本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物制備領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
猴頭菇（Hericium erinaceus），又叫猴頭菌、刺猬菌、花菜菌或山伏菌等，包括猴頭菌、小刺猴頭菌、假猴頭菌和珊瑚狀猴頭菌4種，多生長于深山密林中許多闊葉處的腐木和立木的受傷處，廣泛分布于東亞地區(qū)。猴頭菇早在《本草綱目》中就有記載：猴頭菇性平，味甘，有“利五臟，助消化”之功能，在傳統(tǒng)中藥應(yīng)用上由來已久，并被人們稱之為與“熊掌、海參、魚翅”齊名的四大名菜之一，素有“素中葷”之稱。猴頭菇作為藥食兼用真菌，具有豐富的營養(yǎng)價值和藥用價值，能夠用于輔助治療胃潰瘍、消化不良、胃炎、腫瘤等疾病。
猴頭菇富含多糖、多肽和維生素等成分，其中猴頭菇多糖是主要的活性物質(zhì)之一。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和藥理學(xué)研究表明，猴頭菇多糖具有保護(hù)消化系統(tǒng)、抗腫瘤及提高免疫力、抗氧化、延緩衰老、降血糖及降血脂、抗病毒及抑菌等生理功能。
猴頭菇多糖可以從猴頭菇子實體、菌絲體和發(fā)酵液中提取得到，其中作為天然自然資源的猴頭菇子實體被廣泛用于猴頭菇多糖的提取。猴頭菇多糖的提取方法包括溶劑（水、酸、堿等）提取法、物理壓力（微波、超聲波）提取法、生物（纖維素酶、果膠酶）提取法及多種方法復(fù)合提取的方法。其中，熱水浸提是最常用的提取方法，具有成本低，操作簡便，有利于保證多糖原有屬性的特點，但提取得率并不高，很大程度上造成原料的浪費。因此對經(jīng)熱水浸提后的猴頭菇殘渣進(jìn)行再次利用非常有必要。本發(fā)明首先采用熱水浸提的方法制備猴頭菇水提水溶性精制多糖，所得濾渣進(jìn)一步經(jīng)堿法制備猴頭菇堿提水溶性精制多糖。所得猴頭菇水提水溶性精制多糖采用乙醇分級沉淀的方法進(jìn)行純化，得到不同性質(zhì)的猴頭菇水溶性純化多糖組分。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種猴頭菇中不同性質(zhì)多糖綜合制備及純化方法。
本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的。
本發(fā)明所述的一種猴頭菇中不同性質(zhì)多糖綜合制備及純化方法，具體步驟如下。
（1）以干燥猴頭菇子實體為原料，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎得到粉末；向猴頭菇粉末中加入15倍質(zhì)量的乙醇（乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%~100%）浸泡24 h，4層紗布過濾，收集沉淀、揮干乙醇，所得猴頭菇粉末備用。
（2）將步驟（1）中的猴頭菇粉末與蒸餾水混合，重量/體積（g/mL）比為1:15~1:30，沸水浴提取2 h，將提取液依次用紗布過濾、4800 r/min離心分離15 min，得到濾液和濾渣；濾渣再次提取，提取液再次經(jīng)紗布過濾、4800 r/min離心分離15 min，得到濾液，合并兩次提取所得濾液，得到濾液和濾渣分別做以下處理。
A．濾液用于猴頭菇水提水溶性精制多糖的制備，并對猴頭菇水提水溶性精制多糖進(jìn)行純化：
①所得濾液經(jīng)減壓濃縮至原體積1/10~1/5，往濃縮液中緩慢加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%的乙醇，直至體系中乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%，室溫20~25 ℃，靜置12 h以上，轉(zhuǎn)速4800 r/min離心15 min，收集沉淀。
②在步驟①中的沉淀中依次添加無水乙醇、丙酮和無水乙醚，浸泡洗滌，所得樣品再加入蒸餾水于65 ℃復(fù)溶，采用Sevag法除去蛋白質(zhì)；脫除蛋白質(zhì)的多糖溶液減壓濃縮，將濃縮液進(jìn)行透析（透析袋相對截留分子量為3500 Da），依次用流動自來水透析24 h、蒸餾水透析36 h；透析結(jié)束后，將透析液濃縮、冷凍干燥，得到猴頭菇水提水溶性精制多糖。
③在步驟②中的猴頭菇水提水溶性精制多糖中加入蒸餾水溶解，重量/體積（g/mL）比為1:15~1:30，緩慢加入無水乙醇直至體系中乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到10%，于4~25℃靜置12 h，將上述醇沉體系10000 r/min離心分離20 min，分別收集沉淀和上清液。
④在步驟③中的上清液中緩慢加入無水乙醇直至體系中乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到50%，于4~25℃靜置12 h，將醇沉體系10000 r/min離心分離20 min，分別收集沉淀和上清液。
⑤在步驟④中的上清液中緩慢加入無水乙醇直至體系中乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到60%，于4~25℃靜置12 h，將醇沉體系10000 r/min離心分離20 min，分別收集沉淀和上清液。
⑥在步驟⑤中的上清液緩慢中加入無水乙醇直至體系中乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到70%，于4~25℃靜置12 h，將醇沉體系10000 r/min離心分離20 min，分別收集沉淀和上清液。
⑦在步驟⑥中的上清液中緩慢加入無水乙醇直至體系中乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到80%，于4~25℃靜置12 h，將醇沉體系10000 r/min離心分離20 min，分別收集沉淀和上清液。
⑧將步驟③、④、⑤、⑥和⑦離心分離所得沉淀分別加水復(fù)溶，再經(jīng)減壓濃縮、冷凍干燥后可分別得不同性質(zhì)猴頭菇水溶性純化多糖組分。
B．濾渣用于猴頭菇堿提水溶性精制多糖的制備：
①向所得濾渣中加入（0.1M~0.5M）NaOH/0.01M NaBH4溶液，重量/體積（g/mL）比為1:10~1:30，4 ℃中提取12 h，將提取液依次用紗布過濾、4800 r/min離心分離15 min，分別收集濾液和濾渣；濾渣再次提取，提取液再次經(jīng)紗布過濾、4800 r/min離心分離15 min，收集濾液；合并兩次提取所得濾液，減壓濃縮至原體積1/10~1/5，往濃縮液中緩慢加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%的乙醇，直至體系中乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%，室溫（20~25 ℃）靜置12 h以上，4800 r/min離心15 min，收集沉淀。
②在步驟①中的沉淀依次添加無水乙醇、丙酮和無水乙醚，浸泡洗滌，所得樣品再加入蒸餾水于70 ℃復(fù)溶，采用Sevag法除去蛋白質(zhì)；脫除蛋白質(zhì)的多糖溶液減壓濃縮，將濃縮液進(jìn)行透析（透析袋相對截留分子量為3500 Da），依次用流動自來水透析24 h、蒸餾水透析36 h；透析結(jié)束后，將透析液濃縮、冷凍干燥，得到猴頭菇堿提水溶性精制多糖。
本發(fā)明步驟（1）中用于浸泡猴頭菇粉末的乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)優(yōu)選95%。
本發(fā)明所述的Sevag法脫除蛋白質(zhì)所用Sevag試劑（正丁醇：氯仿=1:4）與多糖溶液的體積比為1:3。
本發(fā)明對綜合制備得到的猴頭菇水提水溶性和堿提水溶性精制多糖進(jìn)行了基本理化性質(zhì)（得率，化學(xué)成分分析，單糖組成，表觀黏度）的測定，并測定了猴頭菇水提水溶性精制多糖不同性質(zhì)的水溶性純化多糖組分的得率、中性糖含量、分子量分布及均一性檢測：
（1）猴頭菇水提水溶性和堿提水溶性精制多糖得率測定：將凍干后的猴頭菇水提水溶性和堿提水溶性精制多糖稱重，以原料質(zhì)量計算其得率：
a) 猴頭菇水提水溶性精制多糖得率/%=（猴頭菇水提水溶性精制多糖質(zhì)量/原料質(zhì)量）×100%。
b) 猴頭菇堿提水溶性精制多糖得率/%=（猴頭菇堿提水溶性精制多糖質(zhì)量/原料質(zhì)量）×100%。
（2）猴頭菇水提水溶性精制多糖乙醇分級不同性質(zhì)水溶性純化多糖組分得率測定：將凍干后的純化多糖組分稱重，基于猴頭菇水提水溶性精制多糖質(zhì)量計算其得率：
純化多糖組分得率/%=（純化多糖組分質(zhì)量/猴頭菇水提水溶性精制多糖質(zhì)量）×100%。
（3）猴頭菇水提水溶性和堿提水溶性精制多糖基本理化性質(zhì)分析：采用苯酚-硫酸法測定其中性糖含量，采用硫酸-咔唑法測定其糖醛酸含量，采用考馬斯亮藍(lán)法測定其蛋白質(zhì)含量；單糖組成測定采用離子色譜儀器手段進(jìn)行，表觀黏度采用AERS-G2流變儀進(jìn)行測定。
（4）猴頭菇水提水溶性精制多糖經(jīng)乙醇分級得到的純化多糖組分，中性糖含量用苯酚-硫酸法測定，分子量分布及均一性檢測采用高效分子排阻色譜（HPSEC）。
本發(fā)明的優(yōu)點在于：多糖綜合提取得率高；水提水溶性精制多糖經(jīng)過簡單有效的乙醇分級沉淀，獲得糖含量和均一性較為良好的高純度組分；堿提水溶性精制多糖黏度較高。
具體實施方式
本發(fā)明將通過以下實施例作進(jìn)一步說明。
實施例1。
以干燥猴頭菇子實體為原料，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎得到粉末；向猴頭菇粉末中加入15倍的乙醇（乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%）浸泡24 h，紗布過濾，收集沉淀、揮干乙醇，所得猴頭菇干粉備用。猴頭菇粉末與蒸餾水混合，重量/體積（g/mL）比為1:15，沸水浴提取2 h，將提取液依次用紗布過濾、4800 r/min離心分離15 min，收集濾渣；濾渣再次提取，提取液再次經(jīng)紗布過濾、4800 r/min離心分離15 min得到濾液，合并兩次提取所得濾液，分別收集濾液和濾渣。濾液用于猴頭菇水提水溶性精制多糖的制備。濾液經(jīng)減壓濃縮至原體積1/10~1/5，往濃縮液中緩慢加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%的乙醇，直至體系中乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%，室溫（20~25 ℃）靜置12 h以上，4800 r/min離心分離15 min收集沉淀。沉淀依次添加無水乙醇、丙酮和無水乙醚，浸泡洗滌，所得樣品再加入蒸餾水于65 ℃復(fù)溶，采用Sevag法除去蛋白質(zhì)。脫除蛋白質(zhì)的多糖溶液減壓濃縮，將濃縮液進(jìn)行透析（透析袋相對截留分子量為3500 Da），依次用流動自來水透析24 h、蒸餾水透析36 h。透析結(jié)束后，將透析液濃縮、冷凍干燥，得到猴頭菇水提水溶性精制多糖。猴頭菇水提水溶性精制多糖加入蒸餾水溶解，重量/體積（g/mL）比為1:15，緩慢加入無水乙醇直至體系中乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到10%，于4℃靜置12 h，將上述醇沉體系10000 r/min離心分離20 min，分別收集沉淀和上清液。上清液緩慢加入無水乙醇直至體系中乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到50%，于4℃靜置12 h，將上述醇沉體系10000 r/min離心分離20 min，分別收集沉淀和上清液。上清液緩慢加入無水乙醇直至體系中乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到60%，于4℃靜置12 h，將上述醇沉體系10000 r/min離心分離20 min，分別收集沉淀和上清液。上清液緩慢加入無水乙醇直至體系中乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到70%，于4~25℃靜置12 h，將上述醇沉體系10000 r/min離心分離20 min，分別收集沉淀和上清液；上清液緩慢加入無水乙醇直至體系中乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到80%，于4~25℃靜置12 h，將上述醇沉體系10000 r/min離心分離20 min，收集沉淀；收集以上經(jīng)乙醇分級所得沉淀分別加水復(fù)溶，再經(jīng)減壓濃縮、冷凍干燥后可得不同性質(zhì)猴頭菇水溶性純化多糖組分。濾渣用于猴頭菇堿提水溶性精制多糖的制備。向濾渣加入0.1M NaOH/0.01M NaBH4，重量/體積（g/mL）比為1:30，4 ℃中提取12 h，將提取液依次用紗布過濾、4800 r/min離心分離15 min，分別收集濾液和濾渣；濾渣再次提取，提取液再次經(jīng)紗布過濾、4800 r/min離心分離15 min，收集濾液；合并兩次提取所得濾液，減壓濃縮至原體積1/10~1/5，往濃縮液中緩慢加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%的乙醇，直至體系中乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%，室溫（20~25 ℃）靜置12 h以上，4800 r/min離心分離15 min收集沉淀。沉淀依次添加無水乙醇、丙酮和無水乙醚，浸泡洗滌，所得樣品再加入蒸餾水于70 ℃復(fù)溶，采用Sevag法除去蛋白質(zhì)。脫除蛋白質(zhì)的多糖溶液減壓濃縮，將濃縮液進(jìn)行透析（透析袋相對截留分子量為3500 Da），依次用流動自來水透析24 h、蒸餾水透析36 h；透析結(jié)束后，將透析液濃縮、冷凍干燥，得到猴頭菇堿提水溶性精制多糖。猴頭菇水提水溶性和堿提水溶性精制多糖得率分別為4.07%和1.25%；中性糖含量、糖醛酸含量和蛋白質(zhì)含量分別為66.00%、4.14%、7.70%和55.97%、6.96%、7.31%；猴頭菇水提水溶性精制多糖主要由巖藻糖、半乳糖和葡萄糖組成，而猴頭菇堿提水溶性精制多糖主要由葡萄糖組成；在0.01~1000 s-1剪切速率范圍內(nèi)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的猴頭菇水提水溶性精制多糖在剪切速率為0.01 s-1時達(dá)到最大表觀黏度0.06 Pa.s，而質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的猴頭菇堿提水溶性精制多糖在剪切速率為0.01 s-1時達(dá)到最大表觀黏度0.20 Pa.s。猴頭菇水提水溶性精制多糖經(jīng)乙醇沉淀得到的10%，50%，60%，70%和80%分級多糖組分得率分別為20.60%，29.90%，29.40%，16.70%，8.60%；中性糖含量分別為61.08%，73.42%，72.28%，65.69%，75.55%；經(jīng)HPSEC檢測表明50%，60%，70%和80%乙醇分級組分均一性較好。
實施例2。
以干燥猴頭菇子實體為原料，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎得到粉末；向猴頭菇粉末中加入15倍的乙醇（乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%）浸泡24 h，紗布過濾，收集沉淀、揮干乙醇，所得猴頭菇干粉備用。猴頭菇粉末與蒸餾水混合，重量/體積（g/mL）比為1:15，沸水浴提取2 h，將提取液依次用紗布過濾、4800 r/min離心分離15 min，收集濾渣；濾渣再次提取，提取液再次經(jīng)紗布過濾、4800 r/min離心分離15 min得到濾液，合并兩次提取所得濾液，分別收集濾液和濾渣。濾液用于猴頭菇水提水溶性精制多糖的制備。濾液經(jīng)減壓濃縮至原體積1/10~1/5，往濃縮液中緩慢加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%的乙醇，直至體系中乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%，室溫（20~25 ℃）靜置12 h以上，4800 r/min離心分離15 min收集沉淀。沉淀依次添加無水乙醇、丙酮和無水乙醚，浸泡洗滌，所得樣品再加入蒸餾水于65 ℃復(fù)溶，采用Sevag法除去蛋白質(zhì)。脫除蛋白質(zhì)的多糖溶液減壓濃縮，將濃縮液進(jìn)行透析（透析袋相對截留分子量為3500 Da），依次用流動自來水透析24 h、蒸餾水透析36 h。透析結(jié)束后，將透析液濃縮、冷凍干燥，得到猴頭菇水提水溶性精制多糖。猴頭菇水提水溶性精制多糖加入蒸餾水溶解，重量/體積（g/mL）比為1:15，緩慢加入無水乙醇直至體系中乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到10%，于4℃靜置12 h，將上述醇沉體系10000 r/min離心分離20 min，分別收集沉淀和上清液。上清液緩慢加入無水乙醇直至體系中乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到50%，于4℃靜置12 h，將上述醇沉體系10000 r/min離心分離20 min，分別收集沉淀和上清液。上清液緩慢加入無水乙醇直至體系中乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到60%，于4℃靜置12 h，將上述醇沉體系10000 r/min離心分離20 min，分別收集沉淀和上清液。上清液緩慢加入無水乙醇直至體系中乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到70%，于4~25℃靜置12 h，將上述醇沉體系10000 r/min離心分離20 min，分別收集沉淀和上清液；上清液緩慢加入無水乙醇直至體系中乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到80%，于4~25℃靜置12 h，將上述醇沉體系10000 r/min離心分離20 min，收集沉淀；收集以上經(jīng)乙醇分級所得沉淀分別加水復(fù)溶，再經(jīng)減壓濃縮、冷凍干燥后可得不同性質(zhì)猴頭菇水溶性純化多糖組分。濾渣用于猴頭菇堿提水溶性精制多糖的制備。向濾渣加入0.5 M NaOH/0.01M NaBH4，重量/體積比為1:10（g/mL），4 ℃中提取12 h，將提取液依次用紗布過濾、4800 r/min離心分離15 min，分別收集濾液和濾渣；濾渣再次提取，提取液再次經(jīng)紗布過濾、4800 r/min離心分離15 min，收集濾液；合并兩次提取所得濾液，減壓濃縮至原體積1/10~1/5，往濃縮液中緩慢加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%的乙醇，直至體系中乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%，室溫（20~25 ℃）靜置12 h以上，4800 r/min離心分離15 min收集沉淀。沉淀依次添加無水乙醇、丙酮和無水乙醚，浸泡洗滌，所得樣品再加入蒸餾水于70 ℃復(fù)溶，采用Sevag法除去蛋白質(zhì)。脫除蛋白質(zhì)的多糖溶液減壓濃縮，將濃縮液進(jìn)行透析（透析袋相對截留分子量為3500 Da），依次用流動自來水透析24 h、蒸餾水透析36 h；透析結(jié)束后，將透析液濃縮、冷凍干燥，得到猴頭菇堿提水溶性精制多糖。猴頭菇水提水溶性和堿提水溶性精制多糖得率分別為4.07%和3.78%；中性糖含量、糖醛酸含量和蛋白質(zhì)含量分別為66.00%、7.70%、4.14%和92.97%、7.72%、2.16%；猴頭菇水提水溶性精制多糖主要由巖藻糖、半乳糖和葡萄糖組成，而猴頭菇堿提水溶性精制多糖主要由葡萄糖組成；在0.01~1000 s-1剪切速率范圍內(nèi)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的猴頭菇水提水溶性精制多糖在剪切速率為0.01 s-1時達(dá)到最大表觀黏度0.06 Pa.s，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的猴頭菇堿提水溶性精制多糖在剪切速率為0.01 s-1時達(dá)到最大表觀黏度32.57 Pa.s。猴頭菇水提水溶性精制多糖經(jīng)乙醇沉淀得到的10%，50%，60%，70%和80%分級多糖組分得率分別為20.60%，29.90%，29.40%，16.70%，8.60%；中性糖含量分別為61.08%，73.42%，72.28%，65.69%，75.55%；經(jīng)HPSEC檢測表明50%，60%，70%和80%乙醇分級純化多糖組均一性較好。
實施例3。
以干燥猴頭菇子實體為原料，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎得到粉末；向猴頭菇粉末中加入15倍的乙醇（乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%）浸泡24 h，紗布過濾，收集沉淀、揮干乙醇，所得猴頭菇干粉備用。猴頭菇粉末與蒸餾水混合，重量/體積（g/mL）比為1:30，沸水浴提取2 h，將提取液依次用紗布過濾、4800 r/min離心分離15 min，收集濾渣；濾渣再次提取，提取液再次經(jīng)紗布過濾、4800 r/min離心分離15 min得到濾液，合并兩次提取所得濾液，分別收集濾液和濾渣。濾液用于猴頭菇水提水溶性精制多糖的制備。濾液經(jīng)減壓濃縮至原體積1/10~1/5，往濃縮液中緩慢加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%的乙醇，直至體系中乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%，室溫（20~25 ℃）靜置12 h以上，4800 r/min離心分離15 min收集沉淀。沉淀依次添加無水乙醇、丙酮和無水乙醚，浸泡洗滌，所得樣品再加入蒸餾水于65 ℃復(fù)溶，采用Sevag法除去蛋白質(zhì)。脫除蛋白質(zhì)的多糖溶液減壓濃縮，將濃縮液進(jìn)行透析（透析袋相對截留分子量為3500 Da），依次用流動自來水透析24 h、蒸餾水透析36 h。透析結(jié)束后，將透析液濃縮、冷凍干燥，得到猴頭菇水提水溶性精制多糖。猴頭菇水提水溶性精制多糖加入蒸餾水溶解，重量/體積（g/mL）比為1:15，緩慢加入無水乙醇直至體系中乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到10%，于4℃靜置12 h，將上述醇沉體系10000 r/min離心分離20 min，分別收集沉淀和上清液。上清液緩慢加入無水乙醇直至體系中乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到50%，于4℃靜置12 h，將上述醇沉體系10000 r/min離心分離20 min，分別收集沉淀和上清液。上清液緩慢加入無水乙醇直至體系中乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到60%，于4℃靜置12 h，將上述醇沉體系10000 r/min離心分離20 min，分別收集沉淀和上清液。上清液緩慢加入無水乙醇直至體系中乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到70%，于4~25℃靜置12 h，將上述醇沉體系10000 r/min離心分離20 min，分別收集沉淀和上清液；上清液緩慢加入無水乙醇直至體系中乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到80%，于4~25℃靜置12 h，將上述醇沉體系10000 r/min離心分離20 min，收集沉淀；收集以上經(jīng)乙醇分級所得沉淀分別加水復(fù)溶，再經(jīng)減壓濃縮、冷凍干燥后可得不同性質(zhì)猴頭菇水溶性純化多糖組分。濾渣用于猴頭菇堿提水溶性精制多糖的制備。向濾渣加入0.1M NaOH/0.01M NaBH4，重量/體積（g/mL）比為1:30，4 ℃中提取12 h，將提取液依次用紗布過濾、4800 r/min離心分離15 min，分別收集濾液和濾渣；濾渣再次提取，提取液再次經(jīng)紗布過濾、4800 r/min離心分離15 min，收集濾液；合并兩次提取所得濾液，減壓濃縮至原體積1/10~1/5，往濃縮液中緩慢加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%的乙醇，直至體系中乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%，室溫（20~25 ℃）靜置12 h以上，4800 r/min離心分離15 min收集沉淀。沉淀依次添加無水乙醇、丙酮和無水乙醚，浸泡洗滌，所得樣品再加入蒸餾水于70 ℃復(fù)溶，采用Sevag法除去蛋白質(zhì)。脫除蛋白質(zhì)的多糖溶液減壓濃縮，將濃縮液進(jìn)行透析（透析袋相對截留分子量為3500 Da），依次用流動自來水透析24 h、蒸餾水透析36 h；透析結(jié)束后，將透析液濃縮、冷凍干燥，得到猴頭菇水提堿溶性精制多糖。猴頭菇水提水溶性和堿提水溶性精制多糖得率分別為3.92%和0.80%；中性糖含量、糖醛酸含量和蛋白質(zhì)含量分別為69.68%、7.53%、2.18%和58.17%、7.03%、5.75%；猴頭菇水溶性精制多糖主要由巖藻糖、半乳糖和葡萄糖組成，而猴頭菇堿提水溶性精制多糖主要由葡萄糖組成；在0.01~1000 s-1剪切速率范圍內(nèi)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的猴頭菇水提水溶性精制多糖在剪切速率為0.01 s-1時達(dá)到最大表觀黏度0.05 Pa.s，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的猴頭菇堿提水溶性精制多糖在剪切速率為0.01 s-1時達(dá)到最大表觀黏度為0.30 Pa.s。猴頭菇水提水溶性精制多糖經(jīng)乙醇沉淀得到的10%，50%，60%，70%和80%分級多糖組分得率分別為23.20%，30.40%，28.70%，19.50%，10.60%；中性糖含量分別為78.81%，77.89%，77.04%，69.40%，70.32%；經(jīng)HPSEC檢測表明50%，60%，70%和80%乙醇分級純化多糖組均一性較好。
實施例4。
以干燥猴頭菇子實體為原料，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎得到粉末；向猴頭菇粉末中加入15倍的乙醇（乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%）浸泡24 h，紗布過濾，收集沉淀、揮干乙醇，所得猴頭菇干粉備用。猴頭菇粉末與蒸餾水混合，重量體積（g/mL）比為1:30，沸水浴提取2 h，將提取液依次用紗布過濾、4800 r/min離心分離15 min，收集濾渣；濾渣再次提取，提取液再次經(jīng)紗布過濾、4800 r/min離心分離15 min得到濾液，合并兩次提取所得濾液，分別收集濾液和濾渣。濾液用于猴頭菇水提水溶性精制多糖的制備。濾液經(jīng)減壓濃縮至原體積1/10~1/5，往濃縮液中緩慢加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%的乙醇，直至體系中乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%，室溫（20~25 ℃）靜置12 h以上，4800 r/min離心分離15 min收集沉淀。沉淀依次添加無水乙醇、丙酮和無水乙醚，浸泡洗滌，所得樣品再加入蒸餾水于65 ℃復(fù)溶，采用Sevag法除去蛋白質(zhì)。脫除蛋白質(zhì)的多糖溶液減壓濃縮，將濃縮液進(jìn)行透析（透析袋相對截留分子量為3500 Da），依次用流動自來水透析24 h、蒸餾水透析36 h。透析結(jié)束后，將透析液濃縮、冷凍干燥，得到猴頭菇水提水溶性精制多糖。猴頭菇水提水溶性精制多糖加入蒸餾水溶解，重量/體積（g/mL）比為1:15，緩慢加入無水乙醇直至體系中乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到10%，于4℃靜置12 h，將上述醇沉體系10000 r/min離心分離20 min，分別收集沉淀和上清液。上清液緩慢加入無水乙醇直至體系中乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到50%，于4℃靜置12 h，將上述醇沉體系10000 r/min離心分離20 min，分別收集沉淀和上清液。上清液緩慢加入無水乙醇直至體系中乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到60%，于4℃靜置12 h，將上述醇沉體系10000 r/min離心分離20 min，分別收集沉淀和上清液。上清液緩慢加入無水乙醇直至體系中乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到70%，于4~25℃靜置12 h，將上述醇沉體系10000 r/min離心分離20 min，分別收集沉淀和上清液；上清液緩慢加入無水乙醇直至體系中乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到80%，于4~25℃靜置12 h，將上述醇沉體系10000 r/min離心分離20 min，收集沉淀；收集以上經(jīng)乙醇分級所得沉淀分別加水復(fù)溶，再經(jīng)減壓濃縮、冷凍干燥后可得不同性質(zhì)猴頭菇水溶性純化多糖組分。濾渣用于猴頭菇堿提水溶性精制多糖的制備。向濾渣加入0.5 M NaOH/0.01M NaBH4，重量/體積（g/mL）比為1:10，4 ℃中提取12 h，將提取液依次用紗布過濾、4800 r/min離心分離15 min，分別收集濾液和濾渣；濾渣再次提取，提取液再次經(jīng)紗布過濾、4800 r/min離心分離15 min，收集濾液；合并兩次提取所得濾液，減壓濃縮至原體積1/10~1/5，往濃縮液中緩慢加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%的乙醇，直至體系中乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%，室溫（20~25 ℃）靜置12 h以上，4800 r/min離心分離15 min收集沉淀。沉淀依次添加無水乙醇、丙酮和無水乙醚，浸泡洗滌，所得樣品再加入蒸餾水于70 ℃復(fù)溶，采用Sevag法除去蛋白質(zhì)。脫除蛋白質(zhì)的多糖溶液減壓濃縮，將濃縮液進(jìn)行透析（透析袋相對截留分子量為3500 Da），依次用流動自來水透析24 h、蒸餾水透析36 h；透析結(jié)束后，將透析液濃縮、冷凍干燥，得到猴頭菇堿提水溶性精制多糖。猴頭菇水提水溶性和堿提水溶性精制多糖得率分別為3.92%和1.05%；中性糖含量、糖醛酸含量和蛋白質(zhì)含量分別為69.68%、7.53%、2.18%和63.28%、8.66%、8.38%；猴頭菇水提水溶性精制多糖主要由巖藻糖、半乳糖和葡萄糖組成，而猴頭菇堿提水溶性精制多糖主要由葡萄糖組成；在0.01~1000 s-1剪切速率范圍內(nèi)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的猴頭菇水提水溶性精制多糖在剪切速率為0.01 s-1時達(dá)到最大表觀黏度0.05 Pa.s，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的猴頭菇堿提水溶性精制多糖在剪切速率為0.01 s-1時達(dá)到最大表觀黏度為9.40 Pa.s。猴頭菇水提水溶性精制多糖經(jīng)乙醇沉淀得到的10%，50%，60%，70%和80%分級多糖組分得率分別為23.20%，30.40%，28.70%，19.50%，10.60%；中性糖含量分別為78.81%，77.89%，77.04%，69.40%，70.32%；經(jīng)HPSEC檢測表明50%，60%，70%和80%乙醇分級純化多糖組均一性較好。