本發(fā)明屬于柑橘黃龍病病原物檢測技術領域，具體涉及一種用于檢測黃龍病的環(huán)介導等溫擴增引物組及試劑盒。

背景技術：

柑橘黃龍病是世界柑橘生產(chǎn)上的毀滅性病害。柑橘黃龍病病原物為革蘭氏陰性桿菌，能夠侵染包括柑橘屬、枳屬、金柑屬和九里香等多種蕓香科植物并產(chǎn)生毀滅性后果，危害極大。被黃龍病病菌感染的植株無有效治愈方法，只能砍伐以防止疫情繼續(xù)擴散，給養(yǎng)殖戶帶來巨大的損失。

目前針對黃龍病的診斷方法及其優(yōu)缺點如下：

1、田間診斷—簡易，但易混淆，不太容易與其他病害區(qū)分；

2、電鏡檢測—需要昂貴的儀器和實驗室，容易漏檢；

3、免疫學檢測—需要實驗室和儀器，周期長；

4、分子檢測—準確快速，但前處理復雜，需要昂貴設備，對技術人員要求較高。

目前還沒有一種能夠快速、準確地檢測黃龍病的方法。

技術實現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術存在的上述問題，本發(fā)明提供了一種能夠快速、準確地檢測黃龍病的環(huán)介導等溫擴增引物組及試劑盒。

本發(fā)明所采用的技術方案為：一種用于檢測黃龍病的環(huán)介導等溫擴增引物組，包括引物P1、引物P2、引物P3、引物P4、引物P5和引物P6，所述引物P1的序列如SEQ ID NO：1所示，所述引物P2的序列如SEQ ID NO：2所示，所述引物P3的序列如SEQ ID NO：3所示，所述引物P4的序列如SEQ ID NO：4所示，所述引物P5的序列如SEQ ID NO：5所示，所述引物P6的序列如SEQ ID NO：6所示。

其中，SEQ ID NO：1的序列為：TCATGCCATCAGATGTGC；

SEQ ID NO：2的序列為：GTAACGTCAATTGCTGCG；

SEQ ID NO：3的序列為：CCGTAGGAGTCTGGACCGTGCTGGTCTGAGAGGATGA；

SEQ ID NO：4的序列為：CCATGCCGCGTGTATGAAGATATTAACCACAACACCTTCCTC；

SEQ ID NO：5的序列為：TCAGTTCCAGTGTGGCTG；

SEQ ID NO：6的序列為：GGCCTTCGGGTTGTAAAGTA。

本申請的發(fā)明人，根據(jù)黃龍病病菌特有的靶序列，設計出一對內(nèi)引物(引物P1和引物P2)、一對外引物(引物P3和引物P4)和一對環(huán)引物(引物P5和引物P6)，能夠特異性識別靶序列上的8個獨立區(qū)域，利用特異性聚合酶啟動循環(huán)鏈置換反應，在基因序列啟動互補鏈合成，在同一鏈上互補序列周而復始形成有很多環(huán)的花椰菜結構的莖環(huán)DNA混合物，用于后續(xù)的定性和定量分析。

本發(fā)明還提供了一種含有所述環(huán)介導等溫擴增引物組的試劑盒，所述試劑盒還包括反應液，所述反應液包括反應濃縮液和逆轉(zhuǎn)錄酶；所述反應濃縮液包括DNA聚合酶，酶緩沖液，dNTP，MgSO₄，甘氨酸三甲胺內(nèi)鹽和熒光染料。

所述試劑盒能夠快速、準確的檢測出柑橘是否被黃龍病病原物感染。

使用所述試劑盒檢測黃龍病病原物的方法，包括以下步驟：

(1)樣品處理：取疑似感染黃龍病的柑橘葉片，破碎后提取核酸并稀釋，作為樣品；

(2)引物處理：將引物P1、引物P2、引物P3、引物P4、引物P5和引物P6等體積混合，得到引物試劑，在混合前，所述引物P1和引物P2的濃度為40nM，引物P3和引物P4的濃度為5nM、引物P5和引物P6的濃度為20nM；

(3)環(huán)介導等溫擴增反應：將樣品、引物試劑和反應液混合均勻后，放入等溫擴增熒光檢測系統(tǒng)，在65℃下，進行環(huán)介導等溫擴增反應30分鐘；

(4)溶解曲線分析：在環(huán)介導等溫擴增反應過程中，對cDNA的濃度進行分析，得到擴增曲線和溶解曲線；

(5)結果判斷：根據(jù)所獲得擴增曲線和溶解曲線判定，若擴增曲線為明顯的S型曲線，以及溶解曲線峰型單一且較為尖銳，則判定為陽性結果；擴增曲線沒有出現(xiàn)明顯S型曲線，則判定為陰性結果；擴增曲線有明顯S型曲線，但溶解曲線峰型不單一，則判定為非特異性擴增。

需要說明的是，核酸的等溫擴增法屬于核酸體外擴增諸多方法中的一類，在核酸擴增過程中溫度恒定不變，即不需要環(huán)境溫度的反復變化即可完成DNA的復制和擴增，其技術的核心在于其獨特的引物結構和擴增方式以及具有特殊活性的DNA聚合酶的使用，本申請中使用的是等溫擴增熒光法。

等溫擴增熒光法(Isothermal Amplification Fluorescent Identification Method)是核酸等溫擴增和熒光技術的結合，其反應過程在恒溫條件下進行，通過添加有特殊鏈置換活性的DNA聚合酶和針對目標基因特異性片段設計的特異性引物組使核酸擴增得以在恒溫條件下來完成，同時在體系中加入熒光基團即熒光標記物，該熒光標記物能特異性結合到DNA雙鏈氫鍵的小溝部分，且結合到DNA雙鏈之后可被激發(fā)并發(fā)出特殊波長的熒光，該熒光標記物在單獨存在的情況下不會被激發(fā)且只與DNA雙鏈結合，故體系中的熒光強度即代表了體系中DNA雙鏈的濃度，最后通過熒光信號累積實時監(jiān)控整個核酸擴增過程，實現(xiàn)核酸擴增的實時監(jiān)測，核酸復制擴增反應結束后可對產(chǎn)物做退火溶解曲線分析，溶解曲線可進一步堅定該核酸擴增產(chǎn)物是否是特異性擴增。結合技術的應用，實現(xiàn)了在確保實驗結果準確性，該方法是一種高特異性的快速擴增法，非常適合黃龍病的田間快速檢測。

因體系中加入了能特異性與DNA雙鏈集合的熒光物質(zhì)，故隨著擴增的不斷進行和產(chǎn)物的累積，能實時監(jiān)測整個擴增反應的全過程并做到定性和簡單的定量分析。

為進一步增加檢測的準確性，方便實驗人員對照使用，優(yōu)選的技術方案是，所述試劑盒還包括對照物，所述對照物包括陽性對照物和陰性對照物。在檢測時，同時使用陽性對照物和陰性對照物作為樣本進行檢測，當陽性對照物的檢測結果是陽性結果，且陰性對照物的檢測結果是陰性結果時，則本次測試有效，否則本次測試無效。

根據(jù)本發(fā)明的一個實施例，所述陽性對照物為含目的基因的大腸桿菌質(zhì)粒DNA片段，所述目的基因的序列如SEQ ID NO：7所示；所述陰性對照物為反應液或雙蒸水。

SEQ ID NO：7的序列為：TTCGGGCCTC ATGCCATCAG ATGTGCCCAG ATGGGATTAG CTAGTAGGTG GGGTAACGGCTCACCTAGGC GACGATCCCT AGCTGGTCTG AGAGGATGAC CAGCCACACT GGAACTGAGACACGGTCCAG ACTCCTACGG GAGGCAGCAG TGGGGAATAT TGCACAATGG GCGCAAGCCTGATGCAGCCA TGCCGCGTGT ATGAAGAAGG CCTTCGGGTT GTAAAGTACT TTCAGCGGGGAGGAAGGTGT TGTGGTTAAT AACCGCAGCA ATTGACGTTA CCCGCAGAAG AAGCACCGGC。

為方便使用，所述引物P1和引物P2的濃度為40nM，引物P3和引物P4的濃度為5nM、引物P5和引物P6的濃度為20nM。所述環(huán)介導等溫擴增引物組的體積為6ul，所述反應液的體積為15ul，所述環(huán)介導等溫擴增引物組中各引物的體積均為1ul。

本發(fā)明的有益效果為：

1、本發(fā)明提供了一種能夠快速、準確地檢測黃龍病的環(huán)介導等溫擴增引物組，能夠特異性識別靶序列上的8個獨立區(qū)域，利用特異性聚合酶啟動循環(huán)鏈置換反應，在基因序列啟動互補鏈合成，在同一鏈上互補序列周而復始形成有很多環(huán)的花椰菜結構的莖環(huán)DNA混合物，用于后續(xù)的定性和定量分析。

2、本發(fā)明還公開了一種含有所述環(huán)介導等溫擴增引物組的試劑盒，所述試劑盒適合在實驗室或其他地點進行快速篩查和檢測，擴大了適用范圍。

3、因體系中加入了能特異性與DNA雙鏈集合的熒光物質(zhì)，故隨著擴增的不斷進行和產(chǎn)物的累積，能實時監(jiān)測整個擴增反應的全過程并做到定性和簡單的定量分析。

附圖說明

圖1為使用所述試劑盒檢測柑橘是否被黃龍病病原物感染的方法流程示意圖；

圖2是實施例4中準確性驗證中的擴增曲線；

圖3是實施例4中準確性驗證中的溶解曲線。。

具體實施方式

下面結合實施例，更具體地說明本發(fā)明的內(nèi)容。應當理解，本發(fā)明的實施并不局限于下面的實施例，對本發(fā)明所做的任何形式上的變通和/或改變都將落入本發(fā)明保護范圍。

在本發(fā)明中，若非特指，所有的份、百分比均為重量單位，所有的設備和原料等均可從市場購得或是本行業(yè)常用的。下述實施例中的方法，如無特別說明，均為本領域的常規(guī)方法。

實施例1

一種用于檢測黃龍病的環(huán)介導等溫擴增引物組，包括引物P1、引物P2、引物P3、引物P4、引物P5和引物P6，所述引物P1的序列如SEQ ID NO：1所示，所述引物P2的序列如SEQ ID NO：2所示，所述引物P3的序列如SEQ ID NO：3所示，所述引物P4的序列如SEQ ID NO：4所示，所述引物P5的序列如SEQ ID NO：5所示，所述引物P6的序列如SEQ ID NO：6所示。

實施例2

一種含有實施例1所述環(huán)介導等溫擴增引物組的試劑盒，所述試劑盒還包括反應液和對照組，所述反應液包括DNA聚合酶、緩沖液、dNTPS、MgSO4和甘氨酸三甲胺內(nèi)鹽；所述對照物包括陽性對照物和陰性對照物，所述陽性對照物為含目的基因的大腸桿菌質(zhì)粒DNA片段，所述目的基因的序列如SEQ ID NO：7所示，所述陰性對照物為反應液或雙蒸水。

一般來說，引物試劑的濃度需要使用前配置，為方便使用，所述引物P1和引物P2的濃度為40nM，引物P3和引物P4的濃度為5nM、引物P5和引物P6的濃度為20nM。所述環(huán)介導等溫擴增引物組的體積為6ul，所述反應液的體積為15ul，所述環(huán)介導等溫擴增引物組中各引物的體積均為1ul。

本實施例中，反應液直接使用Optigene公司的IMM。當然本領域技術人員也能夠使用其他反應液，在此就不在贅述。

所述試劑盒能夠快速、準確的檢測出柑橘是否被黃龍病病原物感染。

實施例3

圖1為使用實施例2所述試劑盒檢測柑橘是否被黃龍病病原物感染的方法流程示意圖，所述方法包括以下步驟：

(1)樣品處理：取疑似感染黃龍病的柑橘葉片，液氮冷凍破碎或機械破碎后，加入1ml細胞裂解液提取析出的核酸，并稀釋，作為樣品；

(2)引物處理：將引物P1、引物P2、引物P3、引物P4、引物P5和引物P6等體積混合，得到引物試劑，在混合前，所述引物P1和引物P2的濃度為40nM，引物P3和引物P4的濃度為5nM、引物P5和引物P6的濃度為20nM；

(3)環(huán)介導等溫擴增反應：將樣品、引物試劑和反應液混合均勻后，作為檢測組；將陽性對照物、引物試劑和反應液混合均勻后，作為陽性對照組；將陰性對照物、引物試劑和反應液混合均勻后，作為陰性對照組；將檢測組、陽性對照組和陰性對照組放入等溫擴增熒光檢測系統(tǒng)(英國Optigene公司Genie II型)在65℃下，進行環(huán)介導等溫擴增反應60分鐘；其中，擴增總體系為25ul，其中所述環(huán)介導等溫擴增引物組的體積為6ul，所述反應液的體積為15ul，余量為水。

所述反應液為英國Optigene公司的IMM(Isothermal Master Mix)；所述陽性對照物為含目的基因的大腸桿菌質(zhì)粒DNA片段，所述目的基因的序列如SEQ ID NO：7所示；所述陰性對照物為雙蒸水。

(4)溶解曲線分析：在環(huán)介導等溫擴增反應過程中，對cDNA的濃度進行分析，得到擴增曲線和溶解曲線；

(5)根據(jù)所獲得擴增曲線和溶解曲線判定，若擴增曲線為明顯的S型曲線，以及溶解曲線與標準菌株在正負005℃以內(nèi)，則判定為陽性結果；擴增曲線沒有出現(xiàn)明顯S型曲線，則判定為陰性結果；擴增曲線有明顯S型曲線，但與標準菌株超過正負005℃，則判定為非特異性擴增。在檢測時，同時使用陽性對照物和陰性對照物作為樣本進行檢測，當陽性對照物的檢測結果是陽性結果，且陰性對照物的檢測結果是陰性結果時，則本次測試有效，否則本次測試無效。

與傳統(tǒng)方法對比，本實施例中的方法具有一下幾點明顯優(yōu)勢特點：

1、速度快：核酸提取時間僅需一兩分鐘，上機檢測時間只需半小時；

2、特異性好：針對黃龍病菌的特異性核酸片段進行檢測，在基因水平的檢測比其他常規(guī)生理生化方法和田間經(jīng)驗判定等方法具有無法比擬的優(yōu)勢；

3、判定方法簡單：實時熒光曲線和溶解曲線一目了然，無需復雜的專業(yè)經(jīng)驗和技術背景；

4、檢測過程無毒無害：整個實驗過程所使用的儀器和試劑均無任何毒性和傳染性，不會對人體健康造成威脅。

實施例4

本實施例為實施例3中所述方法的準確性驗證。

使用實施例3中的檢測方法，用健康柑橘樹葉和感染黃龍病的柑橘樹葉，分別破碎后提取核酸并稀釋，作為樣品分別檢測。結果顯示，健康柑橘樹葉的擴增曲線沒有出現(xiàn)明顯S型曲線，則判定為陰性結果，感染黃龍病的柑橘樹葉的擴增曲線為明顯的S型曲線，判定為陽性結果。

最后所應說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，所應理解的是，以上所述僅為本發(fā)明的具體實施方式而已，并不用于限定本發(fā)明的保護范圍，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 張薇

<120> 一種用于檢測黃龍病的環(huán)介導等溫擴增引物組及試劑盒

<130> 2010

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 未知

<400> 1

tcatgccatc agatgtgc 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 未知

<400> 2

gtaacgtcaa ttgctgcg 18

<210> 3

<211> 37

<212> DNA

<213> 未知

<400> 3

ccgtaggagt ctggaccgtg ctggtctgag aggatga 37

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 未知

<400> 4

ccatgccgcg tgtatgaaga tattaaccac aacaccttcc tc 42

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 未知

<400> 5

tcagttccag tgtggctg 18

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 未知

<400> 6

ggccttcggg ttgtaaagta 20

<210> 7

<211> 300

<212> DNA

<213> 未知

<400> 7

ttcgggcctc atgccatcag atgtgcccag atgggattag ctagtaggtg gggtaacggc 60

tcacctaggc gacgatccct agctggtctg agaggatgac cagccacact ggaactgaga 120

cacggtccag actcctacgg gaggcagcag tggggaatat tgcacaatgg gcgcaagcct 180

gatgcagcca tgccgcgtgt atgaagaagg ccttcgggtt gtaaagtact ttcagcgggg 240

aggaaggtgt tgtggttaat aaccgcagca attgacgtta cccgcagaag aagcaccggc 300