本發(fā)明屬于藥物化學(xué)領(lǐng)域，涉及1-(2-(取代基氨基)-5,8-二氫吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-基)-3-取代基丙-2-烯-1-酮類化合物及其制備方法和應(yīng)用。具體地說，是涉及不同取代基的1-(2-(取代基氨基)-5,8-二氫吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-基)-3-取代基丙-2-烯-1-酮類化合物及其制備方法和作為用于JAK3抑制劑的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
JAK-STAT(signal transducer and activators of transcription)通路信號傳遞在包括造血細(xì)胞在內(nèi)的多種類型細(xì)胞的分化、增殖和存活中起著重要作用。JAK-STAT通路中，JAK蛋白與細(xì)胞因子受體近膜端連接，當(dāng)細(xì)胞因子與其受體結(jié)合后，很可能導(dǎo)致受體胞內(nèi)區(qū)域發(fā)生構(gòu)象變化，與之相連接的JAK蛋白則發(fā)生自磷酸化，激活其激酶活性。活化的JAK蛋白將受體中特定酪氨酸進行磷酸化，誘導(dǎo)其構(gòu)象變化，含有SH2結(jié)構(gòu)域的蛋白則通過該結(jié)構(gòu)域內(nèi)的磷酸酪氨酸結(jié)合位點與受體中磷酸化的酪氨酸結(jié)合。由于STAT蛋白含有SH2結(jié)構(gòu)域，因而可以被募集到受體并被活化，以同源或異源二聚體的形式進入細(xì)胞核，激活目的基因的轉(zhuǎn)錄進而影響基因表達水平，從而對造血以及免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)等細(xì)胞內(nèi)過程產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用。而許多疾病的發(fā)生伴隨了JAK活性的異常增強或降低，如免疫缺陷、炎性疾病、血液疾病、自身免疫及骨髓增殖紊亂等，表明JAKs在這些疾病的發(fā)生及進展中起著重要作用。JAK蛋白是該通路中的重要成員，而其活性的異常提高往往導(dǎo)致疾病的發(fā)生。
JAK是一種蛋白酪氨酸激酶(PTK)，迄今為止共發(fā)現(xiàn)4種家族成員:JAK1，JAK2，JAK3和TYK2。JAK-1、JAK-2和TYK-2在人體各組織細(xì)胞中均有表達，JAK-3主要表達于各造血組織細(xì)胞中，主要存在于骨髓細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、NK細(xì)胞及活化的B淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞中。JAK-3通過與IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21等I型細(xì)胞因子受體復(fù)合物中的γ鏈(γc)相結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞信號傳導(dǎo)。
JAK3在JAK-STAT信號傳遞中具有重要作用，JAK3的突變或缺失往往導(dǎo)致嚴(yán)重的后果，如重癥聯(lián)合免疫缺陷(SCID)，對遺傳性SCID患者的分析表明其中7％～14％的患者攜帶有JAK3基因的純合突變，這些突變可能導(dǎo)致了JAK3表達或者功能的改變。此外，淋巴細(xì)胞分泌的數(shù)種白細(xì)胞介素具有促炎、抗炎的作用，在軟骨組織的損傷修復(fù)中具有重要作用，而JAK3在淋巴細(xì)胞中高表達，在JAK-STAT信號傳遞及淋巴細(xì)胞功能調(diào)節(jié)中具有關(guān)鍵作用，因而JAK3在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis)的發(fā)病及治療中也均是重要的因素。同時，由于JAK-STAT信號通路的廣泛調(diào)節(jié)作用，銀屑病、強直性脊柱炎、干眼癥、克羅恩病等很多疾病的發(fā)生也涉及了JAK3的作用，由此JAK3作為信號傳遞成員在疾病發(fā)生中起到了關(guān)鍵作用。
由于JAK3在細(xì)胞因子信號傳遞中具有極其重要的作用，且其僅在特定的組織中進行表達，因而抑制JAK3活性后導(dǎo)致免疫抑制但不會引發(fā)更多的非正常生理變化，也就意味著在疾病治療中導(dǎo)致不良反應(yīng)的概率更低，這使得JAK3成為研究免疫抑制劑的重要靶標(biāo)。近些年來，JAK3已經(jīng)成為非常有前景的藥物靶點。因此，開發(fā)以JAK3為靶點的抑制劑成為藥物化學(xué)界研究的熱點并且已經(jīng)有大量的JAK3抑制劑被報道出來。目前已有數(shù)個JAK3選擇性抑制劑在疾病的治療中表現(xiàn)出良好的療效和光明的應(yīng)用前景。
從目前整體的研究來看，現(xiàn)有的JAK3抑制劑具有良好的治療效果的同時，產(chǎn)生了一定的不良反應(yīng)，這需要進行進一步的研究。已經(jīng)被FDA批準(zhǔn)的托法替尼，在特定測試條件下其并沒有表現(xiàn)出顯著的JAK3選擇性。使用該藥物后導(dǎo)致患者中出現(xiàn)感染的機會增加，而這種不良反應(yīng)很可能是由于托法替尼對JAK2抑制活性所造成。因而提高JAK3抑制劑的選擇性可能會顯著降低部分抑制劑不良反應(yīng)發(fā)生的幾率。
現(xiàn)在對于JAK3抑制劑的研究已經(jīng)十分火熱，但最終能都上市的藥物仍然不多，獲得的渠道也十分有限，并且已上市的藥物在使用中會出現(xiàn)耐藥性和副作用等問題，因此研究新型的JAK3抑制劑有重要意義。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供1-(2-(取代基氨基)-5,8-二氫吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-基)-3-取代基丙-2-烯-1-酮類化合物及其制備方法和作為用于JAK3抑制劑的應(yīng)用。
本發(fā)明提供了式(I)表示的1-(2-(取代基氨基)-5,8-二氫吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-基)-3-取代基丙-2-烯-1-酮類化合物或者其藥學(xué)上可接受的鹽或其前藥分子：
其中，
R1表示-H，C1-C3的脂肪烴；
R2表示-H，氨基取代的C1-C3的脂肪烴，含1-2個N或O雜原子的C4-C6環(huán)烷烴；
本發(fā)明化合物均具有對JAK3激酶的抑制作用，可作為JAK3抑制劑應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了1-(2-(取代基氨基)-5,8-二氫吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-基)-3-取代基丙-2-烯-1-酮類化合物的制備方法，包括以下步驟：
(a)N-叔丁氧羰基-3-哌啶酮溶于N,N-二甲基甲酰胺中，加入N,N-二甲基甲酰胺二甲基縮醛，，加熱反應(yīng)，生成式(II)表示的4-[(二甲氨基)亞甲基]-3-氧代-1-哌啶羧酸叔丁酯；
(b)將S-甲基異硫脲硫酸鹽和乙醇鈉溶于乙醇中，攪拌半小時后，加入式(II)化合物，加熱回流進行反應(yīng)，生成式(III)表示的化合物2-甲硫基-5,8-二氫吡啶并[3,4-d]嘧啶
-7(6H)-甲酸叔丁酯；
(c)將式(III)表示的化合物溶于二氯甲烷中，在0℃下加入間氯過氧苯甲酸，常溫攪拌反應(yīng)生成式(IV)表示的2-(甲基磺?；?-5,8-二氫吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-甲酸叔丁酯；
(d)將式(IV)表示的化合物與R1取代胺溶于乙醇中，加熱回流，反應(yīng)生成式(V)表示的2-(取代基氨基)-5,8-二氫吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-甲酸叔丁酯；
其中，R1表示-H，C1-C3的脂肪烴；
(e)將式(V)表示的化合物溶于二氯甲烷中，加入氯化氫的飽和乙酸乙酯溶液，常溫反應(yīng)，生成(VI)表示的N-取代基-5,6,7,8-四氫吡啶并[3,4-d]嘧啶-2-胺；
(f)將式(VI)表示的化合物溶于二氯甲烷中，在0℃下加入R2取代丙烯酰氯和三乙胺，在0℃下反應(yīng)2小時后，生成(I)表示的1-(2-(取代基氨基)-5,8-二氫吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-基)-3-取代基丙-2-烯-1-酮；
其中，R1取代胺R1NH2、R2取代丙烯酰氯：
本發(fā)明方法使用工業(yè)上普通的試劑和常規(guī)的生產(chǎn)條件，反應(yīng)條件溫和，步驟簡單。
上述合成過程中的化學(xué)反應(yīng)式如下：
Reagents and conditions:
(a)N,N-Dimethylformamide dimethyl acetal,DMF,80℃,12h；(b)Carbamimidothioic acid,EtONa,EtOH,80℃,12h；(c)1)mCPBA,DCM,r.t,12h,2)NaHCO3,Na2S2O3,2h；(d)NH2R1,EtOH,80℃；(e)HCl/EA,r.t,3h；(f)Et3N,DCM,0℃,2h.
本發(fā)明還提供一種治療免疫系統(tǒng)疾病和癌癥的藥用化合物或組合物，其由上述式(I)所述化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或其前藥分子與藥學(xué)上可接受的載體組成。
所述免疫系統(tǒng)疾病和癌癥為風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、肺損傷、哮喘、胰腺炎、高血壓、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、食道癌、慢性粒細(xì)胞白血病、急性髓細(xì)胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、膽道癌肉瘤、腦瘤、子宮內(nèi)膜癌、B細(xì)胞和T細(xì)胞淋巴瘤、淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、晚期或轉(zhuǎn)移的實體瘤、轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌、肺炎、特發(fā)性肝纖維化、抗血小板作用中的任一種。
下面代表性實例包含重要的信息，例證和指導(dǎo)，可適應(yīng)于本發(fā)明化合物的各種實施方式及其等同物的實施做法。這些實施例是為了幫助說明本發(fā)明，而并不旨在，也不應(yīng)被解釋為限制其范圍。
附圖說明
圖1交叉轉(zhuǎn)移的方法示意圖。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步說明，但本發(fā)明并不限于以下實施例。
實施例1
1-(2-(甲基氨基)-5,8-二氫吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-基)丙-2-烯-1-酮的制備(A-1)
步驟1)4-((二甲基氨基)亞甲基)-3-氧代哌啶-1-甲酸叔丁酯的制備
將原料N-叔丁氧基-3-哌啶酮(10g,50.2mmol)溶于N,N-二甲基甲酰胺(40mL)中邊攪拌邊加入N,N-二甲基甲酰胺二甲基縮醛(6g,50mL)。加完后，反應(yīng)混合物加熱至80℃反應(yīng)12小時。TLC監(jiān)測反應(yīng)完成，冷卻至室溫，加入到乙酸乙酯(150mL)和水(50mL)中，有機相用飽和食鹽水(50mL)洗滌兩次，無水硫酸鈉干燥過濾，減壓蒸去溶劑得到橙色粗產(chǎn)物(13g)直接進行下一步反應(yīng)。ESI-MS m/z:255.1[M+H]+.
步驟2)2-甲硫基-5,8-二氫吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-甲酸叔丁酯的制備
常溫下將S-甲基異硫脲硫酸鹽(6.98g,25.1mmol)和乙醇鈉(3.28g,40mmol)溶于乙醇(40mL)中，攪拌半小時后，加入上部合成的中間體(13g,50.2mmol)的乙醇溶液(10mL)。將體系加熱至回流反應(yīng)12小時。TLC監(jiān)測反應(yīng)完成，冷卻至室溫，減壓蒸餾，濃縮物用水洗，乙酸乙酯萃取，有機相用水和飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾并真空濃縮，得到粗產(chǎn)物。粗品經(jīng)柱層析精制得橙色油狀物(7.38g,52％)。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ1.47(9H,s),1.90(2H,m),2.48(3H,s),2.81(2H,t,J＝6.6Hz),3.66(2H,m),8.85(1H,s).ESI-MS m/z:282.0[M+H]+.
步驟3)2-(甲基磺?；?-5,8-二氫吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-甲酸叔丁酯的制備
將2-甲硫基-5,8-二氫吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-甲酸叔丁酯(7.38g,26.3mmol)溶于二氯甲烷(50mL)中。在0℃下邊攪拌邊加入間氯過氧苯甲酸(85％,11.1g,54.5mmol)。在室溫下攪拌12小時后，加入碳酸氫鈉(10mL)和硫代硫酸鈉(10mL)的飽和水溶液，常溫攪拌2小時，有機相減壓濃縮，經(jīng)柱層析精制得白色固體(5.5g,67％)。
ESI-MS m/z:312.2[M-H]-.
步驟4)2-甲基氨基-5,8-二氫吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-甲酸叔丁酯的制備
將2-(甲基磺?；?-5,8-二氫吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-甲酸叔丁酯(1g,3.19mmol)和甲胺的甲醇溶液(2mol/L,1.25mL,2.5mmol)在攪拌下依次溶于乙醇(10mL)中，加熱回流，反應(yīng)12小時后，冷卻至室溫。減壓旋干溶劑，粗產(chǎn)物經(jīng)柱層析精制，得白色固體(700mg,83％)。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ1.44(9H,s),2.92(2H,t,J＝5.8Hz),3.39(3H,s),3.66(2H,t,J＝5.7Hz),4.66(2H,s),8.88(1H,s).ESI-MS m/z:265.1[M+H]+.
步驟5)N-甲基-5,6,7,8-四氫吡啶并[3,4-d]嘧啶-2-胺的制備
將2-甲基氨基-5,8-二氫吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-甲酸叔丁酯(700mg,2.65mmol)溶于少量二氯甲烷中，加入氯化氫的乙酸乙酯溶液(3mL)常溫攪拌約3小時，減壓旋干溶劑，溶質(zhì)加入到飽和碳酸氫鈉水溶液(5mL)和二氯甲烷(20mL)中，有機相用飽和食鹽水洗滌(5mL)，無水硫酸鈉干燥過濾后，旋干得到白色固體(391mg,90％)。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ2.47(2H,d,J＝5.8Hz),2.74(3H,d,J＝4.8Hz),2.88(2H,t,J＝5.8Hz),3.61(2H,s),6.69(1H,q,J＝4.8Hz),7.99(1H,s).ESI-MS m/z:165.1[M+H]+.
步驟6)1-(2-(甲基氨基)-5,8-二氫吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-基)丙-2-烯-1-酮的制備
將N-甲基-5,6,7,8-四氫吡啶并[3,4-d]嘧啶-2-胺(50mg,0.305mmol)溶于二氯甲烷(3mL)中。在0℃下依次加入丙烯酰氯(42mg,0.458mmol)和三乙胺(61.6mg,0.61mmol)，在0℃下反應(yīng)約2小時后，減壓旋干溶劑，粗產(chǎn)物經(jīng)柱層析精制，得到白色固體(47mg,70％)。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ2.60(2H,m),2.77(3H,d,J＝4.8Hz),3.78(2H,m),4.52(2H,d,J＝34.4Hz),5.73(1H,m),6.15(1H,dd,J＝16.6Hz),6.92(2H,m),8.11(1H,s).
ESI-MS m/z:219.2[M+H]+.
實施例2
4-(二甲基氨基)-1-(2-(甲基氨基)-5,8-二氫吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-基)丁-2-烯-1-酮的制備(A-2)
步驟1)至步驟5)同實施例1。
將N-甲基-5,6,7,8-四氫吡啶并[3,4-d]嘧啶-2-胺(50mg,0.305mmol)溶于二氯甲烷(3mL)中。在0℃下依次加入4-(二甲基氨基)丁-2-烯酰氯(67mg,0.458mmol)和三乙胺(61.6mg,0.61mmol)，在0℃下反應(yīng)約2小時后，減壓旋干溶劑，粗產(chǎn)物經(jīng)柱層析精制，得到白色固體(59mg,70％)。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ2.23(6H,s),2.54-2.69(2H,m),2.76(3H,d,J＝4.7Hz),3.17(2H,d,J＝5.9Hz),3.64-3.81(2H,m),4.51(2H,d,J＝32.9Hz),6.55-6.81(2H,m),6.93(1H,d,J＝6.1Hz),8.11(1H,s).ESI-MS m/z:276.2[M+H]+.
實施例3
1-(2-(甲基氨基)-5,8-二氫吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-基)-4-(吡咯烷-1-基)丁-2-烯-1-酮的制備(A-3)
步驟1)至步驟5)同實施例1。
將N-甲基-5,6,7,8-四氫吡啶并[3,4-d]嘧啶-2-胺(50mg,0.305mmol)溶于二氯甲烷(3mL)中。在0℃下依次加入4-(吡咯烷-1-基)丁-2-烯酰氯(79mg,0.458mmol)和三乙胺(61.6mg,0.61mmol)，在0℃下反應(yīng)約2小時后，減壓旋干溶劑，粗產(chǎn)物經(jīng)柱層析精制，得到白色固體(64mg,70％)。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ1.69(4H,t,J＝4.5Hz),2.46(3H,s),2.76(4H,d,J＝4.7Hz),3.19(5H,dd,J＝27.1,4.2Hz),3.74(2H,d,J＝17.9Hz),4.50(2H,d,J＝29.5Hz),6.69(2H,s),6.92(1H,s),8.10(1H,s).ESI-MS m/z:302.2[M+H]+.
實施例4
1-(2-(甲基氨基)-5,8-二氫吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-基)-4-嗎啉代丁-2-烯-1-酮的制備(A-4)
步驟1)至步驟5)同實施例1。
將N-甲基-5,6,7,8-四氫吡啶并[3,4-d]嘧啶-2-胺(50mg,0.305mmol)溶于二氯甲烷(3mL)中。在0℃下依次加入4-嗎啉代丁-2-烯酰氯(86mg,0.458mmol)和三乙胺(61.6mg,0.61mmol)，在0℃下反應(yīng)約2小時后，減壓旋干溶劑，粗產(chǎn)物經(jīng)柱層析精制，得到白色固體(68mg,70％)。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ2.36(4H,s),2.63(2H,s),2.76(3H,d,J＝4.7Hz),3.14(2H,dd,J＝21.2,5.6Hz),3.58(4H,t,J＝4.5Hz),3.74(2H,d,J＝18.3Hz),4.50(2H,d,J＝32.6Hz),6.61-6.73(1H,m),6.92(1H,s),7.66-7.76(1H,m),8.11(1H,s).
ESI-MS m/z:318.3[M+H]+.
實施例5
1-(2-(甲基氨基)-5,8-二氫吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-基)-4-(4-甲基哌嗪-1-基)丁-2-烯-1-酮(A-5)
步驟1)至步驟5)同實施例1。
將N-甲基-5,6,7,8-四氫吡啶并[3,4-d]嘧啶-2-胺(50mg,0.305mmol)溶于二氯甲烷(3mL)中。在0℃下依次加入4-(4-甲基哌嗪-1-基)丁-2烯酰氯(92mg,0.458mmol)和三乙胺(61.6mg,0.61mmol)，在0℃下反應(yīng)約2小時后，減壓旋干溶劑，粗產(chǎn)物經(jīng)柱層析精制，得到白色固體(71mg,70％)。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ2.15(3H,s),2.35(8H,s),2.55-2.71(2H,m),2.77(3H,d,J＝4.8Hz),3.10(2H,d,J＝5.8Hz),3.75(2H,dd,J＝14.8,8.5Hz),4.50(2H,d,J＝31.4Hz),6.65(2H,dd,J＝17.2,9.4Hz),6.92(1H,d,J＝6.2Hz),8.11(1H,s).
ESI-MS m/z:331.2[M+H]+.
實施例6
1-(2-(乙基氨基)-5,8-二氫吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-基)丙-2-烯-1-酮的制備(A-6)
步驟1)至步驟3)同實施例1；
步驟4)2-乙基氨基-5,8-二氫吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-甲酸叔丁酯的制備
將2-(甲基磺酰基)-5,8-二氫吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-甲酸叔丁酯(500mg,1.6mmol)和乙胺的甲醇溶液(2mol/L,4mL,8mmol)在攪拌下依次溶于乙醇中，加熱回流，反應(yīng)12小時后，冷卻至室溫。減壓旋干溶劑，粗產(chǎn)物經(jīng)柱層析精制，得白色固體(200mg,45％)。
ESI-MS m/z:279.1[M+H]+.
步驟5)N-乙基-5,6,7,8-四氫吡啶并[3,4-d]嘧啶-2-胺的制備
將2-(乙基氨基)-5,8-二氫吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-甲酸叔丁酯(200mg,0.72mmol)溶于少量二氯甲烷中，加入氯化氫的乙酸乙酯溶液(3mL)常溫攪拌約3小時，減壓旋干溶劑，溶質(zhì)加入到飽和碳酸氫鈉水溶液(5mL)和二氯甲烷(20mL)中，有機相用飽和食鹽水(10mL)洗滌，無水硫酸鈉干燥過濾后，旋干得到白色固體(115mg,90％)。
ESI-MS m/z:179.1[M+H]+.
步驟6)1-(2-(乙基氨基)-5,8-二氫吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-基)丙-2-烯-1-酮的制備
將N-乙基-5,6,7,8-四氫吡啶并[3,4-d]嘧啶-2-胺(71mg，0.4mmol)溶于二氯甲烷(4mL)中。在0℃下依次加入丙烯酰氯(54mg,0.6mmol)和三乙胺(81mg,0.8mmol)，在0℃下反應(yīng)約2小時后，減壓旋干溶劑，粗產(chǎn)物經(jīng)柱層析精制，得到白色固體(65mg,70％)。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ1.09(3H,t,J＝7.1Hz),2.54-2.65(2H,m),3.20-3.30(2H,m),3.62-3.88(2H,m),4.51(2H,d,J＝30.2Hz),5.59-5.88(1H,m),5.96-6.25(1H,m),6.93(2H,dd,J＝36.7,8.5Hz),8.10(1H,s).ESI-MS m/z:233.1[M+H]+.
實施例7
1-(2-(異丙基氨基)-5,8-二氫吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-基)丙-2-烯-1-酮的制備(A-7)
步驟1)至步驟3)同實施例1
步驟4)2-異丙基氨基-5,8-二氫吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-甲酸叔丁酯的制備
將2-(甲基磺酰基)-5,8-二氫吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-甲酸叔丁酯(500mg,1.6mmol)和異丙胺(188mg,3.2mmol)在攪拌下依次溶于乙醇中，加熱回流，反應(yīng)12小時后，冷卻至室溫。減壓旋干溶劑，粗產(chǎn)物經(jīng)柱層析精制，得白色固體(280mg,60％)。
ESI-MS m/z:293.1[M+H]+.
步驟5)N-異丙基-5,6,7,8-四氫吡啶并[3,4-d]嘧啶-2-胺的制備
將2-(異丙基氨基)-5,8-二氫吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-甲酸叔丁酯(280mg,0.96mmol)溶于少量二氯甲烷中，加入氯化氫的乙酸乙酯溶液(3mL)常溫攪拌約3小時，減壓旋干溶劑，溶質(zhì)加入到飽和碳酸氫鈉水溶液(5mL)和二氯甲烷(20mL)中，有機相用飽和食鹽水(10mL)洗滌，無水硫酸鈉干燥過濾后，旋干得到白色固體(165mg,90％)。
ESI-MS m/z:193.1[M+H]+.
步驟6)1-(2-(異丙基氨基)-5,8-二氫吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-基)丙-2-烯-1-酮的制備
將N-異丙基-5,6,7,8-四氫吡啶并[3,4-d]嘧啶-2-胺(77mg,0.4mmol)溶于二氯甲烷(4mL)中。在0℃下依次加入丙烯酰氯(54mg,0.6mmol)和三乙胺(81mg,0.8mmol)，在0℃下反應(yīng)約2小時后，減壓旋干溶劑，粗產(chǎn)物經(jīng)柱層析精制，得到白色固體(69mg,70％)。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ1.12(6H,d,J＝6.6Hz),2.62(2H,s),3.76(2H,d,J＝18.7Hz),3.93-4.07(1H,m),4.50(2H,d,J＝28.5Hz),5.73(1H,d,J＝9.7Hz),6.15(1H,d,J＝16.6Hz),6.89(2H,dd,J＝27.3,16.0Hz),8.10(1H,s).ESI-MS m/z:247.2[M+H]+.
實施例8
1-(2-(環(huán)丙基氨基)-5,8-二氫吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-基)丙-2-烯-1-酮的制備(A-8)
步驟1)至步驟3)同實施例1
步驟4)2-環(huán)丙基氨基-5,8-二氫吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-甲酸叔丁酯的制備
將2-(甲基磺酰基)-5,8-二氫吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-甲酸叔丁酯(500mg，1.6mmol)和環(huán)丙胺(146mg,2.56mmol)在攪拌下依次溶于乙醇(10mL)中，加熱回流，反應(yīng)12小時后，冷卻至室溫。減壓旋干溶劑，粗產(chǎn)物經(jīng)柱層析精制，得白色固體(232mg,50％)。
ESI-MS m/z:291.1[M+H]+.
步驟5)N-環(huán)丙基-5,6,7,8-四氫吡啶并[3,4-d]嘧啶-2-胺的制備
將2-(環(huán)丙基氨基)-5,8-二氫吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-甲酸叔丁酯(232mg，0.8mmol)溶于少量二氯甲烷中，加入氯化氫的乙酸乙酯溶液(3mL)常溫攪拌約3小時，減壓旋干溶劑，溶質(zhì)加入到飽和碳酸氫鈉水溶液(5mL)和二氯甲烷(20mL)中，有機相用飽和食鹽水(10mL)洗滌，無水硫酸鈉干燥過濾后，旋干得到白色固體(137mg,90％)。
ESI-MS m/z:191.1[M+H]+.
步驟6)1-(2-(環(huán)丙基氨基)-5,8-二氫吡啶并[3,4-d]嘧啶-7(6H)-基)丙-2-烯-1-酮的制備
將N-環(huán)丙基-5,6,7,8-四氫吡啶并[3,4-d]嘧啶-2-胺(76mg，0.4mmol)溶于二氯甲烷(4mL)中。在0℃下依次加入丙烯酰氯(54mg,0.6mmol)和三乙胺(81mg,0.8mmol)，在0℃下反應(yīng)約2小時后，減壓旋干溶劑，粗產(chǎn)物經(jīng)柱層析精制，得到白色固體(68mg,70％)。1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ0.38-0.48(2H,m),0.55-0.69(2H,m),2.56-2.71(3H,m),3.69-3.86(2H,m),4.53(2H,d,J＝29.8Hz),5.68-5.78(1H,m),6.08-6.19(1H,m),6.82-6.97(1H,m),7.25(1H,d,J＝10.1Hz),8.10-8.17(1H,m).ESI-MS m/z:245.1[M+H]+.
體外生物學(xué)評價
試劑配制：
EDTA(0.5M；pH8.0)溶液配制：準(zhǔn)確稱量14.612g EDTA粉末，加入95mL超純水，用NaOH溶液調(diào)pH至8.0，加入5mL超純水。
10X酶促反應(yīng)緩沖液：分別將10mL HEPES溶液(1M)、76.1mg EGTA、2mL MgCl2、0.4mL DTT、20μL Tween-20、37.6mL超純水溶解混勻，調(diào)pH到7.5。
4X終止液(40mM)：將0.8mL上述EDTA溶液、1mL 10X檢測緩沖液及8.2mL超純水混勻。
1X酶促反應(yīng)緩沖液：取1mL 10X酶促反應(yīng)緩沖液加入9mL水混勻。
1X檢測緩沖液：取1mL 10X檢測緩沖液加入9mL水混勻。
4X JAK3激酶溶液(0.25nM)：取1μL JAK3激酶加入13μL 1X酶促反應(yīng)緩沖液混勻，取4μL初步稀釋的JAK3激酶加入1276μL 1X酶促反應(yīng)緩沖液混勻。
4X ULight-JAK-1(Tyr1023)peptide溶液(400nM)：取52μL ULight-JAK-1(Tyr1023)peptide溶液加入608μL 1X酶促反應(yīng)緩沖液混勻。
4X ATP溶液(40μM,250倍稀釋)：取3μL ATP母液加入747μL 1X酶促反應(yīng)緩沖液混勻。
4X抗體檢測溶液(8nM,390.6倍稀釋)：取4μL Europium-anti-phospho-tyrosine antibody(PT66)加入1560μL 1X檢測緩沖液混勻。
2X底物/ATP混合溶液：650μL 4X ULight-JAK-1(Tyr1023)peptide溶液和650μl 4X ATP溶液混勻(使用前配制)。
實驗步驟：
本實驗使用的藥物最大濃度為100000nM，經(jīng)4倍梯度稀釋后共12個濃度，最低濃度為0.02384nM。
步驟1)化合物的梯度稀釋(4倍梯度稀釋，1)和2)步驟均以一種化合物的稀釋為例，其他化合物的稀釋類推)：取96孔板，在第A1孔加入18μL 100％DMSO A2-F2中孔中加入15μL100％DMSO。在A1孔中加入2μL溶于100％DMSO的化合物溶液(10mM)混勻，取5μL到A2孔反復(fù)混勻，A2孔取5μL到B1孔反復(fù)混勻，B1孔取5μL到B2孔反復(fù)混勻，……直到F2孔反復(fù)混勻。從F2孔吸取5μL棄去。
步驟2)用水進一步稀釋溶于DMSO中的藥物(至DMSO終濃度為5％)：在96孔板A3-F3、A4-F4中加入95μL水，用排槍從A1-F1、A2-F2中移5μl對應(yīng)加入到A3-F3、A4-F4列，充分混勻。用排槍將A3-F3孔和A4-E4孔交叉轉(zhuǎn)移2.5μL到384孔板A1-L1中，另做一個平行，分別在A2-L2中。交叉轉(zhuǎn)移的方法如圖1所示。
步驟3)加酶：在8聯(lián)排管A-G中每孔加入90μL的2X JAK3激酶溶液，用排槍取2.5μL加入到384孔板相應(yīng)的反應(yīng)孔中?；靹蚴覝仡A(yù)反應(yīng)10分鐘。
步驟4)加2X底物/ATP混合溶液:在8聯(lián)排管A-G中每孔加入180μL的2X混合溶液，用排槍取5μL加入到384孔板相應(yīng)的反應(yīng)孔中。
步驟5)陰性對照：在384孔板孔加入5μL/孔2X底物/ATP混合溶液和5μL 1X酶促反應(yīng)緩沖液。
步驟6)陽性對照：在384孔板中加入5μL/孔2X底物/ATP混合溶液，2.5μL/孔含4％DMSO的1X酶促反應(yīng)緩沖液，2.5μL/孔2X JAK3激酶溶液。
步驟7)離心混勻，避光室溫反應(yīng)60分鐘。
步驟8)終止酶促反應(yīng)：在8聯(lián)排管A-G中每孔加入190μL的4X終止液終止酶促反應(yīng)，用排槍取5μL加入到384孔板中孔中，離心混勻，室溫反應(yīng)5分鐘。
步驟9)顯色反應(yīng)：在8聯(lián)排管A-G中每孔加入190μL的4X抗體檢測溶液進行顯色，用排槍取5μL加入到384孔板中孔中，離心混勻，室溫反應(yīng)60分鐘。
步驟10)將384孔板放入讀板儀，調(diào)取相應(yīng)的程序檢測信號。
步驟11)IC50分析：
抑制率＝1-(實驗孔讀值-陰性對照孔讀值)/(陽性對照孔讀值-陰性對照孔讀值)
將藥物濃度和相應(yīng)抑制率輸入GraphPad Prism 5處理可計算出相應(yīng)的IC50。表1代表本發(fā)明化合物對JAK3激酶的抑制活性數(shù)據(jù)，使用A，B，C表示不同活性區(qū)間：A表示IC50小于或等于1μM；B表示IC50大于1μM但小于10μM；C表示IC50大于10μM。
表1：本發(fā)明代表性化合物抑制JAK3的酶學(xué)數(shù)據(jù)
關(guān)于化合物
本發(fā)明的化合物可以以游離的形式用于治療，或者在適當(dāng)情況下存在，作為其藥學(xué)上可接受的鹽或其它衍生物。如本文所用，術(shù)語“藥學(xué)上可接受的鹽”是指那些鹽，其在合理的醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)，適用于與人類和低等動物而沒有過度毒性、刺激性、過敏反應(yīng)及類似的組織接觸等，與合理的利益/風(fēng)險比相稱。胺，羧酸，膦酸鹽，和其它類型的化合物的藥學(xué)上可接受的鹽，在本領(lǐng)域中是眾所周知的。該鹽可以在本發(fā)明中化合物的分離和純化制成，或單獨的使本發(fā)明的化合物與合適的游離堿或酸反應(yīng)而成。藥學(xué)上可接受的實施例如，無毒的酸加成鹽是與無機酸如鹽酸、氫溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸或與有機酸如乙酸、草酸、馬來酸形成的氨基鹽、酒石酸、檸檬酸、琥珀酸或丙二酸或通過使用本領(lǐng)域，例如離子交換所用的其他方法。其他藥學(xué)上可接受的鹽包括己二酸鹽、藻酸鹽、抗壞血酸鹽、天冬氨酸鹽、苯磺酸鹽、苯甲酸鹽、硫酸氫鹽、硼酸鹽、丁酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、檸檬酸鹽、環(huán)戊烷、二葡糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙磺酸鹽、甲酸鹽、富馬酸鹽、葡庚糖酸鹽、甘油磷酸鹽、葡萄糖酸鹽、半硫酸鹽、庚、己酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基乙磺酸鹽、乳糖酸鹽、乳酸鹽、月桂酸鹽、月桂基硫酸鹽、蘋果酸鹽、馬來酸鹽、丙二酸鹽、甲烷磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、煙酸鹽、硝酸鹽、油酸鹽、草酸鹽、棕櫚酸鹽、雙羥萘酸鹽、果膠酸鹽、過硫酸鹽、過3-苯基丙酸鹽、磷酸鹽、苦味酸鹽、新戊酸鹽、丙酸鹽、硬脂酸鹽、琥珀酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、對甲苯磺酸鹽、十一烷酸鹽、戊酸鹽等。代表性的堿或堿土金屬鹽包括鈉、鋰、鉀、鈣、鎂、等。其他藥學(xué)上可接受的鹽包括，適當(dāng)?shù)臒o毒的銨、季銨，和使用諸如鹵離子、氫氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根，低級烷基磺酸鹽和芳基磺酸鹽形成的胺基陽離子。
組合物
本發(fā)明的組合物包含本發(fā)明的化合物與藥學(xué)上可接受的載體，一些藥學(xué)上可接受的載體材料的實例包括，但不限于，糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；纖維素及其衍生物如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和醋酸纖維素；西黃蓍膠粉；麥芽；明膠；滑石粉；賦形劑，例如可可脂和栓劑蠟；油如花生油、棉籽油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和大豆油；乙二醇，例如丙二醇；酯類如油酸乙酯和月桂酸乙酯、瓊脂；緩沖劑例如氫氧化鎂和氫氧化鋁；藻酸；無熱原水；等滲鹽水；林格氏溶液；乙醇，和磷酸鹽緩沖溶液，以及其它無毒的相容性潤滑劑如月桂基硫酸鈉和硬脂酸鎂、以及著色劑、釋放劑、包衣劑、甜味劑、調(diào)味劑和芳香劑、防腐劑和抗氧化劑也可以可存在于組合物中。