本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種含有羥肟酸基團的氮芥類化合物及其制備方法和用途。

背景技術(shù)：

氮芥類藥物，如苯丁酸氮芥、鹽酸苯達莫司汀等，是最早用于臨床并取得突出療效的烷化劑類抗腫瘤藥物。該類藥物具有高度活潑的性質(zhì)。由于氯乙基中氯原子容易脫去形成碳正離子，再進一步發(fā)生分子內(nèi)成環(huán)反應(yīng)，形成高度活潑的乙烯亞胺離子。氮芥可以和其他體內(nèi)大分子的親核基團發(fā)生反應(yīng)，如蛋白質(zhì)的羧基、氨基、巰基、核酸的氨基和羥基、磷酸根等，進行烷基化修飾。氮芥容易與鳥嘌呤第七位氮共價結(jié)合，產(chǎn)生DNA的雙鏈內(nèi)的交叉聯(lián)結(jié)或DNA的同鏈內(nèi)不同堿基的交叉聯(lián)結(jié)。氮芥為細胞周期非特異性藥物，作為抗腫瘤藥物時選擇性差，存在嚴重的副作用，影響了臨床的使用。

目前，靶向治療已成為癌癥治療的重要方向，多采用一藥一靶點的治療模式。但是，腫瘤異于一般疾病，他的生長和存活不僅依賴于一種受體或一種信號通路的傳導(dǎo)，這就使得單純作用于一個靶點的策略并不能徹底殺死腫瘤細胞，并容易產(chǎn)生抗藥性。于是，多種藥物聯(lián)合用藥成為癌癥臨床治療的主要手段，雖然在一定程度上能達到預(yù)期的治療效果，但由于多種藥物彼此間容易發(fā)生相互作用，如對藥物的吸收和代謝產(chǎn)生影響，即使沒有相互作用，這些藥物通常也不能以它們單獨應(yīng)用時的劑量聯(lián)用，為此，藥物研究者借鑒多種藥物聯(lián)合用藥的原理，采用藥效團拼合的方法，將兩種或兩種以上的藥效團拼合成一個分子，使這個分子本身或其代謝產(chǎn)物作用于兩個或更多的靶點，從而產(chǎn)生協(xié)同作用以提高療效。

尋找和發(fā)現(xiàn)有效的非細胞毒抗腫瘤藥物是目前抗腫瘤藥物化學研究的一個重點，近年來，組蛋白去乙?；?histone deacetylase，HDAC)成為抗腫瘤藥物設(shè)計的新靶點。組蛋白去乙?；?histone deacetylase，HDAC)和組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferase，HAT)為真核細胞中廣泛存在的的一類相互拮抗的蛋白酶，它們共同調(diào)控著組蛋白末端氨基酸殘基的乙?；?，使之處于平衡狀態(tài)。組蛋白的乙?；腿ヒ阴；揎棡檎{(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的一種方式，組蛋白的乙?；潭韧ㄟ^影響染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)進而影響基因的表達。在腫瘤細胞中HDAC過量表達，從而抑制了某些抑癌基因的表達。大量文獻表明抑制HDAC的活性能有效地抑制腫瘤細胞的生長、轉(zhuǎn)移和和侵襲。HDAC抑制劑已成為重要的抗腫瘤作用的靶標。

本專利發(fā)明人創(chuàng)造性地將具有HDAC抑制活性的羥肟酸結(jié)構(gòu)引入到苯丁酸氮芥的結(jié)構(gòu)中，合成了一系列新的含有羥肟酸基團的氮芥類化合物，該類化合物兼具有氮芥基團的抗腫瘤活性，又具有對HDAC的抑制活性。體外抗腫瘤細胞活性、對腫瘤細胞單克隆形成影響、對腫瘤細胞周期影響以及對腫瘤細胞凋亡影響進行評價結(jié)果顯示，本專利中的化合物出比母體藥物苯丁酸氮芥的抗腫瘤活性提高了5至18倍。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及一類化合物的設(shè)計與合成，為了克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，本發(fā)明提供一種抗腫瘤活性更好的含有羥肟酸基團的氮芥類化合物及其制備方法和用途。本發(fā)明之所以能夠解決上述問題乃是通過以下技術(shù)方案給予實現(xiàn)：

在本發(fā)明的第一方面，提供了具有通式I所示的化合物或其藥學上可接受的鹽或其溶劑合物或其前藥分子：

其中，

X₁、X₂、X₃、X₄各自獨立地選自氫、烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基、雜環(huán)基、烯基、炔基、氨基、羥基、巰基、羧基、烷氧基、環(huán)烷氧基、鹵代芳基，烷氧基羰基、鹵素、氰基、酰胺基、硫氰基、異硫氰基、脲基、磺基；

Z選自烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基、雜環(huán)基、烯基、炔基，上述烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基、雜環(huán)基、烯基、炔基任選不取代或被一個或多個取代基所取代，所述取代基各自獨立地選自烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基、雜環(huán)基、烯基、炔基、氨基、羥基、巰基、羧基、烷氧基、環(huán)烷氧基、鹵素、氰基、硝基、亞硝基、磺基；

在本發(fā)明的第一方面的優(yōu)先實施方式中，所述的化合物優(yōu)先選自以下特征：

X₁、X₂、X₃、X₄各自獨立地選自氫、烷基、烷氧基、環(huán)烷氧基、烷氧基羰基、鹵素、氰基、硝基、亞硝基、酰胺基。

Z選自烷基、芳基、烯基、炔，上述烷基、芳基、烯基任選不取代或被一個或多個取代基所取代，所述取代基各自獨立地選自烷基、環(huán)烷基、芳基、雜芳基、雜環(huán)基、烯基、炔基、氨基、羥基、巰基、羧基、烷氧基、環(huán)烷氧基、鹵素、氰基、磺基；

在本發(fā)明的第一方面的最優(yōu)選實施方式中，提供了以下具體化合物：

表1本發(fā)明合成其中一部分的化合物

在本發(fā)明的第二方面，提供一種藥物組合物，所述藥物組合物包含：本發(fā)明第一方面所述化合物或其藥學上可接受的鹽或其溶劑合物或其前藥分子。

在本發(fā)明的第三方面，提供了上述通式Ⅰ化合物及其藥學上可接受的鹽或其溶劑合物或其前藥分子在制備用于治療或預(yù)防抗腫瘤、抗癌的藥物方面的用途。

在本發(fā)明的第三方面的優(yōu)選實施方式中，所述腫瘤或癌癥選自于黑色素瘤、胃癌、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、肺癌、鼻咽癌、結(jié)腸癌、直腸癌、淋巴癌、血癌、骨髓癌、腦癌、皮膚癌、骨癌、鼻咽癌、胰腺癌、腎癌、甲狀腺癌、前列腺癌，膀胱癌、食管癌、乳腺癌。

在本發(fā)明的第四方面，提供制備上述通式Ⅰ化合物的方法，該方法包括如下步驟：

(a)將化合物1與二乙醇胺高溫攪拌反應(yīng)得到化合物2；

(b)將化合物2與氯化試劑反應(yīng)得到化合物3

(c)將化合物3的硝基還原得到化合物4

(d)將化合物4與化合物5在縮合試劑作用下反應(yīng)得到化合物6

(e)將化合物6與鹽酸羥胺和氫氧化鉀反應(yīng)得到化合物7

其中Z、X₁、X₂、X₃和X₄為本發(fā)明的第一方面提供化合物的通式I中所定義。

在本發(fā)明的第四方面的優(yōu)選實施方式中，反應(yīng)步驟(a)的反應(yīng)溫度為50至250攝氏度；反應(yīng)步驟(b)所用氯化試劑選自:二氯亞砜、草酰氯、三氯氧磷、三氯化磷、五氯化磷、磺酰氯、五氯化磷；反應(yīng)步驟(c)所用硝基還原試劑選自活潑金屬與酸的組合，其中活潑金屬選自：鋅、鐵和錫，酸選自：鹽酸、硫酸、丙酸、乙酸、甲酸、磷酸；反應(yīng)步驟(d)所用縮合試劑選自硼酸、硫酸、N,N'-二環(huán)己基碳二亞胺；反應(yīng)步驟(e)的反應(yīng)溫度為0至50攝氏度。

附圖說明

圖1：化合物對HeLa細胞核HDAC酶的抑制活性

圖2：化合物對腫瘤細胞單克隆形成能力的影響

具體實施方式

本發(fā)明中使用的術(shù)語“烷基”是指僅由碳原子和氫原子組成、且不具有不飽和度(例如雙鍵、三鍵或環(huán))的基團，其涵蓋了各種可能的幾何異構(gòu)基團與立體異構(gòu)基團。該基團通過單間與分子的其余部分向連。作為烷基的非限制性實例，可以列舉以下直鏈或支鏈的基團：甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基及其另外七種異構(gòu)體、正己基及其另外十六種異構(gòu)體、正庚基及其各自異構(gòu)體、正辛基及其各種異構(gòu)體、正壬基及其各種異構(gòu)體。

本發(fā)明中使用的術(shù)語“環(huán)烷基”是指至少3個碳原子組成的飽和非芳基環(huán)系，該環(huán)系可以是單環(huán)、雙環(huán)、多環(huán)，也可以是稠環(huán)、橋環(huán)、螺環(huán)。作為環(huán)烷基的非限制性實例，可以列舉以下基團：環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基、環(huán)辛基、環(huán)壬基；以及由兩個或多個上述單環(huán)通過公共邊和公共碳原子形成的稠環(huán)、橋環(huán)、或螺環(huán)基團。

本發(fā)明中使用的術(shù)語“烯基”是指在上述烷基基團中(除甲基外)存在一個或多個雙鍵的情況下所形成的基團。

本發(fā)明中使用的術(shù)語“炔基”是指在上述烷基基團中(除甲基外)存在一個或多個叁鍵的情況下所形成的基團。

本發(fā)明中使用的術(shù)語“烷氧基”是指氧原子與上述烷基相連、并且通過該氧原子以單鍵連接至分子其余部分的基團，其涵蓋了各種可能的幾何異構(gòu)基團與立體異構(gòu)基團。作為烷氧基的非限制性實例，可以列舉以下直連或支鏈的基團：甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁氧基、仲丁氧基、叔丁氧基、正戊氧基以及另外七種異構(gòu)體、正己氧基以及另外十六種異構(gòu)體、正庚氧基以及各種異構(gòu)體、正辛氧基以及各種異構(gòu)體、正壬氧基以及各種異構(gòu)體。

本發(fā)明中使用的術(shù)語“芳基”是指由至少6個碳原子組成的芳香環(huán)系，該環(huán)系可以是單環(huán)、雙環(huán)、多環(huán)，其中雙環(huán)和多環(huán)可以由單環(huán)通過單鍵連接方式或稠合方式形成。作為芳基的非限制性實例，可以列舉以下基團：苯基、萘基、蒽基、菲基、茚基、芘基、苝基、戊搭烯基、庚搭烯基、三亞苯基、并四苯基、戊芬基、并五苯基、四鄰亞苯基、己芬基、并六苯基、蔻基、三亞萘基、庚芬基、并七苯基、卵苯基、聯(lián)苯基、聯(lián)萘基。

本發(fā)明中使用的術(shù)語“雜芳基”是指具有一個或多個獨立地選自N、O或S的雜原子的5-14元芳香族雜環(huán)環(huán)系，該環(huán)系可以是單環(huán)、雙環(huán)、多環(huán)，其中雙環(huán)和多環(huán)可以由單環(huán)通過單鍵連接方式或稠合方式形成。作為雜芳基的非限制性實例，可以列舉以下基團：噁唑基、異噁唑基、咪唑基、呋喃基、吲哚基、異吲哚基、吡咯基、三唑基、三嗪基、四唑基、噻吩基、噻唑基、異噻唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、噠嗪基、苯并呋喃基、苯并噻唑基、苯并噁唑基、苯并咪唑基、苯并噻吩基、苯并呋喃基、咔唑基、異喹啉基、喹唑啉基、萘啶基、嘌呤基、噻二唑基、吲哚嗪基、吩嗪基、香豆素基、吡啶并吡啶基、吡啶并噠嗪基、咪唑并吡啶基、咪唑并噠嗪基；以及由上述雜芳基通過單鍵連接方式或稠合方式形成的基團。

本發(fā)明中使用的術(shù)語“雜環(huán)基”是指由碳原子和獨立選自N、O或S的雜原子組成的非芳香族3-18元環(huán)系，該環(huán)系可以是單環(huán)、雙環(huán)、或多環(huán)，也可以是稠環(huán)、橋環(huán)、螺環(huán)，并且可以任選地包含一個或多個雙鍵。作為雜環(huán)基的非限制性實例，可以列舉以下基團：吖啶基、苯并二氧雜環(huán)己基、苯并吡喃基、苯并二氫吡喃基、二氧戊環(huán)基、十氫異喹啉基、茚滿基、吲哚啉基、異吲哚啉基、異苯并二氫吡喃基、嗎啉基、哌嗪基、2-氧代哌嗪基、八氫吲哚基、八氫異吲哚基、4-哌啶酮基、二氫喹啉基、二氫異喹啉基、四氫喹啉基、四氫異喹啉基、1-(二苯基甲基)哌嗪基、四氫呋喃基、四氫吡喃基、四氫吡咯基、哌啶基。

本發(fā)明中使用的術(shù)語“鹵素”或“鹵代”是指氟、氯、溴或碘。

通過以下的具體實施方式，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進一步的詳細解釋及展述，使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能夠更加容易地理解本發(fā)明，但不應(yīng)該將此理解為本發(fā)明所述主題的范圍僅限于以下的實例及限制本發(fā)明的任何或所有權(quán)利，更不應(yīng)該背離本發(fā)明的精神。

實施例1：合成本發(fā)明中的一部分化合物

N-{4-[雙(2-氯乙基)氨基]苯基}-N'-羥基辛二酰胺(H101)的制備。

步驟(1)：稱量對氟硝基苯(2.80g，20mmol)和二乙醇胺(10.50g，100mmol)于50ml單口圓底燒瓶中在到118攝氏度下攪拌，薄層層析點板確認反應(yīng)完成后，將反應(yīng)液冷卻至常溫，加入攪拌中冰水中，析出大量固體，過濾得黃色固體3.94g(產(chǎn)率87％)

步驟(2)：稱量步驟(1)中得到的黃色固體(2.76g，12.2mmol)、二氯甲烷(27.5ml)和吡啶(10ml)于100ml三口圓底燒瓶中，將整個反應(yīng)體系至置于冰浴中冷到0攝氏度，用恒壓滴液漏斗滴加二氯亞砜(3.27g，27.5mmol)，薄層層析點板確認反應(yīng)完成后，向反應(yīng)液中加入二氯甲烷400ml，置于分液漏斗中，水洗3次后，二氯甲烷相用無水硫酸鎂干燥，過濾旋蒸后得黃色固體2.93g(產(chǎn)率91％)

步驟(3)：稱量步驟(2)中得到的黃色固體(2.71g，10.3mmol)、鋅粉(2.68g，41.2mmol)、甲醇(25ml)和水(5ml)置于100ml三口圓底燒瓶中，常溫下，用恒壓滴液漏斗滴加稀鹽酸(10.3ml，1mol/L)，滴加完后繼續(xù)常溫攪拌，薄層層析點板確認反應(yīng)完成后，將反應(yīng)液過濾，濾液旋干后，用乙酸乙酯萃取，水洗三次，無水碳酸鉀干燥，過濾，旋干，得灰色固體1.87g(產(chǎn)率78％)

步驟(4)：稱量辛二酸單甲酯(0.58g，3.1mmol)于100ml單口圓底燒瓶中，加入15ml二氯甲烷溶解，加入2滴N,N-二甲基甲酰胺，將整個反應(yīng)體系在冰浴下加入草酰氯，加完后撤冰，常溫攪拌1小時后，將反應(yīng)體系旋干得油狀物。另取一個100ml三口瓶，向其中加入步驟(3)中得到的灰色固體(0.6g，2.51mmol)、四氫呋喃(15ml)、三乙胺(0.34g，3.34mmol)，將之前得到的油狀物用5ml四氫呋喃溶解，冰浴下，用恒壓滴液漏斗將上述油狀物的四氫呋喃溶液滴加到100ml三口瓶中，滴加完后繼續(xù)常溫攪拌，薄層層析點板確認反應(yīng)完成后，將反應(yīng)液旋干后，用400ml乙酸乙酯萃取，水洗2次，每次100ml，飽和碳酸鈉的水溶液洗兩次，每次100ml，隨后乙酸乙酯相用無水硫酸鎂干燥，過濾，旋干得油狀物，通過硅膠柱層析純化后得固體0.64g(產(chǎn)率64％)

步驟(5)：稱量氫氧化鉀(2.47g，44mmol)于100ml單口圓底燒瓶中，加入15ml甲醇，常溫攪拌至氫氧化鉀完全溶解，隨后加入鹽酸羥胺(3.5g，50.4mmol)，將反應(yīng)體系置于35攝氏度水浴攪拌0.5小時，隨后將反應(yīng)體系置于冰浴，加入0.5g步驟4中得到的固體(0.5g，1.2mmol)，繼續(xù)冰浴攪拌，薄層層析點板確認反應(yīng)完成后，將反應(yīng)液加入攪拌中的冰水中，立即析出大量固體，將固體過濾，乙腈重結(jié)晶純化后得固體0.28g(產(chǎn)率57％). ¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝10.35(s,1H),9.58(s,1H),8.66(s,1H),7.42(d,J＝8.9Hz,2H),6.70(d,J＝8.9Hz,2H),3.70(m,8H),2.24(t,J＝7.4Hz,2H),1.95(t,J＝7.4Hz,2H),1.53(m,4H),1.28(m,4H)；¹³C NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝25.0,25.1,28.4,32.2,36.2,41.2,52.3,112.1,120.9,129.7,142.3,170.4ppm；C₁₈H₂₇Cl₂N₃O₃,MS(ES+)m/z:406.39(M+H)⁺.

化合物H102與H134的制備方法與化合物M101相似，只是將步驟(4)中的原料辛二酸單甲酯分別替換為壬二酸單甲酯(化合物H102)(0.63g，3.1mmol)和己二酸單甲酯(0.50g，3.1mmol)

化合物H102和H103的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)如下：

N-{4-[雙(2-氯乙基)氨基]苯基}-N'-羥基己二酰胺(H102)

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝10.36(s,1H),9.59(s,1H),8.67(s,1H),7.41(d,J＝8.7Hz,2H),6.70(d,J＝8.7Hz,2H),3.70(m,8H),2.24(t,J＝6.7Hz 2H),1.97(t,J＝6.0Hz,2H),1.53(m,4H)；¹³C NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝24.8,24.9,32.1,36.0,41.2,52.3,112.1,120.9,129.7,142.3,168.9,170.2ppm；C₁₆H₂₃Cl₂N₃O₃,MS(ES+)m/z:376.12(M+H)⁺.

N-{4-[雙(2-氯乙基)氨基]苯基}-N'-羥基壬二酰胺(H103)

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):δ＝10.33(s,1H),9.58(s,1H),7.41(d,J＝9.0Hz,2H),6.69(d, J＝9.0Hz,2H),3.70(m,8H),2.23(t,J＝7.3Hz 2H),1.94(t,J＝7.4Hz,2H),1.52(m,4H),1.27(m,6H)；C₁₉H₂₉Cl₂N₃O₃,MS(ES+)m/z:418.17(M+H)⁺.

實施例2：化合物抗腫瘤細胞增殖實驗

(1)實驗細胞系，選用五種癌細胞：人皮膚黑色素瘤A375、人宮頸癌細胞HeLa、人肝癌細胞HepG2、人肺癌細胞A549、人結(jié)腸癌細胞HCT116。實驗前，五種癌細胞被保藏在液氮中，首先取出癌細胞，在37攝氏度的水浴鍋中使其快速升溫到37攝氏度，將細胞液離心去除上層凍存液，細胞用培養(yǎng)基重新懸浮后，轉(zhuǎn)移到24mL細胞培養(yǎng)瓶中，每瓶加入6ml培養(yǎng)基于37攝氏度，含5％CO₂的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，(其中人皮膚黑色素瘤A375、肝癌細胞HepG2、人宮頸癌細胞HeLa，在含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，用0.25％胰蛋白酶常規(guī)消化后傳代培養(yǎng)。人肺癌細胞A549和人結(jié)腸癌細胞HCT116在含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，用0.25％胰蛋白酶常規(guī)消化后傳代培養(yǎng)。)等細胞生長達到培養(yǎng)瓶70％-80％左右時，先用PBS洗去培養(yǎng)基，用0.25％胰蛋白酶消化將細胞從培養(yǎng)瓶中脫落下來，加入新鮮培養(yǎng)基離心后，去除上層培養(yǎng)基，再加入新鮮培養(yǎng)基重懸后1：2～3傳代。

(2)當細胞生長穩(wěn)定后，將處于對數(shù)期的癌細胞用胰酶消化成單個細胞后，用新鮮培養(yǎng)基稀釋到(3～4)×10⁴個/ml的細胞密度，在96孔板中，每孔加入90μL的細胞液，在37攝氏度，含5％CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h，加藥(把合成的化合物事先稀釋到一系列不同的濃度，將不同濃度的化合物溶液加入到96孔板中，每個濃度重復(fù)3個復(fù)孔)，72小時后，96孔板中每孔加入10μL CCK-8溶液，再培養(yǎng)1小時后，用BIO-RAD酶標儀測定450nm波長處的吸光度值，通過Graphpad Prism 5軟件擬合得到抑制曲線，最終得到IC₅₀值。

表2：本發(fā)明所合成的化合物對五種不同癌細胞的抑制效果

表2的結(jié)果表明：本發(fā)明合成的含有羥肟酸基團的氮芥類化合物對五種癌細胞均具有強的抑制活性，而且本發(fā)明合成的化合物明顯具有比母體藥物苯丁酸氮芥和鹽酸苯達莫司汀更強的抗腫瘤效果。本專利中合成的含有羥肟酸基團的氮芥類化合物藥效強于母體藥物苯丁酸氮芥5至18倍，比母體藥物鹽酸苯達莫司汀的藥效強7至28倍。

實施例3：化合物對HDAC酶的抑制實驗

使用瑞士Life Sciences公司生產(chǎn)的HDAC綠色熒光測試試劑盒(產(chǎn)品序號：BML-AK53R)進行HeLa細胞核提取物的HDAC酶活性抑制實驗，使用產(chǎn)品序號為BML-AK511的試劑盒進行HDAC1酶活性抑制實驗，使用產(chǎn)品序號為BML-AK512的試劑盒進行HDAC2酶活性抑制實驗，使用產(chǎn)品序號為BML-AK516的試劑盒進行HDAC6酶活性抑制實驗。操作嚴格按照試劑盒說明書進行，15μL的HDAC酶與10μL的待測化合物充分混合，將底物和上述混合物在37攝氏度放置5分鐘以使底物和酶獲得相同的起始溫度，然后每孔快速加入25μL底物，將整個96孔板放置于37攝氏度孵育30-60分鐘，然后向每孔中加入50μL終止液。此后將96孔板放置常溫10分鐘，用酶標儀測熒光強度。得到不同濃度化合物對HDAC酶抑制率后，通過Graphpad Prism 5軟件擬合得到抑制曲線，最終得到IC₅₀值。

圖1的結(jié)果表明：本發(fā)明合成的含有羥肟酸基團的氮芥類化合物對HeLa細胞核提取物的HDAC酶具有強抑制活性(在0.625μM濃度下抑制率達79.8％)，而母體化合物苯丁酸氮芥對HeLa細胞核提取物的HDAC酶沒有抑制活性。

表3：本發(fā)明所合成的化合物對HDAC酶的抑制效果

表4的結(jié)果表明：本發(fā)明合成的含有羥肟酸基團的氮芥類化合物對HDAC1、HDAC2和HDAC6具有強的抑制活性，其中化合物H101對HDAC1和HDAC2酶具有選擇性抑制，其HDAC6/HDAC1選擇性系數(shù)為2.3，HDAC6/HDAC1選擇性系數(shù)為2.6。

實施例4：化合物抗腫瘤細胞單克隆形成實驗

取對數(shù)生長期的人皮膚黑色素瘤細胞A375鋪于6孔板，每孔鋪3500個細胞，立即用2μmol/L、8μmol/L和16μmol/L的苯丁酸氮芥和H101處理細胞，以DMSO處理組為空白對照，7天后，移去每孔的培養(yǎng)基，加入PBS(磷酸鹽緩沖液)輕輕洗2遍，加入3.7％甲醛水溶液固定20min，再用PBS輕輕洗兩遍，0.1％結(jié)晶紫水溶液染色30min，PBS洗3遍，觀察實驗結(jié)果并拍照。

由圖2可看出本發(fā)明合成的化合物H101比母體藥物苯丁酸氮芥具有更強的抗腫瘤細胞單克隆形成的能力。

實施例5：化合物誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡實驗

取對數(shù)生長期的人皮膚黑色素瘤細胞A375鋪于6孔板，每孔鋪16萬個細胞，12h后加入苯丁酸氮芥和H101(濃度為2μmol/L、8μmol/L和16μmol/L)處理細胞，以DMSO處理為對照組，72h后收集每孔的培養(yǎng)基，用胰酶消化收集各孔細胞，1000rpm離心5min，去除離心后的上清，再用PBS洗兩遍，然后加入100μL1×binding buffer緩沖液，5μL of Alexa Fluor 488annexin和1μL的碘化丙錠(100μg/ml)，避光室溫孵育15min，以Alexa Fluor 488annexin和碘化丙錠單染的組別作為對照組，樣品用MoFlo XDP流式細胞儀檢測。

誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的結(jié)果顯示：本發(fā)明合成的化合物H101在2μmol/L、8μmol/L和16μmol/L濃度下能夠分別誘導(dǎo)15.6％、49.2％和69.6％的人皮膚黑色素瘤細胞A375發(fā)生凋亡，而母體藥物苯丁酸氮芥在2μmol/L、8μmol/L和16μmol/L濃度下僅能夠誘導(dǎo)9.9％、12.9％和28.9％的人皮膚黑色素瘤細胞A375凋亡。由此可見本發(fā)明所合成的化合物具有比母體藥物苯丁酸氮芥明顯更強的誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的能力。

實施例6：化合物阻斷腫瘤細胞周期實驗

取對數(shù)生長期的A375人皮膚黑色素瘤細胞鋪于6孔板，每孔鋪16萬個細胞，12h后加入苯丁酸氮芥和H101(濃度為8μmol/L)處理細胞，以DMSO處理為對照組，72h后收集每孔的培養(yǎng)基，用胰酶消化收集各孔細胞，1000rpm離心5min，去除離心后的上清，再用PBS洗兩遍，細胞用70％乙醇固定，PBS洗兩遍，加入RNA酶37℃避光孵育30min，樣品用MoFlo XDP流式細胞儀檢測。

結(jié)果顯示本發(fā)明合成的化合物H101在8μmol/L濃度下能顯著將人皮膚黑色素瘤細胞A375抑制在G2/M期，(加DMSO處理的對照組癌細胞處于G2/M期的比例為12.6％，經(jīng)過8μmol/L化合物H101處理后，處于G2/M期癌細胞的比例增加到62.5％，而使用苯丁酸氮芥處理后，人皮膚黑色素瘤細胞A375處于G2/M期的比例僅增加到47.7％) 。