℃冷凍結(jié)晶24h，過濾后，通入5℃低溫氮?dú)飧稍锖?，得到花椒麻味物質(zhì)其質(zhì)譜圖和HPLC-MS鑒定結(jié)果與實(shí)施例1相近，純度為97.9％。

實(shí)施例4

稱取20g花椒麻味物質(zhì)含量為20.5％的經(jīng)95％乙醇萃取的花椒油樹脂，加入20g薄層層析用硅膠(120℃活化0.5h)，充分?jǐn)嚢杌靹蚝?，加?80mL無水乙醚，攪拌混勻后，靜置2.5h，靜置過程中間歇攪拌，靜置后抽濾，濾餅在室溫的條件下置于通風(fēng)處，揮干乙醚，加入200mL甲醇，在45℃的環(huán)境下攪拌浸提12h，抽濾，得濾液，真空條件下脫除溶劑，在所 得粗提物中加入120mL石油醚，在50℃條件下回流浸提20min，棄浸提液，再加加入120mL石油醚，在50℃條件下回流浸提15h，固液分離，浸提液-80℃冷凍結(jié)晶24h，過濾后，通入5℃低溫氮?dú)飧稍锖螅玫交ń仿槲段镔|(zhì)其質(zhì)譜圖和HPLC-MS鑒定結(jié)果與實(shí)施例1相近，純度為97.0％。

實(shí)施例5

稱取20g花椒麻味物質(zhì)含量為29.6％的經(jīng)超臨界二氧化碳萃取的花椒油樹脂，加入40g薄層層析用硅膠(100℃活化1.5h)，充分?jǐn)嚢杌靹蚝?，加?60mL無水乙醚，攪拌混勻后，靜置1.5h，靜置過程中間歇攪拌，靜置后抽濾，濾餅在室溫的條件下置于通風(fēng)處，揮干乙醚，加入200mL甲醇，在55℃的環(huán)境下攪拌浸提6h，抽濾，得濾液，真空條件下脫除溶劑，在所得粗提物中加入120mL石油醚，在50℃條件下回流浸提40min，棄浸提液，再加加入120mL石油醚，在50℃條件下回流浸提15h，固液分離，浸提液-80℃冷凍結(jié)晶24h，過濾后，通入5℃低溫氮?dú)飧稍锖?，得到花椒麻味物質(zhì)其質(zhì)譜圖和HPLC-MS鑒定結(jié)果與實(shí)施例1相近，純度為98.1％。

綜上所述，本發(fā)明有效克服了現(xiàn)有技術(shù)中的種種缺點(diǎn)而具高度產(chǎn)業(yè)利用價(jià)值。

上述實(shí)施例僅例示性說明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟悉此技術(shù)的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對上述實(shí)施例進(jìn)行修飾或改變。因此，舉凡所屬技術(shù)領(lǐng)域中具有通常知識(shí)者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術(shù)思想下所完成的一切等效修飾或改變，仍應(yīng)由本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。