本發(fā)明涉及一種快速檢測(cè)次氯酸的熒光探針及其制備方法和在光譜測(cè)試、細(xì)胞成像中的應(yīng)用，屬于有機(jī)小分子熒光探針領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

活性氧(ROS)是生物體內(nèi)在很多生理和病理過(guò)程起著非常重要作用的一些含氧自由基(羥基自由基和超氧陰離子自由基等)和非自由基(次氯酸和次氯酸等)的總稱。生物體內(nèi)在氧化應(yīng)激、炎癥等生理和病理情況下通過(guò)酶促和非酶促反應(yīng)產(chǎn)生各種ROS。近代的生物醫(yī)學(xué)研究表明，體內(nèi)產(chǎn)生的ROS與一些疾病的發(fā)生、發(fā)展和機(jī)體的老化有著密切的關(guān)系。

次氯酸(HClO)屬于活性氧的一種，作為一種高效的殺菌劑，在生命的免疫系統(tǒng)中起到重要的作用。細(xì)胞內(nèi)源性的次氯酸主要由白細(xì)胞(如單核細(xì)胞，嗜酸性細(xì)胞，嗜中性粒細(xì)胞等)中的髓過(guò)氧化物酶/雙氧水/氯離子系統(tǒng)來(lái)產(chǎn)生。細(xì)胞免疫反應(yīng)產(chǎn)生的次氯酸，但是一旦細(xì)胞中次氯酸的濃度發(fā)生異常，就會(huì)引起包括風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、心血管疾病和癌癥在內(nèi)的多種疾病。正是因?yàn)榇温人峋哂腥绱酥匾纳砗筒±韺W(xué)意義，對(duì)次氯酸的檢測(cè)引起了人們的廣泛重視。

可用于選擇性檢測(cè)次氯酸/次氯酸鹽的方法有很多，如碘量滴定法、比色法、化學(xué)發(fā)光法、庫(kù)侖法、極譜法和輻解法等。然而，這些方法往往比較繁瑣，一些工作必須在有機(jī)介質(zhì)或有機(jī)/水介質(zhì)中進(jìn)行，限制其應(yīng)用。與上述方法相比，熒光探針被認(rèn)為是生物研究理想的手段，因?yàn)闊晒鈾z測(cè)所需的儀器相對(duì)簡(jiǎn)單，選擇性和靈敏度高，檢測(cè)范圍廣，響應(yīng)時(shí)間快速，而且檢測(cè)過(guò)程對(duì)樣品沒(méi)有破壞，對(duì)細(xì)胞危害也很小，熒光檢測(cè)結(jié)合顯微鏡可以提供實(shí)時(shí)結(jié)果。

一個(gè)具有應(yīng)用前景的熒光探針應(yīng)具有作用前后熒光變化明顯、對(duì)目標(biāo)分子響應(yīng)快、選擇性好、合成簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。一般來(lái)說(shuō)，熒光探針由兩部分組成：一部分是熒光信號(hào)基團(tuán)，另一部分是識(shí)別基團(tuán)，次氯酸的識(shí)別位點(diǎn)有硫醚鍵、羥胺、苯胺基等。當(dāng)探針識(shí)別目標(biāo)，化學(xué)反應(yīng)可以被轉(zhuǎn)換成一個(gè)光譜信號(hào)。近年來(lái)，有較多檢測(cè)活細(xì)胞中次氯酸熒光探針的報(bào)道，然而存在原料不易得、合成步驟及操作復(fù)雜，抗干擾性差，識(shí)別位點(diǎn)單一等多方面的問(wèn)題。因此，發(fā)展新的識(shí)別位點(diǎn)應(yīng)用于次氯酸的檢測(cè)尤為重要，從而為研究細(xì)胞病變過(guò)程中次氯酸濃度變化情況提供可視化的檢測(cè)工具。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)目前次氯酸分子熒光探針檢測(cè)所面臨的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種能夠抗干擾、快速響應(yīng)、具有新識(shí)別位點(diǎn)的次氯酸熒光探針及其制備方法。

本發(fā)明另一目的為提供該熒光探針在檢測(cè)水溶液中或生物細(xì)胞內(nèi)次氯酸分子的應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案。

一種檢測(cè)次氯酸的熒光探針，具有如下式(Ⅰ)所示的結(jié)構(gòu)：

所述的熒光探針的合成路線如下：

所述的熒光探針的制備方法，包括以下步驟：

(1)將吩噻嗪溶入N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，在0℃中緩慢加入氫化鈉，攪拌，在室溫下加入碘乙烷，攪拌4-8小時(shí)，抽濾得到白色沉淀，即N-乙基吩噻嗪；

(2)在0℃下將三氯氧磷緩慢加入干燥的DMF，轉(zhuǎn)移到室溫反應(yīng)2小時(shí)，得DMF溶液；將步驟(1)中產(chǎn)物N-乙基吩噻嗪溶解在二氯乙烷中，加入上述DMF溶液中，反應(yīng)1小時(shí)后，升溫至80-100℃，繼續(xù)回流反應(yīng)12-18小時(shí)；反應(yīng)液用二氯甲烷萃取，無(wú)水硫酸鈉干燥后，柱層析分離得到N-乙基吩噻嗪-2-甲醛；

(3)將N-乙基吩噻嗪-2-甲醛、2-巰基苯胺和焦亞硫酸鈉加入含有DMF的反應(yīng)瓶中，于氮?dú)夥諊录訜峄亓?，反?yīng)至點(diǎn)板檢測(cè)原料消失，萃取，濃縮，柱層析分離得到次氯酸熒光探針。

上述熒光探針的合成方法中，步驟(1)中吩噻嗪：碘乙烷的摩爾比為2:2-3；步驟(3)中N-乙基吩噻嗪-2-甲醛：2-羥基苯胺的摩爾比為2:2-3。

上述熒光探針的合成方法中，步驟(2)中回流溫度為80-100℃。

所述熒光探針應(yīng)用于檢測(cè)次氯酸時(shí)，熒光探針本身無(wú)熒光或熒光很弱，其與次氯酸反應(yīng)后，生成具有式(II)的化合物，使熒光發(fā)生改變，用于定性檢測(cè)次氯酸。檢測(cè)次氯酸溶液時(shí)，激發(fā)波長(zhǎng)為360nm，隨著次氯酸含量的逐漸增加，其在440nm處的熒光峰值逐漸增強(qiáng)；檢測(cè)細(xì)胞中次氯酸時(shí)，激發(fā)波長(zhǎng)為405nm，在440nm處有熒光峰值。在一定濃度范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度與次氯酸濃度呈線性正相關(guān)，從而實(shí)現(xiàn)定量測(cè)定次氯酸的濃度。該熒光探針可以應(yīng)用于水溶液或生物體系中次氯酸的傳感檢測(cè)；所述的傳感檢測(cè)包含熒光檢測(cè)和細(xì)胞成像。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：探針的各合成步驟簡(jiǎn)單，產(chǎn)物提純簡(jiǎn)單；對(duì)次氯酸反應(yīng)的專(zhuān)一性強(qiáng)，抗多種干擾物，實(shí)現(xiàn)了次氯酸分子探針的快速檢測(cè)，靈敏度高，檢測(cè)限低，線性范圍廣?；诒景l(fā)明中次氯酸探針的特異性和顯著的顏色變化，其可作為顯示水溶液中和生物細(xì)胞內(nèi)次氯酸分子存在的專(zhuān)一性指示劑，可進(jìn)行實(shí)時(shí)定性檢測(cè)和含量傳感檢測(cè)。故而，本發(fā)明是一種簡(jiǎn)單，快速，靈敏的次氯酸分子特異性檢測(cè)試劑，在生物分子檢測(cè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1是實(shí)施例一中探針NS-ClO的¹H NMR圖譜；

圖2是探針NS-ClO熒光強(qiáng)度隨HCLO濃度的變化；

圖3是探針NS-ClO熒光強(qiáng)度與HCLO濃度的關(guān)系；

圖4是探針NS-ClO熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化；

圖5是探針NS-ClO選擇性柱狀圖；

圖6是探針NS-ClO應(yīng)用于細(xì)胞中外源性HClO的熒光成像；

圖7是探針NS-ClO應(yīng)用于細(xì)胞中內(nèi)源性HClO的熒光成像。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明不受下述實(shí)施例的限制，

實(shí)施例中化合物的號(hào)碼對(duì)應(yīng)上述方案中化合物的號(hào)碼。

實(shí)施例1熒光探針NS-ClO的合成。

(1)將化合物1(0.1mmol，201.287mg)溶入2mL DMF中，在0℃中緩慢加入氫化鈉(0.15mmol，35.6mg)，攪拌30min后，在室溫下加入碘乙烷(0.15mmol，223.95mg)，攪拌6小時(shí)，抽濾得到白色沉淀，即化合物2。

(2)將三氯氧磷(2mmol，300mg)在0℃，緩慢加入1mL干燥的DMF中，轉(zhuǎn)移到室溫反應(yīng)2小時(shí)。將化合物2(1mmol，229mg)溶解在1mL的二氯乙烷中，加入上述DMF溶液中，反應(yīng)1小時(shí)后，升溫至90℃，反應(yīng)16小時(shí)。反應(yīng)液用二氯甲烷萃取，無(wú)水硫酸鈉干燥后，柱層析提純，得到化合物3。

(3)將化合物3(2mmol，510mg)、2-巰基苯胺(2mmol，340mg)和焦亞硫酸鈉(2mmol，380mg)加入含有15mL DMF的反應(yīng)瓶中，于氮?dú)夥諊略诩訜峄亓?h后，點(diǎn)板檢測(cè)反應(yīng)至原料消失，萃取，濃縮，柱層析分離得到探針NS-ClO。產(chǎn)率60％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.05(d,J＝8.1Hz,1H),7.92-7.84(m,1H),7.82(d,J＝2.1Hz,1H),7.51-7.44(m,1H),7.40-7.33(m,1H),7.19-7.10(m,1H),6.97-6.86(m,1H),3.97(q,J＝7.0Hz,1H),1.45(t,J＝7.0Hz,1H)。

實(shí)施例2熒光探針NS-ClO熒光強(qiáng)度與HClO濃度的關(guān)系。

取實(shí)施例1制備的熒光探針NS-ClO溶于DMF中，制成1mmol/L儲(chǔ)備液。在含有5％DMF的磷酸鹽緩沖溶液(PBS溶液)(0.1mol/L，pH＝7.5)中加入15μL儲(chǔ)備液，加入不同濃度(0-2×10^-4μM，即0-20equiv)的NaClO標(biāo)準(zhǔn)溶液(NaClO在中性條件下水溶液中即自發(fā)產(chǎn)生酸堿平衡移動(dòng)而產(chǎn)生HClO，下同)，終體積為3mL，測(cè)量其熒光性質(zhì)(λex＝360nm，光柵寬度為5nm，5nm)，熒光光譜如圖2所示，橫坐標(biāo)為波長(zhǎng)，縱坐標(biāo)為相對(duì)熒光強(qiáng)度。根據(jù)NS-ClO熒光強(qiáng)度隨HCLO濃度的變化，以HCLO濃度為橫坐標(biāo)，以熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖，如圖3所示。由圖3可知，隨著HClO濃度的增加熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，且在0-1×10^-4μM濃度范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度與HClO濃度呈線性正相關(guān)。

實(shí)施例3熒光探針NS-ClO的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化。

從實(shí)施例2中熒光探針儲(chǔ)備液中取出15μL加入含有5％DMF的PBS溶液(0.1mol/L，pH＝7.5)中，加入NaClO(2×10^-4μM)標(biāo)準(zhǔn)溶液最終體積為3mL，于0-8min每隔1min分別測(cè)量其熒光性質(zhì)，檢測(cè)條件如實(shí)施例2。熒光光譜如圖4所示，橫坐標(biāo)為波長(zhǎng)，縱坐標(biāo)為相對(duì)熒光強(qiáng)度。由圖4可見(jiàn)，加入探針NS-ClO后，直接加入上述NaClO溶液，隨時(shí)間在反應(yīng)1分鐘后熒光強(qiáng)度增加迅速達(dá)到最大，且熒光強(qiáng)度保持穩(wěn)定在8分鐘以上，實(shí)現(xiàn)了HClO的快速檢測(cè)。

實(shí)施例4熒光探針NS-ClO對(duì)不同離子的選擇性。

從實(shí)施例2中熒光探針儲(chǔ)備液中取出30μL加入到5mL離心管當(dāng)中，分別加入等摩爾量的干擾物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液：谷胱甘肽，L-半胱氨酸，血同型半胱氨酸，氟離子，氯離子，溴離子，羥自由基，過(guò)氧亞硝酸離子，過(guò)氧化二叔丁基，叔丁基過(guò)氧化氫，一氧化氮，過(guò)氧化氫，亞硝酸根，鈷離子，銅離子，鎳離子，其中一個(gè)加入等摩爾量的NaClO標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)試體系溶液體積為3mL，20min后檢測(cè)溶液的熒光發(fā)射光譜變化，如圖4所示，其中：1-無(wú)添加，2-GSH，3-Cys，4-Hcy，5-F^-，6-Cl^-，7-Br^-，8-·OH，9-ONOO^-，10-DTBP，11-TBHP，12-NO，13-H₂O₂，14-NO₂^-，15-Co⁺，16-Cu²⁺，17-Ni⁺，18-ClO^-，縱坐標(biāo)為相對(duì)熒光強(qiáng)度。由圖5可以發(fā)現(xiàn)，其他干擾物質(zhì)對(duì)探針NS-ClO的熒光幾乎沒(méi)有影響，而HClO溶液的加入使探針NS-ClO的熒光顯著增強(qiáng)。

實(shí)施例5熒光探針NS-ClO對(duì)細(xì)胞中外源性HClO熒光成像。

將熒光探針NS-ClO應(yīng)用于HeLa細(xì)胞中HClO的檢測(cè)，進(jìn)行熒光成像，如圖6所示，說(shuō)明此熒光探針能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞中外源性HClO的檢測(cè)。具體操作步驟如下：

a)將20μM探針DMF溶液加入到育有HeLa細(xì)胞的培養(yǎng)液中在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0.5h，明場(chǎng)成像，如圖a)，可以看到細(xì)胞大致的輪廓；

b)將a)中細(xì)胞用405nm激光激發(fā)，得到成像圖b)；

c)將圖a)和圖b)疊加，得圖像c)；

d)將20μM探針DMF溶液加入到育有HeLa細(xì)胞的培養(yǎng)液中在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0.5h，加入HClO后，明場(chǎng)成像，如圖d)，可以看到細(xì)胞大致的輪廓；

e)將d)中細(xì)胞用405nm激光激發(fā)得到成像圖e)；

f)將圖d)和圖e)疊加，得圖像f)。

實(shí)施例6熒光探針NS-ClO對(duì)細(xì)胞內(nèi)源性HClO的細(xì)胞成像。

將熒光探針NS-ClO應(yīng)用于Raw 264.7細(xì)胞中對(duì)內(nèi)源性的HClO進(jìn)行熒光成像，如圖7所示，說(shuō)明此熒光探針可以對(duì)細(xì)胞中內(nèi)源性的HClO進(jìn)行熒光成像。具體操作步驟如下：

a)將20μM探針DMF溶液加入到育有Raw 264.7細(xì)胞的培養(yǎng)液中在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0.5h，明場(chǎng)成像，如圖a)，可以看到細(xì)胞大致的輪廓；

b)將a)中細(xì)胞用405nm激光激發(fā)得到成像圖，得到成像圖b)；

c)將圖a)和圖b)疊加，得圖像c)；

d)先將Raw 264.7細(xì)胞加入LPS(2μg/mL)和PMA(2μg/mL)孵育2h，再將10μM探針DMF溶液加入到細(xì)胞的培養(yǎng)液中，在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0.5h后得到的明場(chǎng)成像，得到成像圖d)，可以看到細(xì)胞大致的輪廓；

e)將d)中細(xì)胞用405nm激光激發(fā)得到成像圖e)；

f)將圖d)和圖e)疊加，得圖像f)。